本發(fā)明屬于環(huán)境污染治理領(lǐng)域，涉及一種用血紅密孔菌降解磺胺類化合物的方法。

背景技術(shù)：

漆酶(Laccases)是一種結(jié)合多個銅離子的蛋白質(zhì)，屬于銅藍(lán)氧化酶。漆酶可存活于空氣中，發(fā)生反應(yīng)后唯一的產(chǎn)物就是水，因此本質(zhì)上是一種環(huán)保型酵素。由于這幾年環(huán)保意識逐漸被人所重視，因此近年來漆酶也成為眾多學(xué)者的研究對象。漆酶常見于真菌及植物中。其中，白腐菌生產(chǎn)的漆酶在木質(zhì)素降解過程中起到了重要作用，尤其受到關(guān)注。而且，白腐菌生產(chǎn)的漆酶多為胞外酶，易于提取利用。目前研究最多的白腐菌是栓菌屬Trametes和側(cè)耳屬Pleurotus。近年來，密孔菌屬Pycnoporus開始引起關(guān)注，因為它能夠生產(chǎn)具有高氧化還原電位的漆酶，這意味著密孔菌屬Pycnoporus生產(chǎn)的漆酶可作用的底物范圍更大，而且漆酶是密孔菌屬Pycnoporus在液體發(fā)酵時生產(chǎn)的主要化酵素。

現(xiàn)有生產(chǎn)漆酶的技術(shù)，多需要較長的發(fā)酵周期，尤其在發(fā)酵初期，60h之內(nèi)，漆酶產(chǎn)量極低。使用天然培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，生產(chǎn)過程重復(fù)性較差。另外，現(xiàn)有技術(shù)利用漆酶降解磺胺類化合物，多使用從菌體發(fā)酵液提取純化或粗提的漆酶，這一系列程序繁瑣且代價高昂。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種用血紅密孔菌降解磺胺類化合物的方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

用血紅密孔菌降解磺胺類化合物的方法，包括如下步驟：

(1)種子培養(yǎng)：將保藏編號為CGMCC 5.815的血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基中，在25-30℃培養(yǎng)6-8天；再轉(zhuǎn)入馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中,在25-30℃培養(yǎng)45-50小時，得到血紅密孔菌一級種子；

(2)發(fā)酵培養(yǎng)：取步驟(1)獲得的血紅密孔菌的一級種子，在6000-10000rpm離心8-12min，棄上清，用發(fā)酵培養(yǎng)基將菌體重懸，在25-30℃，100-150rpm條件下，發(fā)酵40-50h；所述一級種子與發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為1：10-12.5；

(3)降解磺胺類化合物：將磺胺類化合物生產(chǎn)排放廢水與步驟(2)獲得的發(fā)酵液混合，使磺胺類化合物的濃度為20-50mg/L，加入2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽，使?jié)舛葹?.4-0.6mM，降解5-8h。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基優(yōu)選為：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂18g/L，自然pH，余量是水。

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基優(yōu)選為：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，自然pH，余量是水。

優(yōu)選地，發(fā)酵培養(yǎng)基用下述方法制成：取葡萄糖,1.0g/L；KH₂PO₄,1.0g/L；NaH₂PO₄,0.13g/L；2,2-二甲基琥珀酸1.0g/L；MgSO₄·7H₂O,0.5g/L；CuSO₄·5H₂O,0.01g/L；CaCl₂·2H₂O,0.05g/L；ZnSO₄·7H₂O,0.03g/L；MnSO₄·H₂O,0.02g/L；CoCl₂·6H₂O,0.001g/L；乙酸鈉1g/L，加水溶解，滅菌，得溶液一；取(NH₄)₂SO₄,0.5g/L；FeSO₄·7H₂O,0.01g/L；加水溶解，使用孔徑為0.22μm的濾膜過濾，得溶液二；將溶液一和溶液二混合，加足余量水。

磺胺類化合物優(yōu)選為磺胺甲惡唑、磺胺嘧啶、磺胺異惡唑、磺胺二甲基嘧啶或磺胺二甲氧嘧啶。

本發(fā)明的優(yōu)點：

本發(fā)明的方法不但提供了一種可以使P.sanguineus在沒有誘導(dǎo)物存在的情況下快速產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)條件，而且建立了一種在發(fā)酵液中利用整個菌體及其胞外環(huán)境進(jìn)行磺胺類化合物降解的方法，省去了分離純化等一系列繁瑣的步驟。本發(fā)明發(fā)酵時間大大縮短，降解率也顯著提高。并且，在本發(fā)明的條件下，降解過程可以被準(zhǔn)確地重復(fù)，十分穩(wěn)定。

附圖說明

圖1為血紅密孔菌在發(fā)酵過程中產(chǎn)漆酶的情況。

圖2為血紅密孔菌降解磺胺甲惡唑(SMX)的情況。

具體實施方式

2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽英文為,2-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明進(jìn)一步說明：

各實施例中：

馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂18g/L，自然pH，余量是水。

馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基為：馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，自然pH，余量是水。

發(fā)酵培養(yǎng)基用下述方法制成：取葡萄糖,1.0g/L；KH₂PO₄,1.0g/L；NaH₂PO₄,0.13g/L；2,2-二甲基琥珀酸1.0g/L；MgSO₄·7H₂O,0.5g/L；CuSO₄·5H₂O,0.01g/L；CaCl₂·2H₂O,0.05g/L；ZnSO₄·7H₂O,0.03g/L；MnSO₄·H₂O,0.02g/L；CoCl₂·6H₂O,0.001g/L；乙酸鈉1g/L，加水溶解，滅菌，得溶液一；取(NH₄)₂SO₄,0.5g/L；FeSO₄·7H₂O,0.01g/L；加水溶解，使用孔徑為0.22μm的濾膜過濾，得溶液二；將溶液一和溶液二混合，加足余量水。

實施例1

用血紅密孔菌降解磺胺類化合物的方法，包括如下步驟：

(1)種子培養(yǎng)：將保藏編號為CGMCC 5.815的血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基中，在28℃培養(yǎng)7天；再轉(zhuǎn)入馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中,在28℃培養(yǎng)48小時，得到血紅密孔菌一級種子；

(2)發(fā)酵培養(yǎng)：取步驟(1)獲得的血紅密孔菌的一級種子40mL，在8000rpm離心10min，棄上清，用460mL發(fā)酵培養(yǎng)基將菌體重懸，在28℃，130rpm條件下，發(fā)酵48h，漆酶酶活為0.85U/mL,見圖1；

(3)降解磺胺類化合物：將磺胺甲惡唑生產(chǎn)排放廢水與步驟(2)獲得的發(fā)酵液混合，使磺胺甲惡唑的濃度為50mg/L，加入2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽，使?jié)舛葹?.5mM，降解6h。(見圖2，圖2中的54小時是步驟(2)的48h和步驟(3)的6h之和)磺胺甲惡唑(SMX)降解率為100％。

實施例2

用血紅密孔菌降解磺胺類化合物的方法，包括如下步驟：

(1)種子培養(yǎng)：將保藏編號為CGMCC 5.815的血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基中，在25℃培養(yǎng)8天；再轉(zhuǎn)入馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中在25℃培養(yǎng)50小時，得到血紅密孔菌一級種子；

(2)發(fā)酵培養(yǎng)：取步驟(1)獲得的血紅密孔菌的一級種子45mL，在6000rpm離心12min，棄上清，用450mL發(fā)酵培養(yǎng)基將菌體重懸，在25℃，100rpm條件下，發(fā)酵50h；漆酶酶活為0.78U/mL；

(3)降解磺胺類化合物：將磺胺嘧啶生產(chǎn)排放廢水與步驟(2)獲得的發(fā)酵液混合，使磺胺嘧啶的濃度為20mg/L，加入2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽，使?jié)舛葹?.4mM，降解5h。

磺胺嘧啶降解率為100％。

實施例3

用血紅密孔菌降解磺胺類化合物的方法，包括如下步驟：

(1)種子培養(yǎng)：將保藏編號為CGMCC 5.815的血紅密孔菌(Pycnoporus sanguineus)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基中，在30℃培養(yǎng)6天；再轉(zhuǎn)入馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中在30℃培養(yǎng)45小時，得到血紅密孔菌一級種子；

(2)發(fā)酵培養(yǎng)：取步驟(1)獲得的血紅密孔菌的一級種子40mL，在10000rpm離心8min，棄上清，用500mL發(fā)酵培養(yǎng)基將菌體重懸，在30℃，150rpm條件下，發(fā)酵40h；漆酶酶活為0.92U/mL；

(3)降解磺胺類化合物：將磺胺異惡唑生產(chǎn)排放廢水與步驟(2)獲得的發(fā)酵液混合，使磺胺異惡唑的濃度為35mg/L，加入2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽，使?jié)舛葹?.6mM，降解8h。

磺胺異惡唑降解率為100％。

實驗證明，用磺胺二甲基嘧啶或磺胺二甲氧嘧啶替代本實施例的磺胺異惡唑，其它同本實施例，其降解率均為100％。

高效液相色譜所用色譜柱為C18色譜柱，所用儀器為Waters e2695Alliance HPLC和2489UV/Visible檢測器，檢測波長為265nm。檢測條件為：色譜柱溫度30℃，進(jìn)樣體積10μL，流速1mL·min-1。流動相組成：40％乙腈and 60％0.1％甲酸溶液。