一種基于點擊化學(xué)的腫瘤標(biāo)記探針、制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子影像應(yīng)用領(lǐng)域，涉及近紅外分子影像技術(shù)中基于點擊化學(xué)的腫瘤 標(biāo)記探針、制備方法及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 分子影像技術(shù)在細(xì)胞分子水平上實現(xiàn)在體生理、病理的實時、無創(chuàng)、動態(tài)成像，可 用于研究活體內(nèi)疾病或腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等過程，其中近紅外熒光分子影像具有無 輻射、靈敏高、生物組織光損傷小等優(yōu)點，在腫瘤在體監(jiān)測研究領(lǐng)域中展現(xiàn)出巨大的潛力。 近紅外熒光探針實現(xiàn)了目標(biāo)組織的可視化示蹤檢測，是活體內(nèi)光學(xué)分子影像成功的先決條 件。一般熒光探針利用病變基因、分子、組織等特異性因子(如核酸、多肽、蛋白質(zhì)、抗體等） 與熒光物相偶聯(lián)，使得熒光探針具有了特異靶向識別的功能，再將具有特異性功能的熒光 探針注射入活體體內(nèi)，從而實現(xiàn)腫瘤的在體靶向監(jiān)測。但是這種將染料與腫瘤特異分子直 接偶聯(lián)的方法由于染料與特異性因子相互之間的干擾，一般存在特異性差的問題。
[0003] 點擊化學(xué)（ClickChemistry)屬于正交反應(yīng)的一種（BioorthogonalChemistry)， 通過高效、高選擇性的化學(xué)反應(yīng)來完成模塊化的骨架連接，直接點擊模塊構(gòu)建各類新化合 物的組合化學(xué)新方法，具有如下幾個特征：（1)符合綠色化學(xué)，原料易得、產(chǎn)率高、立體選擇 性好、易純化、副產(chǎn)物對環(huán)境友好；（2)反應(yīng)快速、高通量模塊化合成，例如無銅點擊化學(xué)-四 嗪和環(huán)辛烯衍生物的反應(yīng)速率常數(shù)大約為210-2,800,0001^84(?83,37°〇;(3)反應(yīng)條件 溫和，對水、溫度、氧不敏感，可以在生理條件下進行；（4)其反應(yīng)模塊幾乎不與生物分子反 應(yīng)，不干擾細(xì)胞正常的生理功能。因此，點擊化學(xué)能成為生物化學(xué)和藥物研究等領(lǐng)域的研究 熱點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 針對現(xiàn)有技術(shù)不足，本發(fā)明旨在提供一種基于點擊化學(xué)的腫瘤標(biāo)記探針、制備方 法及其應(yīng)用，腫瘤標(biāo)記探針包括分別帶有腫瘤特異性因子和熒光標(biāo)記的點擊反應(yīng)模塊，應(yīng) 用時將特異因子預(yù)靶向腫瘤組織后，利用點擊化學(xué)高選擇性、高效、快速的反應(yīng)特點，再標(biāo) 記熒光物質(zhì)，避免熒光物質(zhì)與特異因子之間的相互干擾，解決現(xiàn)有腫瘤標(biāo)記探針或方法特 異性差的問題，并有效降低肝腎等對探針或藥物的代謝清除，從而提高探針的生物利用度 和監(jiān)測靈敏度。
[0005]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0000] -種基于點擊化學(xué)的腫瘤標(biāo)記探針，包括腫瘤特異因子點擊反應(yīng)模塊TC0-TL以及 熒光標(biāo)記點擊反應(yīng)模塊Tz-FL，兩個模塊可通過點擊化學(xué)反應(yīng)快速結(jié)合;TC0-TL和Tz-FL的 結(jié)構(gòu)式如下：

[0009]其中，TC0為含環(huán)辛烯基團類化合物，TL為腫瘤特異性因子;Tz為含四嗪基團類化 合物，F(xiàn)L為熒光標(biāo)記物；
[0010] TC0-TL和Tz-FL通過點擊化學(xué)反應(yīng)結(jié)合后的結(jié)構(gòu)式如下：
[0012]需要說明的是，熒光標(biāo)記物FL可選自花菁染料、羅丹明染料、熒光素染料或量子 點。
[0013]需要說明的是，腫瘤特異性因子TL可選自核酸、多肽、蛋白、酶、糖類、抗體、單克隆 抗體、雙特異性抗體或多特異性抗體。
[0014] 作為優(yōu)選，所述Tz為(芐胺-4-基)-3-四嗪。
[0015]作為優(yōu)選，所述TC0為5-琥珀酰亞胺酯環(huán)辛烯。
[0016]上述基于點擊化學(xué)的腫瘤標(biāo)記探針的制備方法，包括步驟:利用腫瘤特異性因子 TL的氨基基團和含環(huán)辛烯基團類化合物TC0的活化羧基反應(yīng)，得到腫瘤特異因子點擊反應(yīng) 模塊TC0-TL，利用含四嗪基團類化合物Tz的氨基基團和熒光標(biāo)記物FL的活化羧基反應(yīng)，得 到熒光標(biāo)記點擊反應(yīng)模塊Tz-FL。
[0017]需要說明的是，利用腫瘤特異性因子TL的氨基基團和含環(huán)辛烯基團類化合物TC0 的活化羧基反應(yīng)，得到腫瘤特異因子點擊反應(yīng)模塊TC0-TL的具體方法為：
[0018] 將TC0-NHS溶于DMS0中，加入溶于TL肽的DMS0溶液，再加入TEA，室溫避光攪拌過夜 反應(yīng)，然后用乙醚與乙酸乙酯析出產(chǎn)物的方法純化分離得到粉末狀固體TC0-TL，真空干燥， 低溫保存。
[0019] 需要說明的是，含四嗪基團類化合物Tz的氨基基團和熒光物質(zhì)FL的活化羧基反 應(yīng)，得到熒光標(biāo)記點擊反應(yīng)模塊Tz-FL的方法如下：
[0020] 取FL，加入DIC和NHS，反應(yīng)溶劑選用DMS0，于室溫條件下避光攪拌，反相TLC監(jiān)測； 反應(yīng)結(jié)束后，用乙醚與乙酸乙酯析出產(chǎn)物的方法純化分離得到固體，真空干燥，得到產(chǎn)物 FL-NHS;然后取FL-NHS溶于DMS0中，加入溶解有Tz的DMS0溶液，再加入TEA，室溫避光攪拌過 夜，反應(yīng)結(jié)束后，用乙醚與乙酸乙酯混合洗滌的方法純化分離得到Tz-FL固體，真空干燥，低 溫保存。
[0021] 上述基于點擊化學(xué)的腫瘤標(biāo)記探針可在腫瘤活體光學(xué)分子影像及活細(xì)胞成像進 行應(yīng)用。
[0022]需要說明的是，應(yīng)用包括如下步驟:先將腫瘤特異因子點擊反應(yīng)模塊TC0-TL提前 注射入活體體內(nèi)或體外活細(xì)胞中，讓革G分子充分革E1向目標(biāo)組織或細(xì)胞，再將熒光標(biāo)記點擊 反應(yīng)模塊Tz-FL注射入活體體內(nèi)或體外活細(xì)胞中，利用TC0和Tz之間的點擊化學(xué)反應(yīng)，從而 使熒光物質(zhì)快速偶聯(lián)于腫瘤特異性因子上，然后利用成像技術(shù)進行成像。
[0023]本發(fā)明的有益效果在于:提供了一種包括帶腫瘤特異性因子的點擊反應(yīng)模塊和帶 熒光標(biāo)記的點擊反應(yīng)模塊的腫瘤標(biāo)記探針，兩個點擊反應(yīng)模塊之間可以通過點擊反應(yīng)快速 結(jié)合，利用該腫瘤標(biāo)記探針進行腫瘤活體光學(xué)分子影像及活細(xì)胞成像，將特異因子預(yù)靶向 腫瘤組織或細(xì)胞后，利用點擊化學(xué)高選擇性、高效、快速的反應(yīng)特點再標(biāo)記熒光物質(zhì)，可避 免熒光物質(zhì)與特異因子之間的相互干擾，可有效實現(xiàn)腫瘤組織或細(xì)胞的在體監(jiān)測或體外標(biāo) 記，有效降低肝腎等對探針或藥物的代謝清除，從而提高探針的生物利用度和監(jiān)測靈敏度。
【附圖說明】
[0024]圖1為基于TCO/Tz點擊化學(xué)反應(yīng)的腫瘤標(biāo)記探針原理；
[0025] 圖2為探針A、B、C對SGC7901細(xì)胞標(biāo)記熒光成像圖，A為實驗組TC0-RGD/Tz-Cy5.5，B 為對照組RGD/Tz-Cy5.5，C為對照組Cy5.5-RGD;
[0026] 圖3為探針D、E、F對SGC7901細(xì)胞標(biāo)記熒光成像圖，D為實驗組TCO-GEBPll/Tz-Cy5 · 5，E為對照組GEBP11/Tz-Cy5 · 5，F(xiàn)為對照組Cy5 · 5-GEBP11;
[0027] 圖4是探針D、E、F的在體成像，D為實驗組TCO-GEBP11 /Tz-Cy5.5，E為對照組 GEBP11/Tz-Cy5 · 5，F(xiàn)為對照組Cy5 · 5-GEBP11。
【具體實施方式】
[0028] 以下將結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的描述，需要說明的是，本實施例以本技術(shù)方 案為前提，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護范圍并不限于本實 施例。
[0029] 一種基于點擊化學(xué)的腫瘤標(biāo)記探針，包括腫瘤特異因子點擊反應(yīng)模塊TC0-TL以及 熒光標(biāo)記點擊反應(yīng)模塊Tz-FL，兩個模塊可通過點擊化學(xué)反應(yīng)快速結(jié)合，反應(yīng)原理如圖1所 示。TC0-TL和Tz-FL的結(jié)構(gòu)式如下：
[0032] 其中，TC0為含環(huán)辛烯基團類化合物，TL為腫瘤特異性因子;Tz為含四嗪基團類化 合物;FL為熒光標(biāo)記物；
[0033] TC0-TL和Tz-FL通過點擊化學(xué)反應(yīng)結(jié)合后的結(jié)構(gòu)式為：
[0035]進一步地，熒光標(biāo)記物FL可選自花菁染料、羅丹明染料、熒光素染料或量子點，如 Cy3、Cy5、Cy5·5、Cy7、ICG、ICG-Der-01、ICG-Der-02、ICG-Der-03、IR820、A1exaFluor750、 AlexaFluor700、AlexaFluor680、AlexaFluor660、AlexaFluor647、AlexaFluor 635、AlexaFluor633、AlexaFluor610、AlexaFluor594、AlexaFluor568、Alexa Fluor555、AlexaFluor546、AlexaFluor532、AlexaFluor514、AlexaFluor500、 AlexaFluor488、FITC等。
[0036] 進一步地，腫瘤特異性因子TL可選自核酸、多肽、蛋白、酶、糖類、抗體、單克隆抗 體、雙特異性抗體或多特異性抗體。包括RGD、RGDS、GRGES、GRGDS、GRGDNP、c(RGDfC)、c (RADfC)、c(RADfV)、c(RGDyC)、c(RGEfK)、c(RGDyE)、c(RGDfE)、c(RGDfK)、c(RADfK)、c (R⑶fV)、c(RADyK)、E[c(RGDfK)]2、E[c(RGDyK)]2、GXl、GEBPll、TPS、CA15-3、CEA、CA125、 CA153、CA199、CA724、NSE、PSA、CA242、0-HCG、PSA、G3BP、AFP、AFP-L3、DCP、AFU、Flt-l、KDR、 Flt-4、NP-l、NP-2、pHLIP、T7、T12、MMPs、SF等。
[0037] 作為優(yōu)選，所述Tz為(芐胺-4-基)-3-四嗪。
[0038]作為優(yōu)選，所述TC0為5-琥珀酰亞胺酯環(huán)辛烯。
[0039]實施例1
[0040]腫瘤特異因子點擊反應(yīng)模塊TC0-RGD的制備：
[0041]將TC0-NHS0.64mg溶于 128yLDMS0中于2mLEP管，加入溶于 1.5mgR⑶肽的DMS0 溶液70yL，再加入2yLTEA，室溫避光攪拌過夜反應(yīng)（12h)，用乙醚與乙酸乙酯析出產(chǎn)物的方 法純化分離得到白色粉末狀固體TC0-RGD，真空干燥，低溫保存。T⑶-NHS是商品級的，也可 以通過以下方法制得:取TC0，加入DIC和NHS，反應(yīng)溶劑選用DCM，于室溫條件下避光攪拌， HPLC監(jiān)測；反應(yīng)結(jié)束后，用乙醚析出產(chǎn)物的方法純化分離得到固體，真空干燥，得到產(chǎn)物 TC0-NHS〇 [0042]實施例2
[0043]腫瘤特異因子點擊反應(yīng)模塊TC0-GEBP11的制備：
[0044] 將TC0-NHS0.5mg溶于50yLDMS0中于2mLEP管，加入溶解有2mgGEBP11 肽的DMS0 溶液250yL，再加入4yLTEA，室溫避光攪拌過夜反應(yīng)（12h)，用乙醚與乙酸乙酯析出產(chǎn)物的 方法純化分離得到白色粉末狀固體TC0-GEBP11，真空干燥，低溫保存。
[0045] 實施例3
[0046] 熒光標(biāo)記點擊反應(yīng)模塊Tz-Cy5.5的制備：
[0047] 取lmgCy5.5于2mL的EP管中，加入7yLDIC，4.6mgNHS(Cy5.5:DIC:NHS的摩爾投 料比為1:40:40)，反應(yīng)溶劑選用DMS0 500yL，于室溫條件下避光攪拌6h，反相TLC監(jiān)測。反應(yīng) 結(jié)束后，用乙醚與乙酸乙酯析出產(chǎn)物的方法純化分離得到藍(lán)色固體，真空干燥，得到產(chǎn)物 Cy5.5-NHS〇
[0048]取Cy5.5-NHS0.5mg溶于300yLDMSO中于2mLEP管中，加入溶解有0.28mgTz的 DMS0溶液28yL，再加入4yLTEA(Cy5.5-NHS:Tz的摩爾投料比為1:3)，室溫避光攪拌過夜 (12h)，反應(yīng)結(jié)束后，用乙醚與乙酸乙酯混合洗滌的方法純化分離得到藍(lán)色固體，真空干燥， 低溫保存。
[0049] 實施例4
[0050] 熒光標(biāo)記點擊反應(yīng)模塊Tz-ICG的制備：
[0051]取lmgICG于2mL的EP管中，加入8.5yLDIC，6.3mgNHS(ICG:DIC:NHS的摩爾投料 比為1:40:40)，加入反應(yīng)溶劑DMS0/DCM( 170yL/180yL)，于室溫條件下避光攪拌4h，反相TLC 監(jiān)測。反應(yīng)結(jié)束后，用乙醚與乙酸乙酯析出產(chǎn)物的方法純化分離得到綠色固體，真空干燥， 得到