一種熒光-sers雙模式超分辨成像探針及其制備方法和使用方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種熒光-SERS雙模式超分辨成像探針及其制備方法和使用方法，屬 于超分辨成像技術。
【背景技術】
[0002] 長期以來，遠場光學顯微鏡憑借其非接觸、無損傷、可探測樣品內部等優(yōu)點，一直 是生命科學中最常用的觀測工具。但是由于衍射極限的存在，傳統(tǒng)光學顯微鏡的分辨率分 別僅為230nm和550nm〇
[0003] 為了揭示細胞內分子尺度的動態(tài)和結構特征，提高光學顯微鏡分辨率成為了生命 科學發(fā)展的迫切需求，在遠場光學顯微鏡的基礎上，科學家們已經發(fā)明了許多提高成像分 辨率甚至超越分辨率極限的成像技術，例如，受激輻射損耗顯微技術(STED)，結構光照明顯 微技術(SIM和SSIM)，熒光輻射差分顯微技術(FED)，以及基于單分子熒光定位的顯微技術 (PALM和STORM)。
[0004] PALM顯微技術是Eric Betzig于2006年提出的，使用的是光激活熒光蛋白，每次只 使樣品中隨機的少量熒光分子發(fā)光，通過擬合，找出每個熒光分子中心點的位置。重復拍攝 多張圖片之后，就可以把所有熒光分子的中心位置疊加起來形成完整的圖像，其分辨率約 為20nm。
[0005] 表面增強拉曼散射光譜（surface enhanced Raman scattering，SERS)技術作為 一種新興的生物標記手段，是當前國際上備受矚目的研究熱點。SERS-方面繼承了拉曼光 譜的諸多優(yōu)點，如光信號不易漂白、對生物組織損傷小、光譜信息豐富等;另一方面，它彌補 了傳統(tǒng)拉曼散射信號強度弱、不利于檢測的缺點。SERS光譜的"指紋"特性使人們能在復雜 的生物環(huán)境中跟蹤、檢測目標分子。此外，SERS效應巨大的增強作用使基于SERS的光譜檢測 具有超高的靈敏度，甚至可實現(xiàn)單分子水平的分析研究。SERS效應產生在納米尺度粗糙的 金屬表面，納米技術的飛速發(fā)展為構筑多功能化的SERS納米探針提供了豐富的技術途徑。 這些基于SERS光譜技術的納米探針在生物成像、核酸或蛋白檢測、腫瘤識別、藥物輸運等諸 多生物醫(yī)學領域展現(xiàn)出了優(yōu)異的應用前景。

【發(fā)明內容】

[0006] 發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術中存在的不足，本發(fā)明提供一種熒光-SERS雙模式超 分辨成像探針及其制備方法和使用方法，實現(xiàn)熒光-SERS雙模式超分辨光學成像，可以用于 基于單分子定位法的超分辨光學成像(如PALM、STORM成像）。
[0007] 技術方案:為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為：
[0008] -種熒光-SERS雙模式超分辨成像探針，該探針為蛋黃-蛋殼結構，包括內核和外 殼層，內核和外殼層之間形成空腔，同時具有焚光信號和SERS信號的拉曼分子在空腔內自 由運動;所述內核為金屬納米粒子，所述外殼層為二氧化娃殼，在二氧化娃殼的外表面修飾 醛基，該探針通過醛基偶聯(lián)異性靶向配體。本發(fā)明在探針中加入拉曼分子，能夠同時實現(xiàn)熒 光和SERS雙模式超分辨光學成像。
[0009] 優(yōu)選的，所述拉曼分子不帶電性并且不帶能夠連接到金屬和二氧化硅上的官能 團，確保拉曼分子能夠在空腔內自由運動。
[0010] 優(yōu)選的，所述內核為金核銀殼納米粒子。
[0011] 本發(fā)明的熒光-SERS雙模式超分辨成像探針的制備方法，包括如下步驟：
[0012] (1)采用檸檬酸鈉還原方法制備金納米粒子；
[0013] (2)采用檸檬酸鈉還原硝酸銀方法在金納米粒子表面制備銀殼，形成金核銀殼納 米粒子；
[0014] (3)采用改進的StOber ^法（參見Langmuir 2003,19,6693-6700，A General Method To Coat Colloidal Particles with Silica)在金核銀殼納米粒子表面制備二氧 化娃；
[0015] (4)采用由內而外選擇性刻蝕二氧化硅的方法制備二氧化硅殼，即只刻蝕靠近金 核銀殼納米粒子的二氧化娃、保留一定厚度的最外層二氧化娃形成二氧化娃殼；
[0016] (5)拉曼分子通過自由擴散的方法進入空腔。
[0017] 本發(fā)明的熒光-SERS雙模式超分辨成像探針的使用方法，該探針對特異性識別配 體標記過程包括如下步驟：
[0018] 步驟一:在二氧化硅殼的外表面修飾氨基;可以通過利用帶氨基的硅烷偶聯(lián)劑共 價修飾或利用帶氨基的聚合物通過靜電吸附修飾的方式在二氧化硅殼的外表面修飾氨基；
[0019] 步驟二:戊二醛的兩端各有一個醛基，戊二醛一端的醛基與二氧化硅殼上的氨基 反應，將探針連接在戊二醛上；
[0020] 步驟三:戊二醛另一端的醛基與特異性識別配體上的氨基反應，將特異性識別配 體連接在戊二醛上，從而以戊二醛作為偶聯(lián)分子將特異性識別配體偶聯(lián)至探針上。
[0021] 本發(fā)明的探針可以產生熒光信號和SERS信號的閃爍開關，這兩種光學信號的閃爍 開關通過拉曼分子在空腔內部的自由運動實現(xiàn)：當拉曼分子運動至靠近內核時，SERS信號 打開、焚光信號淬滅；當拉曼分子運動至靠近外殼層時，SERS信號淬滅、焚光信號打開。
[0022] 有益效果:本發(fā)明提供的一種熒光-SERS雙模式超分辨成像探針及其制備方法和 使用方法，能夠實現(xiàn)熒光-SERS雙模式的超分辨光學成像，可以用于基于單分子定位法的超 分辨光學成像(如PALM、STORM成像）。
【附圖說明】
[0023] 圖1是本發(fā)明提出的熒光-SERS雙模式超分辨成像探針的結構示意圖，包括：1、內 核，2、外殼層、3、空腔，4、拉曼分子，5、抗體；
[0024] 圖2是本發(fā)明提出的熒光-SERS雙模式超分辨成像探針的制備過程圖；
[0025]圖3是實施例中探針的消光光譜；
[0026]圖4是實施例中探針的熒光光譜；
[0027]圖5是實施例中探針的SERS光譜。
【具體實施方式】
[0028]下面結合附圖對本發(fā)明作更進一步的說明。
[0029] 本實施例中涉及的roS緩沖液(Phosphate Buffer Saline，磷酸緩沖鹽溶液)濃度 為10mM(單位是毫摩爾每升，也可寫為mmol/L)，p