作為生物標(biāo)記物的電中性金屬配合物的制作方法
【專利說明】作為生物標(biāo)記物的電中性金屬配合物
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本申請要求2013年6月18日提交的題目為"作為生物標(biāo)記物的電中性金屬配合物" 美國臨時申請No. 61 /956，810的權(quán)益，將該申請的內(nèi)容并入本文作為參考。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及可生物偶聯(lián)的發(fā)光金屬配合物，以及它們作為新型標(biāo)記分子在化學(xué)、 生物化學(xué)和生物分析領(lǐng)域中的應(yīng)用，如免疫檢測和DNA探針。更具體的說，本發(fā)明涉及電中 性的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記分子以及它們在電化學(xué)發(fā)光免疫分析中的應(yīng)用。
[0004] 發(fā)明背景
[0005] 基于生物親和性（即兩種生物活性物質(zhì)，如抗體/抗原，的選擇性結(jié)合)的生物分析 方法在很大程度上依賴生物標(biāo)記分子，標(biāo)記技術(shù)以及對產(chǎn)生于標(biāo)記分子的信號的檢測。生 物標(biāo)記分子是能夠自身，或者在與其它試劑發(fā)生物理/化學(xué)相互作用時，發(fā)出能與被測物質(zhì) 的量相關(guān)的可檢測的信號的化學(xué)或生物化學(xué)物質(zhì)。生物標(biāo)記分子包括，但不僅限于:含放射 性原子的分子(放射性），發(fā)光化合物(在光激發(fā)或化學(xué)反應(yīng)中發(fā)光），電活性化合物(通過氧 化還原反應(yīng)產(chǎn)生電信號），磁性顆粒(磁信號）和酶(通過與底物的反應(yīng)，生成可檢測的物質(zhì) 或者光信號）。生物標(biāo)記分子包含一個或多個信號產(chǎn)生單元以及一個或多個反應(yīng)性基團(tuán)。后 者與待標(biāo)記的生物分子易于形成共價鍵。標(biāo)記過程是將一個或多個標(biāo)記分子和生物活性物 質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，該復(fù)合物保持對特定待檢測物質(zhì)的生物親和性。
[0006] 通過一系列的電化學(xué)氧化還原反應(yīng)以及與共反應(yīng)劑（諸如專利US 6451225和US 6702986中披露的三丙胺)發(fā)生的后續(xù)化學(xué)反應(yīng)，電化學(xué)發(fā)光(ECL)已經(jīng)發(fā)展成為一種成熟 的生物分析技術(shù)，在此技術(shù)中，一種金屬配位化合物，如舒（Π )多二亞胺(polydiimine)復(fù) 合物，被用作ECL標(biāo)記分子的信號產(chǎn)生單元。美國專利（5221605,5238808,5310687， 5714089,5731147,6140138,6316607)和許多研究論文披露了ECL標(biāo)記分子以及它們在免疫 分析和 DNA 探針領(lǐng)域的應(yīng)用 Η^Ι^η:6·Ρ·Β1α^Λι?Γηθ?Β?·，(：Ηη·αιθπκ1991，37/9，1534-1539;J.H.Kenten et al.，Clin.Chem.l991,37/9,1626-1632·)。
[0007] 對ECL標(biāo)記分子的改進(jìn)是一個長期持續(xù)的努力方向。一方面，有大量的工作試圖通 過在一個或多個與釕（II)離子配位的配體上連接上功能基團(tuán)而重新設(shè)計釕（II)配合物。另 一方面，把ECL發(fā)光體從釕（II)配合物擴(kuò)展到其它金屬配合物的努力也進(jìn)行了很多，其中一 些在專利中有所披露。比如美國專利5858676和6468741分別公開了稀土金屬配合物和錸配 合物的 ECL。專利申請 W02012107420，US2013/0323719，US2013/0323857，W02014019707， W02014019708和W02014019711則公開了用作ECL標(biāo)記分子的基于銥的新型配合物。
[0008] 在基于釕（II)的ECL發(fā)光體的改進(jìn)方面，美國專利US 5981286公開了帶有親水性 雙齒配體的釕（II)配合物。W0 99/15694公開了一種分子設(shè)計，其中金屬配合物發(fā)光體通過 共價鍵與共反應(yīng)劑（即三丙胺或其類似物)相連接。不過，由于在ECL過程中，共反應(yīng)劑是要 被消耗的（而不是循環(huán)使用），所以它的濃度在實(shí)際的生物測定中須比發(fā)光體的濃度高很多 倍。這種方案不能幫助提高ECL的強(qiáng)度。為了提高ECL生物檢測的靈敏度，美國專利US 5679519公開了一種多標(biāo)記的探針復(fù)合物，它包含有生物素化的牛血清白蛋白分子作為平 臺，以及大量被該平臺結(jié)合的電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記分子。另外，美國專利申請US 2005/0059834 中也提出了構(gòu)造擔(dān)載有多個ECL發(fā)光體的樹枝狀構(gòu)架從而實(shí)現(xiàn)在生物分子的單個位點(diǎn)上進(jìn) 行多標(biāo)記（也見M.Zhou et al.，Anal.Chem.2003,75,6708-6717)。
[0009] 進(jìn)一步地，雙齒配體的的選擇也已經(jīng)超越了以2，2 聯(lián)吡啶和1，10-菲咯啉的基礎(chǔ) 類型。美國專利7750157 B2(EP1759204 A1)公開了一種釕（II)標(biāo)記物設(shè)計，其中生物偶聯(lián) 臂連接在一個既非2，2 聯(lián)吡啶也非1，10-菲咯啉的雙齒配體上。
[0010] 以上專利和研究論文中所披露的這些釕（II)ECL發(fā)光體（沒有生物偶聯(lián)基團(tuán)）和 ECL標(biāo)記分子(帶有生物偶聯(lián)基團(tuán)）的一個共同特點(diǎn)是它們都有一個帶正電荷的金屬配合物 發(fā)光體(見圖1A)，和不發(fā)光的反離子，如氯離子Cr或六氟磷酸根離子PFf等。用這些發(fā)光體 標(biāo)記的物質(zhì)的生物活性或者選擇性親和能力會由于帶正電的金屬配合物的引入而降低。降 低了的生物活性在基于生物親和性的生物檢測中會提升非特異性結(jié)合，從而降低生物分析 的靈敏度和重復(fù)性。針對帶有正電性ECL發(fā)光體的標(biāo)記物的這一缺點(diǎn)，美國專利5958783 (CN1134154，EP0720614 B1)公開了一類ECL標(biāo)記分子(見圖1B)，其特征在于，在帶正電的發(fā) 光體和反應(yīng)基團(tuán)（即生物偶聯(lián)基團(tuán)）之間有一個帶電荷的連接體。據(jù)其披露，由于降低了對 蛋白的非特異性結(jié)合，這類標(biāo)記物改進(jìn)了ECL免疫分析的性能。不過在這個標(biāo)記物中，信號 產(chǎn)生單元(ECL發(fā)光體)本身還是帶正電荷的金屬配合物，需要反離子來中和其正電荷。
[0011] 同樣為了降低有害的非特異性結(jié)合，美國專利6808939B2(CN1612861A)公開了一 類帶電荷(尤其是負(fù)電荷)功能基團(tuán)的雙齒配體（即聯(lián)吡啶和菲咯啉）以及含有這些帶電荷 配體的釕（II)配合物標(biāo)記分子(見圖1C)。這些結(jié)構(gòu)為M(L'）（L"） 2的二雜配標(biāo)記分子具有負(fù) 電荷以及可離解的陽離子。結(jié)果顯示，一些帶負(fù)電荷的發(fā)光體標(biāo)記在抗體上后，非特異性的 ECL信號顯著降低。然而，在降低非特異性信號的同時，沒有顯示對特異性信號水平的改進(jìn)。
[0012] 這些ECL發(fā)光體或含這些發(fā)光體的標(biāo)記分子或者帶正電荷（絕大多數(shù)情況），或者 帶負(fù)電荷，都需要有反離子來中和電荷。它們都是離子性化合物，在電解液溶液中均會分開 或電離成陽離子和陰離子。此外，已經(jīng)合成的這些金屬配合物或者是二雜配，或者是均配金 屬配合物，即配合物中至少有兩個二齒配體是相同的。
[0013] L.Della Ciana等（J.Phys.Chem.C 2010,114,3653-3658)描述了一個二雜配兩性 離子釕(II)發(fā)光體，其含有兩個相同的2,2'_聯(lián)吡啶配體和一個苯磺酸化的菲咯啉配體，該 發(fā)光體在水相中的ECL強(qiáng)度與三聯(lián)吡啶釕（II)配合物相比要高。不過，和其它一些不具有生 物偶聯(lián)基團(tuán)的、報道所稱的高強(qiáng)度ECL發(fā)光體一樣，該發(fā)光體用于ECL免疫分析不可行，而且 在該金屬配合物上引入反應(yīng)性生物偶聯(lián)基團(tuán)的合成方法也未建立。
[0014] 釕(II)配合物在包含有共反應(yīng)劑和溶劑的特定電解質(zhì)溶液中的ECL強(qiáng)度隨著配體 的結(jié)構(gòu)和配體的組合方式不同而差別巨大。由于ECL產(chǎn)生過程的復(fù)雜性(W.Miao et al， JACS，2002，124，14478-14485)，一般共識是，任何單一的性質(zhì)，諸如光量子效率，氧化還原 電勢，發(fā)光波長以及發(fā)光體的電荷狀態(tài)與ECL強(qiáng)度沒有相關(guān)性（M.Zhou et al， Inorg. Chem. 2005，44，8317-8325)。不過，用電中性的發(fā)光體標(biāo)記一個生物物質(zhì)不會改變該 物質(zhì)的電荷狀態(tài)。因此，在大小相近或分子量類似的標(biāo)記物中，電中性的標(biāo)記分子對于待標(biāo) 記生物物質(zhì)的生物活性的影響最小。鑒于此，本發(fā)明注重設(shè)計配體的結(jié)合方式，以使金屬配 合物(例如釕（II)配合物)成為電中性的ECL標(biāo)記物，其在水性緩沖溶液或任何其它溶劑中 不解離成陽離子和陰離子。
[0015] 在我們通過使用電中性標(biāo)記物降低標(biāo)記物對被標(biāo)記物活性的影響的同時，我們驚 奇地發(fā)現(xiàn)電中性的ECL標(biāo)記物不僅降低了非特異性信號，一部分電中性ECL標(biāo)記分子還產(chǎn)生 了更高的ECL強(qiáng)度。
[0016] 過去公開的釕（II)配合物標(biāo)記分子的合成主要遵循一種方法(見下面反應(yīng)式）。在 這種方法中，首先合成順式I了二亞胺二氯化物(cis-ruthenium diimine(L)dicholoride)， 即cis-RU(L)2Cl 2)，然后再將具有生物偶聯(lián)功能的二亞胺配體與金屬離子配位。
[0017] RuCl3\xH2〇+L-cis-Ru(L)2Cl2(l)
[0018] cis-Ru(L)2Cl2+L'-Ru(L)2(L'）C12(2)
[0019] 美國專利US 6808929B2公開了另一種合成方法(專利中的實(shí)施例2)。其中，一個具 有生物偶聯(lián)功能的二亞胺配體，即4-甲基-4'-(3-羧丙基)-2,2'_聯(lián)吡啶，先和氯化釕（II) 發(fā)生配位，而后再引入另外兩個相同的配體，形成ECL標(biāo)記物。
[0020] 這些合成方法產(chǎn)生二雜配配合物標(biāo)記分子，它們具有兩個不具有生物偶聯(lián)功能的 相同配體和一個具有生物偶聯(lián)功能的配體。合成三雜配金屬配合物ECL標(biāo)記分子的工作在 現(xiàn)有技術(shù)中還未見報道。
[0021] 不同于圖1A-C中那些具有帶正電荷或者帶負(fù)電荷的釕（II)發(fā)光體，圖1D所示的電 中性ECL標(biāo)記分子具有三個不同的配體，不能套用二雜配配合物標(biāo)記分子的合成方法來進(jìn) 行合成。所以，本發(fā)明中除了披露配體組合模式外，該發(fā)明也涉及一種將三個不同的二亞胺 配體依次與金屬離子配位形成三雜配ECL標(biāo)記分子的合成方法。
[0022]本發(fā)明進(jìn)一步公開了用這類中性ECL發(fā)光體標(biāo)記的生物物質(zhì)以及它們在ECL免疫 分析中的應(yīng)用。
[0023] 本發(fā)明的一個目的是提供具有電中性金屬配合物發(fā)光體的發(fā)光生物標(biāo)記物。
[0024] 本發(fā)明的另一個目的是提供導(dǎo)致金屬配合物發(fā)光體呈電中性的不同的配體組合 模式。
[0025] 本發(fā)明的又一個目的是提供具有電中性金屬配合物發(fā)光體的三雜配標(biāo)記物的合 成方法。
[0026] 本發(fā)明的再一個目的是提供標(biāo)記有電中性金屬配合物發(fā)光體的物質(zhì)。
[0027] 本發(fā)明還有一個目的是提供用于開展化學(xué)物質(zhì)、生物化學(xué)物質(zhì)和生物活性物質(zhì)的 ECL定量分析的生物標(biāo)記分子。
[0028] 發(fā)明概述
[0029]本發(fā)明涉及生物分析方法的改進(jìn)，具體來說是利用金屬配合物的電產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光 或電化學(xué)發(fā)光(ECL)的免疫分析和核酸檢測。本發(fā)明所描述的金屬配合物以釕（II)配合物 作為實(shí)例。但是，能生成與金屬釕(II)多二亞胺配合物類似的金屬螯合物的其它過渡金屬， 如金屬鋨、鉑、錸、銥等，也在本發(fā)明的涵蓋范圍內(nèi)。
【附圖說明】
[0030]圖1展不現(xiàn)有技術(shù)公開的(A-C)和本發(fā)明披露的(D)ECL標(biāo)記分子。
[0031] 圖2是化合物3的1H NMR圖譜。
[0032] 圖3是化合物6的1H NMR圖譜。
[0033] 圖4是化合物10的1H NMR圖譜。
[0034] 圖5是化合物15的1H NMR圖譜。
[0035] 圖6是化合物16的1H NMR圖譜。
[0036] 圖7是標(biāo)記分子17的1H NMR圖譜（圖譜左邊:芳香環(huán)區(qū)；圖譜右邊:脂肪鏈區(qū)）。
[0037] 圖8是標(biāo)記分子18的1H NMR圖譜。
[0038] 圖9是標(biāo)記分子19的1H NMR圖譜。
[0039] 圖10是標(biāo)記分子20的1H NMR圖譜。
[0040] 圖11是標(biāo)記分子16，19,27和Ru(2,2'_聯(lián)吡啶)2[4-(2,2'_聯(lián)吡啶-4-基)丁酸]Cl 2 (標(biāo)識為Ru-Ref)的吸收光譜。
[0041 ] 圖12是標(biāo)記分子16，19,27和Ru(2,2'_聯(lián)吡啶)2[4-(2,2'_聯(lián)吡啶-4-基)丁酸]Cl 2 (標(biāo)識為Ru-Ref)的光致發(fā)光光譜。
[0042]圖13比較不同標(biāo)記分子在含有三丙胺的pH值為6.8的磷酸鹽緩沖溶液中以1.4V vs.Ag/AgCl階躍電勢激發(fā)所得到的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。釕（II)配合物的濃度均為:0.1μπι〇1 L-、
[0043] 圖14比較標(biāo)記分子16和Ru-Ref在含有三丙胺的pH值為6.8的磷酸緩沖溶液中以 1.4V vs.Ag/AgCl電階躍電勢激發(fā)所得到的電化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度。釕(II)配合物的濃度分別為： 10-7，10- 8，10-9mol L-、
[0044] 圖15比較使用標(biāo)記分子16和Ru-Ref在免疫分析測試中的ECL信號強(qiáng)度。
[0045] 發(fā)明詳述
[0046] 本文中所用到的術(shù)語"金屬配合物"，"配位金屬配合物"，"發(fā)光金屬配合物"，"ECL 金屬配合物"，"釕（II)配合物"，"金屬釕（II)配合物"和"金屬螯合物"有時可交替使用。在 本發(fā)明的范圍里，金屬配合物或者ECL金屬配合物包含"發(fā)光體"或"ECL發(fā)光體"以及"標(biāo)記 分子"或"ECL標(biāo)記分子"。前者是沒有生物偶聯(lián)基團(tuán)的金屬配合物，而后者則指的是具有生 物偶聯(lián)基團(tuán)的金屬配合物。生物偶聯(lián)基團(tuán)是一類功能化的或能進(jìn)行反應(yīng)的反應(yīng)性基團(tuán)，它 可以在溫和的條件下，如處于室溫的生理緩沖溶液中，和其它化學(xué)、生物化學(xué)和生物物質(zhì)發(fā) 生反應(yīng)，形成高度穩(wěn)定的共價鍵。
[0047] 在本發(fā)明的范圍內(nèi)，被稱作"標(biāo)記物"，"標(biāo)記物分子"，"釕(II)標(biāo)記物"和"ECL標(biāo)記 物"的物質(zhì)可與其它物質(zhì)形成共價鍵，這些其它物質(zhì)諸如，具有生物活性的被測物或其類似 物，基于親和性的被測物的識別性配對物或