9612 菌種鑒定
[0033] 基因組DNA的提?。簩⒎蛛x得到的菌株劃線接種到LB固體培養(yǎng)基上于37°C中培 養(yǎng)24h后，挑取單菌落于裝有LB液體培養(yǎng)基的試管中37°C，150r/min搖床培養(yǎng)12h。具體 方法參閱文南犬（AusubelFM,BrentR,KingstonRE,etal.ShortProtocolsinMolecular Biology.Chichester:JohnWiley&Sons,Inc, 1995:36-40.)。將取得的DNA溶于 50μLTE 緩沖液（10mMTris-HCl，ImMEDTA，PH= 8. 0)中，然后保存于-20°C冰箱備用。
[0034] 16SrDNA序列擴(kuò)增引物由上海生物工程有限公司合成。
[0035]PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：TaqDNA聚合酶 0· 5μL，10XBuffer5μL，MgCl2 3μL， dNTPs(10mmol/L)lyL，引物 27F1yL，引物 1492R1yL，模板 0· 5yL，ddH20 補(bǔ)足至 50yL。 反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性5min;94°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸1. 5min，30個(gè)循環(huán)； 72°C延伸10min。16SrDNA的測(cè)序工作由上海生物工程有限公司完成。
[0036] 將所測(cè)16SrDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列比對(duì)，結(jié)果表明：本 發(fā)明的菌株位于系統(tǒng)發(fā)育樹中芽孢桿菌（Bacillus,sp)分支中，與Bacillus stratosphericus(KC172034. 1)和Bacillusaltitudinis(KF054998. 1)兩株菌有最近的 親緣關(guān)系，其16SrRNA基因序列相似性都為99%。
[0037] 該菌株在LB培養(yǎng)基（蛋白胨10g，酵母浸膏5g，NaCl10g，蒸餾水1000ml，121°C 滅菌20min，溫度37°C，pH7.0。）上培養(yǎng)48h后菌落呈圓形，半透明，表面光滑，淡黃色， 邊緣整齊，菌落稍凸起。菌體呈桿狀，產(chǎn)芽孢，革蘭氏染色陽性。該菌株的生理生化特征 為：甲基紅試驗(yàn)陰性、v-p試驗(yàn)陰性、淀粉水解試驗(yàn)陰性、硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性、吲哚試驗(yàn)陰 性、硫化氫試驗(yàn)陽性、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)陽性、葡萄糖發(fā)酵試驗(yàn)陽性、蔗糖發(fā)酵試驗(yàn)陽性、麥 芽糖發(fā)酵試驗(yàn)陽性、乳糖發(fā)酵試驗(yàn)陰性、甘露醇發(fā)酵試驗(yàn)陰性、葡萄糖碳源利用試驗(yàn)陽性、 乳糖碳源利用試驗(yàn)陽性、甘露醇碳源利用試驗(yàn)陽性、蔗糖碳源利用試驗(yàn)陽性、麥芽糖碳源 利用試驗(yàn)陽性、檸檬酸碳源利用試驗(yàn)陰性、2 %NaCl耐鹽試驗(yàn)陽性、5 %NaCl耐鹽試驗(yàn)陽 性、7 %NaCl耐鹽試驗(yàn)陽性、10 %NaCl耐鹽試驗(yàn)陽性、產(chǎn)氨試驗(yàn)陽性。由以上菌落、菌體 形態(tài)，生理生化特征和16SrDNA序列分析，鑒定CGMCC9612為同溫層芽孢桿菌（Bacillus stratosphericus)〇
[0038] (3)蛋白降解試驗(yàn)
[0039] 培養(yǎng)基及菌種制備：配制脫脂奶粉的培養(yǎng)基（脫脂奶粉3. 0g;瓊脂3. 0g;去離 子水200mL;pH7. 0~7. 2,108°C滅菌20min)。倒平板后將該菌于平板培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng) 24h(37°C)。觀察透明圈大小測(cè)量透明圈半徑（R)和菌落半徑（r)，并測(cè)量其比值R/r。經(jīng) 測(cè)量其菌落半徑為〇.lcm，透明圈半徑為0. 9cm，R/r= 9。降解蛋白質(zhì)效果如圖7所示。
[0040] 國(guó)標(biāo)法測(cè)蛋白酶酶活力：用福林酚法，以酪蛋白為底物每lmin生成1μg酪氨酸所 需酶量定義為一個(gè)酶活（IU)。經(jīng)測(cè)定PR1的蛋白酶酶活為7. 493IU。
[0041] (4)解磷效果測(cè)定
[0042] 將本發(fā)明篩選得到的菌株接種在蒙金娜固體培養(yǎng)基（葡萄糖10g，（NH4) 2S04 0.5g，NaC10.3g，MgS04.7H20 0.3g，F(xiàn)eS04 0 . 03g，MnS04.H20 0.03g，CaC03 5.0g，KCl0.3g， Ca3 (Ρ04) 225·Og，卵磷脂0· 3g，瓊脂18~20g，pH值7· 2~7· 4。）上培養(yǎng)一周，測(cè)量其菌落 直徑d、溶磷圈直徑D，計(jì)算D/d，解磷圈效果如圖8所示，測(cè)得第一天其菌落直徑d為1. 5mm， 溶磷圈直徑D為5mm，D/d為3. 3,第三天其菌落直徑d為2. 5_，溶磷圈直徑D為8. 5mm，D/ d為3. 4,第七天其菌落直徑d為3. 5mm，溶磷圈直徑D為13mm，D/d為3. 7。將PR1在無機(jī) 磷液體培養(yǎng)基（葡萄糖l〇g，（NH4)2S04 0· 5g，NaCl0· 3g，MgS04 · 7H20 0· 3g，F(xiàn)eS04 0· 03g， MnS04.H20 0.03g，CaC03 5.0g，KCl0.3g，Ca3(P04)225.0g,水 1000mL，pH7.0-7.5)中培養(yǎng) 4天后，鉬藍(lán)比色法測(cè)定培養(yǎng)液中速效磷的含量變化，從而反應(yīng)細(xì)菌的解磷能力。測(cè)得PR1 培養(yǎng)液中速效磷含量為43. 3mg/L。
[0043] (5)產(chǎn)細(xì)胞分裂素能力測(cè)定
[0044] 保綠法：挑選顆粒飽滿、大小一致的小麥種子，用0. 1%的升汞溶液浸泡15分鐘消 毒，然后用無菌水沖洗5次，再用吸水紙吸干表面水分。將培養(yǎng)皿倒置，內(nèi)置兩張滅菌濾紙。 把小麥種子沿培養(yǎng)皿周圍整齊的播種到培養(yǎng)皿中，播種時(shí)使種子胚一律朝向培養(yǎng)皿中心， 每皿25粒，加無菌水6mL。加蓋后，將培養(yǎng)皿放入23°C的培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)。24-36h后觀 察種子萌發(fā)情況，棄去未萌發(fā)和發(fā)芽不整齊的種子，留下發(fā)芽整齊的種子，繼續(xù)培養(yǎng)。當(dāng)麥 芽頂?shù)矫笊w時(shí)，摘去皿蓋，光照，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中注意適當(dāng)補(bǔ)充蒸發(fā)的水分。
[0045] 將牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基分裝試管，每管5mL，121°C高壓蒸汽滅菌20min。向液 體培養(yǎng)基中接菌，37°C，180R/min，搖床培養(yǎng)24h。
[0046] 當(dāng)小麥苗長(zhǎng)至10cm高時(shí)，取小麥第一片真葉放到無菌水中，待用。在每管細(xì)菌懸 液中加入5mL無菌水，稀釋，搖動(dòng)混勻，待用。另取一支裝有不接菌的培養(yǎng)基試管，加入5mL 無菌水，稀釋，搖動(dòng)混勻，作為對(duì)照，待用。將麥葉取出切成lcm左右的小段，裝入含有不同 細(xì)菌發(fā)酵液稀釋液的試管及對(duì)照試管中，每管5段。25°C暗室放置4d后，目測(cè)葉片保綠情 況。將保綠效果好的菌種挑選出來，重復(fù)上述步驟，再進(jìn)行兩次復(fù)篩。
[0047] 觀察可知PR1的發(fā)酵液中小麥葉子保綠效果較好，PR1可以穩(wěn)定產(chǎn)生細(xì)胞分裂素。
[0048] (6)盆栽試驗(yàn)
[0049] 首先是育苗，選擇同一品種的煙草種子進(jìn)行育苗。育苗30天后選擇健壯、無病、長(zhǎng) 勢(shì)一致的煙苗進(jìn)行移栽，每盆栽煙1株，主要將煙苗莖桿全部埋入土內(nèi)，移栽后立即澆等量 的水。
[0050] 然后是進(jìn)行處理，一組空白對(duì)照，一組加PR1菌劑。培養(yǎng)得本發(fā)明菌懸液（菌懸液 的菌數(shù)濃度彡10scfu/mL)，作為液態(tài)菌劑使用，緩苗后灌根，每株煙苗加菌劑lmL。
[0051] 擺盆：為減少因大棚不同方向溫度的差異對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，盆子應(yīng)沿與大棚垂 直方向擺放。
[0052] 煙草生長(zhǎng)期內(nèi)注意土壤濕度，低于土壤相對(duì)含水量50%以后則需補(bǔ)水至土壤最大 持水量的80% (補(bǔ)水可根據(jù)煙株的生長(zhǎng)和缺水情況而定，但必須保證每盆的澆水量和土壤 濕度保持一致）。
[0053] 移栽后每隔10天調(diào)查葉片數(shù)，株高，莖圍，葉色，最大葉長(zhǎng)、寬，長(zhǎng)勢(shì)，所處生育期 等）。在盆栽進(jìn)程中發(fā)現(xiàn)處理間長(zhǎng)勢(shì)長(zhǎng)相有明顯差異時(shí)，將對(duì)照和處理擺在一起拍照，同時(shí) 將取樣煙株的根系進(jìn)行對(duì)比拍照。
[0054] 結(jié)果如表1、表2、表3、表4、表5所不。
[0055] 表1. 30天PR1對(duì)煙株農(nóng)藝性狀的影響
[0056]
[0057] 注：表中數(shù)據(jù)位平均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差。同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示差異顯著性 (ρ〈0· 05)，下同。
[0058] 表2. 60天PR1對(duì)煙株農(nóng)藝性狀的影響
[0059]
[0060] 表3. 90天PR1對(duì)煙株農(nóng)藝性狀的影響
[0061]
[0062] 表4. PR1對(duì)煙株鮮重的影響
[00631
[0064] 表5. PR1對(duì)煙株干重的影響
[0065]
[0066] 上述雖然結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】進(jìn)行了描述，但并非對(duì)本發(fā) 明保護(hù)范圍的限制，所屬領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該明白，在本發(fā)明的技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本領(lǐng)域技 術(shù)人員不需要付出創(chuàng)造性勞動(dòng)即可做出的各種修改或變形仍在本發(fā)明的保護(hù)范圍以內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株同溫層芽孢桿菌（Bacillusstratosphericus)PRl，該菌株保藏編號(hào)：CGMCC No.9612〇2. 權(quán)利要求1所述的同溫層芽孢桿菌的培養(yǎng)條件，其特征在于，采用的LB培養(yǎng)基：蛋 白胨l〇g，酵母浸膏5g，NaCl10g，蒸餾水1000ml，121°C滅菌20min，培養(yǎng)溫度37°C，pH7. 0。3. 權(quán)利要求1所述的同溫層芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于，用于降解蛋白質(zhì)和/或解磷 和/或產(chǎn)細(xì)胞分裂素。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的同溫層芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于，用于降解蛋白質(zhì)和/或 解磷和/或產(chǎn)細(xì)胞分裂素后促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的同溫層芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于，所述的的植物包括煙 草。6. 根據(jù)權(quán)利要求3或4或5所述的同溫層芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于，菌株培養(yǎng)后得 到菌懸液作為液態(tài)菌劑使用。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的同溫層芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于，菌懸液的菌數(shù)濃度 多 108cfu/mL。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的同溫層芽孢桿菌的應(yīng)用，其特征在于，菌劑的使用方法：緩苗 后灌根，每株煙苗加菌劑lmL。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株同溫層芽孢桿菌及其應(yīng)用，該菌株分類命名為同溫層芽孢桿菌(Bacillus？stratosphericus)PR1，保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期：2014年8月28日，保藏編號(hào)：CGMCC？No.9612。本發(fā)明菌株對(duì)蛋白質(zhì)具有很好的降解效果，福林芬法測(cè)得該菌株所產(chǎn)蛋白酶酶活力為7.493IU；用溶磷圈法和鉬藍(lán)比色法測(cè)得該菌株具有很好的解磷效果；用保綠法測(cè)得該菌株具有很好的保綠效果，可以產(chǎn)生細(xì)胞分裂素。表明PR1菌株對(duì)促進(jìn)煙草生長(zhǎng)具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。CGMCC No.961220140828
【IPC分類】C12N1/20, C12R1/07, A01P21/00, A01N63/02
【公開號(hào)】CN105349454
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510738323
【發(fā)明人】周曙光, 易建華, 周東波, 王東, 蒲文宣, 汪耀富, 孫在軍, 彭宇, 簡(jiǎn)永興, 杜秉海, 丁延芹, 姚良同
【申請(qǐng)人】湖南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司
【公開日】2016年2月24日
【申請(qǐng)日】2015年11月3日