本發(fā)明屬于海洋生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及擬海桑的化學(xué)成分提取方法。

背景技術(shù)：

擬海桑(Sonneratiaparacaseolaris)屬于海桑科海桑屬，為我國(guó)稀有瀕危紅樹(shù)植物，僅天然分布于海南島，分布范圍狹窄，個(gè)體數(shù)量稀少。正處于瀕危狀態(tài)，被列入《中國(guó)生物多樣性國(guó)情研究報(bào)告》中國(guó)被子植物瀕危及稀有種名錄。在前期的生物活性篩選實(shí)驗(yàn)中，擬海桑的甲醇提取物對(duì)小鼠白血病腫瘤細(xì)胞株P(guān)-388和人肝癌細(xì)胞株BEL-7402顯示較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。因此，本項(xiàng)目選擇擬海桑進(jìn)行細(xì)致的化學(xué)成分研究，期望發(fā)現(xiàn)海洋來(lái)源活性先導(dǎo)化合物。

擬海?；瘜W(xué)成分的研究只有一篇報(bào)道，2012年郭躍偉課題組對(duì)采自廣東湛江的擬海桑進(jìn)行化學(xué)成分研究，從中分離得到一個(gè)新骨架化合物ParacaseolideA(69)是一個(gè)二聚-烷基丁內(nèi)酯類(lèi)化合物內(nèi)酯甲素，體外藥理活性篩選顯示該化合物對(duì)細(xì)胞周期分裂蛋白25B具有顯著的抑制活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明旨在提供一種全面提取擬海桑中化學(xué)成分的方法。

擬海桑的化學(xué)成分提取方法，步驟如下：將擬海桑樣品粉碎后，室溫下用甲醇冷浸提取4次，每次浸泡3天；合并提取液，減壓濃縮，用無(wú)水甲醇脫鹽三次，得到總浸膏，經(jīng)100-200目的減壓硅膠柱層析，石油醚/丙酮梯度洗脫(100:1到1:2，v/v)，得到數(shù)個(gè)粗組分。

對(duì)粗組分進(jìn)行進(jìn)一步分離，包括以下步驟：

三萜類(lèi)化合物分離，經(jīng)300—400目硅膠柱層析(2×20cm，20g)用石油醚：丙酮25:1(4L)分離，進(jìn)一步用反相ODS進(jìn)行純化(2×9cm，10g)，用MeOH/H2O(v:v60:40，65:35，70:30，75:25，80:20，85:15，90:10，95:5，100:0，每個(gè)梯度200mL)分離，進(jìn)一步用半制備高效液相色譜HPLC分離純化(C18，MeOH，100%，1.5mL/min)，再經(jīng)過(guò)硅膠柱色譜(200–300mesh，3×20cm，50g)用石油醚：丙酮洗脫(v:v20:1，15:1，10:1，5:1，2:1，each1L)作為洗脫劑，繼續(xù)用硅膠柱進(jìn)行分離(200–300mesh，2×20cm，30g)用二氯甲烷：乙酸乙酯(v:v50:1，4L)進(jìn)行洗脫。

植醇的分離，經(jīng)300—400目硅膠柱層析(2×20cm，20g)用石油醚：丙酮25:1(4L)分離，進(jìn)一步用反相ODS進(jìn)行純化(2×9cm，10g)，用MeOH/H2O(v:v60:40，65:35，70:30，75:25，80:20，85:15，90:10，95:5，100:0，每個(gè)梯度200mL)分離，進(jìn)一步用半制備高效液相色譜HPLC分離純化(C18，MeOH，100%，1.5mL/min)。

甾醇類(lèi)化合物的分離，經(jīng)300—400目硅膠柱層析用石油醚：乙酸乙酯30:1，20:1，10:1，5:1，1:1進(jìn)行洗脫，進(jìn)一步用反相ODS進(jìn)行純化(2×9cm，10g)，用MeOH/H2O(v:v60:40，65:35，70:30，75:25，80:20，85:15，90:10，95:5，100:0，每個(gè)梯度200mL)分離，再用高效液相色譜HPLC分離純化(C18，MeOH，35%，1.5mL/min)。

倍半萜類(lèi)化合物的分離，經(jīng)300—400目硅膠柱層析用石油醚：乙酸乙酯30:1，20:1，10:1，5:1，1:1進(jìn)行洗脫，再用硅膠柱色譜進(jìn)行分離，用石油醚：丙酮20：1進(jìn)行洗脫，先用凝膠sephadexLH-20分離用氯仿：甲醇1:1洗脫后，進(jìn)一步用反相ODS進(jìn)行純化(2×9cm，10g)，用MeOH/H2O(v:v60:40，65:35，70:30，75:25，80:20，85:15，90:10，95:5，100:0，每個(gè)梯度200mL)分離，進(jìn)一步用半制備高效液相色譜HPLC分離純化(C18，MeOH，67%，1.5mL/min)。

脂肪酸的分離，首先用凝膠sephadexLH-20進(jìn)行除帶，用氯仿：甲醇1:1洗脫，獲得有點(diǎn)段，再進(jìn)行硅膠柱色譜的分離，200—300目硅膠，用石油醚：丙酮20:1，15:1，10:1，5:1，2:1進(jìn)行分離，再用半制備高效液相色譜HPLC分離純化(C18，MeOH，90%，1.5mL/min)。

木質(zhì)素類(lèi)化合物的分離，首先用凝膠sephadexLH-20進(jìn)行除帶，用氯仿：甲醇1:1洗脫，獲得有點(diǎn)段，再進(jìn)行硅膠柱色譜的分離，200—300目硅膠，用石油醚：丙酮20:1，15:1，10:1，5:1，2:1進(jìn)行分離，再用硅膠柱進(jìn)行分離，200—300目，洗脫體系為氯仿：乙酸乙酯50:1，，繼續(xù)用反相ODS(2×9cm，10g)進(jìn)行純化，用MeOH/H2O(v:v60:40，65:35，70:30，75:25，80:20，85:15，90:10，95:5，100:0，每個(gè)梯度200mL)分離，再用半制備高效液相色譜HPLC分離純化(C18，MeOH，80%，1.5mL/min)。

本發(fā)明利用薄層色譜、硅膠柱色譜、凝膠SephadexLH-20、高效液相色譜HPLC等現(xiàn)代色譜分離技術(shù)，通過(guò)NMR、ESIMS、IR和UV等現(xiàn)代波譜分析技術(shù)，從擬海桑Sonneratiaparacaseolaris中共分離得到了51個(gè)化合物，鑒定了47個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)，其中包括17個(gè)三萜類(lèi)化合物(SP-1~SP-17)、1個(gè)植醇化合物(SP-18)、7個(gè)甾醇類(lèi)化合物(SP-19~SP-25)、2個(gè)倍半萜類(lèi)化合物(SP-26~SP-27)、1個(gè)脂肪酸類(lèi)化合物SP-28、4個(gè)木質(zhì)素類(lèi)化合物(SP-29~SP-32)化合物、5個(gè)黃酮類(lèi)化合物(SP-33~SP-37)、7個(gè)苯類(lèi)衍生物(SP-39~SP-46)、1個(gè)鞣酸類(lèi)化合物SP-47以上全部化合物均為首次從該種中分離得到。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。

將擬海桑樣品粉碎后，室溫下用甲醇冷浸提取4次，每次浸泡3天；合并提取液，減壓濃縮，用無(wú)水甲醇脫鹽三次，得到總浸膏70g。經(jīng)100-200目的減壓硅膠柱層析，石油醚/丙酮梯度洗脫(100:1到1:2，v/v)，分為11個(gè)粗組分(Fr-1~Fr-11)。

三萜類(lèi)化合物SP-1~SP-17的分離

Fr.4(4.6121g)經(jīng)300—400目硅膠柱層析(2×20cm，20g)用石油醚：丙酮25:1(4L)獲得3個(gè)組分，F(xiàn)r.4.1–Fr.4.3，F(xiàn)r.4.2(570.4mg)進(jìn)一步用反相ODS進(jìn)行純化(2×9cm，10g)，用MeOH/H2O(v:v60:40，65:35，70:30，75:25，80:20，85:15，90:10，95:5，100:0，每個(gè)梯度200mL)獲得8個(gè)組分Fr.4.2.1–Fr.4.2.8。Fr.4.2.8(203mg)進(jìn)一步用半制備高效液相色譜HPLC分離純化(C18，MeOH，100%，1.5mL/min)獲得單體化合物SP-5(tR=46.8min，15.3mg)，16(tR=75.6min，4.4mg)和17(tR=80.0min，6.4mg)。Fr.7(1.637g)經(jīng)過(guò)硅膠柱色譜(200–300mesh，3×20cm，50g)用石油醚：丙酮洗脫(v:v20:1，15:1，10:1，5:1，2:1，each1L)作為洗脫劑，獲得4個(gè)組分Fr.7.1–Fr.7.4。Fr.7.4(1.264g)繼續(xù)用硅膠柱進(jìn)行分離(200–300mesh，2×20cm，30g)用二氯甲烷：乙酸乙酯(v:v50:1，4L)進(jìn)行洗脫獲得單體化合物SP-6(200.3mg，洗脫體積在3L到4L之間).Fr.8(1.525g)先經(jīng)過(guò)凝膠SephadexLH-20(3×75cm，500g)分離用MeOH洗脫得到6個(gè)組分(Fr.8.1–Fr.8.6)。Fr.8.2(125.3mg)經(jīng)過(guò)半制備高效液相色譜進(jìn)行分離純化(C18，MeOH/H2O，85:15，1.5mL/min)獲得化合物SP-7(tR=40.0min，10.8mg)，11(tR=47.1min，3.4mg)和13(tR=45.1min，10.8mg)。Fr.9(6.398g)首先經(jīng)過(guò)凝膠SephadexLH-20((3×75cm，500g)用MeOH進(jìn)行洗脫去除色帶和大分子糖類(lèi)然后進(jìn)一步用硅膠柱色譜進(jìn)行分離(200–300mesh，4×20cm，130g)用石油醚：丙酮(v:v20:1，10:1，5:1，2:1，each2L)洗脫獲得9個(gè)組分Fr.9.1–Fr.9.9。Fr.9.1(1.041g)通過(guò)硅膠柱(300–400mesh，2×20cm，25g)用二氯甲烷：乙酸乙酯(v:v50:1，40:1，30:1，20:1，10:1，5:1，2:1，each500mL)進(jìn)行洗脫，又獲得6個(gè)組分Fr.9.1.1–Fr.9.1.6。Fr.9.1.3進(jìn)一步用半制備高效液相色譜進(jìn)行純化(C18，MeOH/H2O，85:15，1.5mL/min)獲得化合物SP-12(tR=69.5min，4.2mg).Fr.9.1.5(200mg)用反相ODS柱進(jìn)行分離(RP-18，2×9cm，30g)用MeOH/H2O(40:60，50:50，60:40，70:30.80:20，90:10，100:0，each200mL)梯度洗脫，獲得8個(gè)組分Fr.9.1.5.1-Fr.9.1.5.8。Fr.9.1.5.6(57.4mg)用高效液相色譜RP-HPLC(C18，MeOH/H2O，80:20，1.5mL/min)進(jìn)行純化獲得單體化合物SP-8(tR=51.5min，9.8mg)和SP-10(tR=45.4min，1.3mg)，F(xiàn)r.9.1.5.7(101.3mg)也用半制備HPLC純化(C8，MeOH/H2O，84:16，1.5mL/min)獲得化合物SP-9(tR=59.8min，8.2mg)，SP-14(tR=92.1min，6.4mg)和SP-15(tR=69.5min，20.9mg)。Fr.9.4(664mg)首先通過(guò)硅膠柱色譜進(jìn)行分離(200–300mesh，1.5×20cm，13g)用石油醚：丙酮(v:v60:1，50:1，40:1，20:1，10:1，5:1，each100mL)進(jìn)行洗脫，獲得6個(gè)粗組分，F(xiàn)r.9.4.3(244.6mg)再進(jìn)一步用反相ODS(2×9cm，10g)進(jìn)行分離純化用MeOH/H2O(v:v50:50，60:40，70:30，80:20，90:10，100:0，each100mL)進(jìn)行梯度洗脫，然后用半制備高效液相色譜進(jìn)行純化(C8，MeOH/H2O，79:21，1.5mL/min)獲得化合物SP-1(tR=25.0min，8.4mg)，SP-2(tR=52.3min，16.8mg)，SP-3(tR=46.2min，2.1mg)和SP-4(tR=43.5min，5.5mg).

植醇SP-18的分離

Fr.4(4.6121g)經(jīng)300—400目硅膠柱層析(2×20cm，20g)用石油醚：丙酮25:1(4L)獲得3個(gè)組分，F(xiàn)r.4.1–Fr.4.3，F(xiàn)r.4.2(570.4mg)進(jìn)一步用反相ODS進(jìn)行純化(2×9cm，10g)，用MeOH/H2O(v:v60:40，65:35，70:30，75:25，80:20，85:15，90:10，95:5，100:0，每個(gè)梯度200mL)獲得8個(gè)組分Fr.4.2.1–Fr.4.2.8。Fr.4.2.5(45mg)進(jìn)一步用半制備高效液相色譜HPLC分離純化(C18，MeOH，100%，1.5mL/min)獲得單體化合物SP-18(tR=26.8min，17.1mg)，

甾醇類(lèi)化合物SP-19~SP-25的分離

Fr.6(約6g)經(jīng)300—400目硅膠柱層析用石油醚：乙酸乙酯30:1，20:1，10:1，5:1，1:1進(jìn)行洗脫，獲得6個(gè)組分，F(xiàn)r.6.1–Fr.6.6，F(xiàn)r.6.3(558.4mg)進(jìn)一步用反相ODS進(jìn)行純化(2×9cm，10g)，用MeOH/H2O(v:v60:40，65:35，70:30，75:25，80:20，85:15，90:10，95:5，100:0，每個(gè)梯度200mL)獲得8個(gè)組分Fr.6.3.1–Fr.6.3.8。Fr.6.3.2(48.4mg)進(jìn)一步用反相ODS進(jìn)行純化(2×9cm，10g)，用MeOH/H2O(v:v60:40，65:35，70:30，75:25，80:20，85:15，90:10，95:5，100:0，每個(gè)梯度200mL)獲得5個(gè)組分Fr.6.3.2.1–Fr.6.3.2.5。Fr.6.3.2.3進(jìn)一步用半制備高效液相色譜HPLC分離純化(C18，MeOH，98%，1.5mL/min)獲得單體化合物SP-19(tR=43min，4.5mg)和SP-20(tR=47min，10.8mg)。Fr.6.4(1.149g)先用硅膠柱色譜進(jìn)行分離，用石油醚：丙酮20：1進(jìn)行洗脫，分為4個(gè)組分Fr.6.4.1–Fr.6.4.4，從Fr.6.4.1中分離得到化合物SP-21(4.2mg)和SP-22(4.7mg)。Fr.6.4.3進(jìn)一步用反相ODS進(jìn)行純化(2×9cm，10g)，用MeOH/H2O(v:v60:40，65:35，70:30，75:25，80:20，85:15，90:10，95:5，100:0，每個(gè)梯度200mL)獲得3個(gè)組分Fr.6.4.3.1–Fr.6.4.3.3。Fr.6.4.3.2(34.5mg)進(jìn)一步用半制備高效液相色譜HPLC分離純化(C18，MeOH，93%，1.5mL/min)獲得單體化合物SP-23(tR=43min，4.5mg)，SP-24(tR=47min，10.8mg)和SP-25(tR=50min，3.8mg)。

倍半萜類(lèi)化合物SP-26~SP-27的分離

Fr.6(約6g)經(jīng)300—400目硅膠柱層析用石油醚：乙酸乙酯30:1，20:1，10:1，5:1，1:1進(jìn)行洗脫，獲得6個(gè)組分，F(xiàn)r.6.1–Fr.6.6，F(xiàn)r.6.4(1.149g)先用硅膠柱色譜進(jìn)行分離，用石油醚：丙酮20：1進(jìn)行洗脫，分為4個(gè)組分Fr.6.4.1–Fr.6.4.4，F(xiàn)r.6.4.2先用凝膠sephadexLH-20分離用氯仿：甲醇1:1洗脫后，進(jìn)一步用反相ODS進(jìn)行純化(2×9cm，10g)，用MeOH/H2O(v:v60:40，65:35，70:30，75:25，80:20，85:15，90:10，95:5，100:0，每個(gè)梯度200mL)獲得5個(gè)組分Fr.6.4.2.3.1–Fr.6.4.2.3.5。Fr.6.4.2.3.2(56mg)進(jìn)一步用半制備高效液相色譜HPLC分離純化(C18，MeOH，67%，1.5mL/min)獲得單體化合物SP-26(tR=43min，9.8mg)。Fr.7(約2.4g)首先用凝膠sephadexLH-20進(jìn)行除帶，用氯仿：甲醇1:1洗脫，獲得有點(diǎn)段1.6272g，再進(jìn)行硅膠柱色譜的分離，200—300目硅膠，用石油醚：丙酮20:1，15:1，10:1，5:1，2:1進(jìn)行分離，獲得6段，F(xiàn)r.7.1–Fr.7.6，第三段Fr.7.3（218.5mg）用反相ODS進(jìn)行分離，用MeOH/H2O(v:v70:30，75:25，80:20，85:15，90:10，95:5，100:0，每個(gè)梯度200mL)獲得5個(gè)組分Fr.7.3.1–Fr.7.3.5，F(xiàn)r.7.3.1（15.6mg）用半制備高效液相色譜HPLC分離純化(C18，MeOH，72%，1.5mL/min)獲得單體化合物SP-27(2.2mg)。

脂肪酸SP-28的分離

Fr.7(約2.4g)首先用凝膠sephadexLH-20進(jìn)行除帶，用氯仿：甲醇1:1洗脫，獲得有點(diǎn)段1.6272g，再進(jìn)行硅膠柱色譜的分離，200—300目硅膠，用石油醚：丙酮20:1，15:1，10:1，5:1，2:1進(jìn)行分離，獲得6段，F(xiàn)r.7.1–Fr.7.6，F(xiàn)r.7.1（80.5mg）用半制備高效液相色譜HPLC分離純化(C18，MeOH，90%，1.5mL/min)獲得單體化合物SP-28(5.9mg)。木質(zhì)素類(lèi)化合物SP-29~SP-32的分離Fr.7(約2.4g)首先用凝膠sephadexLH-20進(jìn)行除帶，用氯仿：甲醇1:1洗脫，獲得有點(diǎn)段1.6272g，再進(jìn)行硅膠柱色譜的分離，200—300目硅膠，用石油醚：丙酮20:1，15:1，10:1，5:1，2:1進(jìn)行分離，獲得6段，F(xiàn)r.7.1–Fr.7.6，F(xiàn)r.7.4（1.2642g）先用硅膠柱進(jìn)行分離，200—300目，洗脫體系為氯仿：乙酸乙酯50:1，分為6個(gè)組分Fr.7.4.1~Fr.7.4.6。Fr.7.4.4繼續(xù)用反相ODS(2×9cm，10g)進(jìn)行純化，用MeOH/H2O(v:v60:40，65:35，70:30，75:25，80:20，85:15，90:10，95:5，100:0，每個(gè)梯度200mL)獲得7個(gè)組分Fr.7.4.4.1~Fr.7.4.4.7。Fr.7.4.4.3用半制備高效液相色譜HPLC分離純化(C18，MeOH，80%，1.5mL/min)獲得單體化合物SP-29(14.6mg)。Fr.8(約2g)首先用凝膠sephadexLH-20進(jìn)行除帶，用石油醚：氯仿：甲醇20:10:1進(jìn)行洗脫，獲得有點(diǎn)段1.525g，再進(jìn)行硅膠柱色譜和凝膠sephadexLH-20的進(jìn)一步分離，獲得6段，F(xiàn)r.8.1–Fr.8.6，F(xiàn)r.8.5（170.4mg）再繼續(xù)用反相ODS(2×9cm，10g)進(jìn)行純化，用MeOH/H2O(v:v60:40，65:35，70:30，75:25，80:20，85:15，90:10，95:5，100:0，每個(gè)梯度200mL)獲得主斑點(diǎn)（26.8mg）再用半制備高效液相色譜HPLC分離純化(C18，MeOH，60%，1.5mL/min)獲得單體化合物SP-30(2mg)和SP-31(6.7mg)。Fr.9(6.398g)首先經(jīng)過(guò)凝膠SephadexLH-20((3×75cm，500g)用MeOH進(jìn)行洗脫去除色帶和大分子糖類(lèi)然后進(jìn)一步用硅膠柱色譜進(jìn)行分離(200–300mesh，4×20cm，130g)用石油醚：丙酮(v:v20:1，10:1，5:1，2:1，each2L)洗脫獲得9個(gè)組分Fr.9.1–Fr.9.9。Fr.9.1(1.041g)通過(guò)硅膠柱(300–400mesh，2×20cm，25g)用二氯甲烷：乙酸乙酯(v:v50:1，40:1，30:1，20:1，10:1，5:1，2:1，each500mL)進(jìn)行洗脫，又獲得6個(gè)組分Fr.9.1.1–Fr.9.1.6。Fr.9.1.5用反相ODS(2×9cm，10g)進(jìn)行分離，用MeOH/H2O(v:v60:40，65:35，70:30，75:25，80:20，85:15，90:10，95:5，100:0，每個(gè)梯度200mL)獲得8個(gè)組分Fr.9.1.5.1~Fr.9.1.5.8，F(xiàn)r.9.1.5.2利用薄層制備方法進(jìn)行分離，用硅膠30g，CMCNa120mL鋪制備板，大小為20×20cm，展開(kāi)體系為:石油醚：丙酮1:1展開(kāi)，分為5段Fr.9.1.5.2.1~Fr.9.1.5.2.6，F(xiàn)r.9.1.5.2.6進(jìn)一步用半制備高效液相色譜進(jìn)行純化(C18，MeOH/H2O，58%，1.5mL/min)獲得化合物SP-32(1.4mg)。