本發(fā)明涉及生命醫(yī)學(xué)檢測及疾病診斷領(lǐng)域，尤其涉及一種微流控芯片系統(tǒng)，以及應(yīng)用該微流控芯片系統(tǒng)進(jìn)行等溫擴增與檢測的方法。

背景技術(shù)：

PCR(Polymerase chain reaction)技術(shù)是一種最典型的核酸擴增方法，是分子生物學(xué)中最為核心的技術(shù)手段之一。它是以擴增周期為單位進(jìn)行循環(huán)，每一個擴增周期包括變性階段(94度，約15秒)、退火階段(60度，約30秒)和延伸階段(72度，約45秒)，擴增過程就是由幾十個或更多這樣的擴增周期不斷循環(huán)來完成，一般需要2-3小時完成。PCR技術(shù)具有靈敏度高、特異性好的特點，但是存在擴增時間較長，溫度控制復(fù)雜。

核酸等溫擴增技術(shù)在恒定溫度下就可以實現(xiàn)擴增，沒有復(fù)雜的溫度循環(huán)，無需高溫變性和低溫退火過程，不存在溫度變化引起的時間損耗，因此其擴增速度非常快。核酸等溫擴增技術(shù)中最具有代表性的如環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，它是一種新的核酸擴增方法。該技術(shù)依賴于自動循環(huán)的鏈置換反應(yīng)，在等溫條件(60℃-65℃)下，1h內(nèi)即能擴增1×10⁹拷貝的靶序列。LAMP技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、快速和操作簡單、耗時短、設(shè)備簡單等優(yōu)點。

微流控芯片在微尺度空間下，借助各類功能單元來完成生物化學(xué)反應(yīng)所需的多個反應(yīng)步驟，為生物醫(yī)學(xué)診斷、分析化學(xué)、生命科學(xué)等領(lǐng)域提供了一個具有獨到優(yōu)勢的技術(shù)平臺。除了有利于實現(xiàn)整個檢測、分析、診斷過程的自動化外，微流控芯片的反應(yīng)器體積往往要顯著小于傳統(tǒng)的反應(yīng)試管，這既節(jié)省了反應(yīng)試劑，同時也有利于減少反應(yīng)時間。因此，基于微流控芯片的等溫擴增方法正日益受到各國科研人員的關(guān)注?；谖⒘骺丶夹g(shù)，一方面可以減少等溫擴增所需的反應(yīng)時間與試劑消耗，另一方面，有利于實現(xiàn)高通量檢測，提高檢測效率。因此，基于新型的加熱及溫控技術(shù)實現(xiàn)簡化的高通量等溫擴增，一方面有利于提高核酸檢測的效率，另一方面有利于降低裝置復(fù)雜度及核酸檢測的成本。

目前大多數(shù)LAMP反應(yīng)在離心管里進(jìn)行，而且檢測方法大多都是需要昂貴的、攜帶不方便的儀器。因此設(shè)計一種結(jié)合核酸等溫擴增技術(shù)的、集成本低、可攜帶、適用于現(xiàn)場檢測等特點于一身的微流控芯片系統(tǒng)顯得尤為重要。

PCR技術(shù)存在擴增時間較長，溫度控制復(fù)雜等技術(shù)缺陷。PCR法具有較高的敏感性和特異性，但它對DNA模板的要求較高，需要昂貴的PCR儀，對操作人員的熟練程度和專業(yè)水平的要求較高，這就需要研究新的檢測技術(shù)。

等溫擴增不需要復(fù)雜的溫度控制，對DNA模板的要求也不太高，是非常好的一種替代PCR的一種新的核酸擴增技術(shù)。然而，目前進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫擴增多利用PCR儀器或者熒光定量PCR儀，但這種設(shè)備價格昂貴，體積較大，不適合于現(xiàn)場快速檢測。

另一方面，等溫擴增的結(jié)果檢測主要有熒光方法、濁度方法等，熒光方法的檢測靈敏度通常比濁度方法高，其系統(tǒng)也相對復(fù)雜一些。熒光方法中，實時熒光定量PCR儀就是其中重要的核酸擴增實時檢測儀器，不過目前這類儀器主要使用離心管，需要20μL以上反應(yīng)體系，檢測靈敏度通常在1000個核酸分子拷貝數(shù)以上，儀器價格也比較昂貴。

目前，利用微流控芯片做等溫擴增反應(yīng)，存在進(jìn)出口密封處理不太完善的技術(shù)缺陷。有報道采用未完全固化的聚二甲基硅氧烷(Poly dimethylsiloxane)PDMS片密封PDMS微流控芯片的進(jìn)出口。未完全固化的PDMS片不易長期保存，可與未完全固化的PDMS片密封的材料也收到限制，密封效果較好的主要是玻璃和PDMS，特別是各種塑料密封困難。此外，如果在進(jìn)出口處遺留一點液體將導(dǎo)致密封失敗。然后，微流控芯片進(jìn)出口的嚴(yán)格密封不但對于等溫擴增非常必要，而且也防止擴增產(chǎn)物擴散導(dǎo)致下次反應(yīng)的假陽性測定。目前的芯片的密封方式不利于現(xiàn)場、便攜式使用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種微流控芯片系統(tǒng)，以及應(yīng)用該微流控芯片系統(tǒng)進(jìn)行等溫擴增與檢測的方法。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供一種微流控芯片系統(tǒng)，包括微流控芯片和溫控模塊，其特征在于：

所述微流控芯片包括基片、結(jié)構(gòu)片和蓋片，其中，

所述基片位于微流控芯片的底部；

所述結(jié)構(gòu)片設(shè)置在基片之上，包含反應(yīng)池；

所述蓋片被配置為覆蓋于所述結(jié)構(gòu)片上，與結(jié)構(gòu)片之間形成一密封腔，該密封腔下部為所述反應(yīng)池，所述蓋片在構(gòu)成密封腔的一側(cè)固化有切片石蠟；

所述溫控模塊配置為與所述微流控芯片固定，用于對所述反應(yīng)池內(nèi)反應(yīng)物進(jìn)行加熱、溫度測量和溫度控制。

根據(jù)本發(fā)明的一具體實施方案，所述溫控模塊包括加熱單元、測溫單元和控溫單元，其中，所述加熱單元包括電阻加熱片，用于對反應(yīng)池內(nèi)反應(yīng)物進(jìn)行加熱；所述測溫單元包括溫度傳感器，用于對所述反應(yīng)池內(nèi)反應(yīng)物進(jìn)行溫度測量；所述控溫單元包括PID、繼電器和開關(guān)電源，用于對所述反應(yīng)池內(nèi)反應(yīng)物進(jìn)行溫度控制。

根據(jù)本發(fā)明的一具體實施方案，微流控芯片系統(tǒng)還包括檢測模塊，包括光源、檢測器和控制單元，用于對反應(yīng)池內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行檢測。

根據(jù)本發(fā)明的一具體實施方案，所述光源為LED光源，所述檢測器為光電二極管，所述控制單元分光鏡、檢測單元和信號輸出部分。

根據(jù)本發(fā)明的一具體實施方案，微流控芯片系統(tǒng)還包括機械支撐結(jié)構(gòu)，所述機械支撐結(jié)構(gòu)用于將所述檢測模塊固定在溫控模塊上，還用于調(diào)節(jié)檢測模塊的垂直位移和水平位移。

根據(jù)本發(fā)明的一具體實施方案，所述微流控芯片的數(shù)量為多個。

根據(jù)本發(fā)明的一具體實施方案，所述切片石蠟的熔點為40-60℃。

根據(jù)本發(fā)明的一具體實施方案，所述蓋片為透明材料。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供應(yīng)用以上所述的微流控芯片系統(tǒng)進(jìn)行等溫擴展檢測的方法，其中包括：

向反應(yīng)池中滴加反應(yīng)液進(jìn)行等溫擴增反應(yīng)，再滴加液體石蠟；

蓋上蓋片，將微流控芯片固定在溫控模塊上；

溫控模塊加熱后，蓋片上的切片石蠟融化充滿微流控芯片的密封腔；

在反應(yīng)時，進(jìn)行實時觀測，通過顏色比對判斷是否為陽性反應(yīng)；

反應(yīng)結(jié)束后，停止加熱，切片石蠟迅速固化密封。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，還提供應(yīng)用以上所述微流控芯片系統(tǒng)進(jìn)行等溫擴展檢測的方法，包括：

向反應(yīng)池中滴加反應(yīng)液進(jìn)行等溫擴增反應(yīng)，再滴加液體石蠟；

蓋上蓋片，將微流控芯片固定在溫控模塊上；

采用溫控模塊加熱，蓋片上的切片石蠟融化充滿微流控芯片的密封腔；

在反應(yīng)時，采用檢測模塊進(jìn)行實時熒光檢測，獲得熒光曲線；

反應(yīng)結(jié)束后，停止加熱，切片石蠟迅速固化密封。

通過上述技術(shù)方案，可以看出本發(fā)明的有益效果在于：

(1)通過提供包括微流控芯片、溫控模塊、檢測模塊和機械支撐結(jié)構(gòu)四個部分的系統(tǒng)，可以進(jìn)行定量檢測，對某一微流控芯片上的某一個反應(yīng)進(jìn)行全程的實時熒光定量檢測，同時在反應(yīng)結(jié)束后，可以對每一個微流控芯片上的每一個反應(yīng)池進(jìn)行最終的熒光檢測，獲得定量的檢測結(jié)果，實現(xiàn)高通量的LAMP定量熒光檢測，滿足多樣品同時檢測的需求；

(2)通過提供溫控模塊和一次性使用微流控芯片，可以進(jìn)行定性檢測，可直接比對顏色初步判斷是否為陽性反應(yīng)(具體來說，就是通過眼睛觀察對比陰性、陽性和待測樣品反應(yīng)的顏色變化，定性判斷待測樣品反應(yīng)是否為陽性反應(yīng))；

(3)本發(fā)明的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單，適合現(xiàn)場、基層快速檢測，檢測儀器小巧，非常方便現(xiàn)場使用，同時成本低，社區(qū)醫(yī)院、鄉(xiāng)村醫(yī)院、甚至的家庭都可以使用；

(4)應(yīng)用該系統(tǒng)進(jìn)行等溫擴增檢測，可以非常好的確保LAMP在完全密封的情況下進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后，溫度變?yōu)槭覝兀衅炞詣幽谭乐挂后w泄漏，完全避免了擴增產(chǎn)物的泄漏，有效預(yù)防假陽性產(chǎn)生。

附圖說明

圖1是本發(fā)明一實施例的微流控芯片系統(tǒng)示意圖。

圖2是本發(fā)明一實施例的微流控芯片剖面示意圖。

圖3是本發(fā)明一實施例的檢測模塊和微流控芯片的光路與位置示意圖。

圖4是采用本發(fā)明一實施例的微流控芯片系統(tǒng)進(jìn)行LAMP反應(yīng)的實時熒光檢測結(jié)果圖。

具體實施方式

為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合具體實施例，并參照附圖，對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。下述參照附圖對本發(fā)明實施方式的說明旨在對本發(fā)明的總體發(fā)明構(gòu)思進(jìn)行解釋，而不應(yīng)當(dāng)理解為對本發(fā)明的一種限制。

根據(jù)本發(fā)明總體上的發(fā)明構(gòu)思，提供一種微流控芯片系統(tǒng)，包括微流控芯片，微流控芯片包括結(jié)構(gòu)片和蓋片，結(jié)構(gòu)片包含反應(yīng)池；蓋片上被配置為覆蓋于所述結(jié)構(gòu)片上，與結(jié)構(gòu)片之間形成一密封腔，該密封腔下部為所述反應(yīng)池，所述蓋片在構(gòu)成密封腔的一側(cè)固化有切片石蠟；反應(yīng)池內(nèi)擴增反應(yīng)結(jié)束后，切斷溫度，隨著溫度的下降切片石蠟迅速固化密封，完全避免了擴增產(chǎn)物的泄漏，有效預(yù)防假陽性產(chǎn)生。

以下將結(jié)合附圖對本實施例的微流控芯片系統(tǒng)的各組成部分進(jìn)行詳細(xì)說明。

圖1為本實施例的微流控芯片系統(tǒng)示意圖。包括微流控芯片2和溫控模塊3，還可以包括檢測模塊1和機械支撐結(jié)構(gòu)4。

其中，微流控芯片2的結(jié)構(gòu)和組成參見圖2所示，其包括基片26、結(jié)構(gòu)片23和蓋片21，結(jié)構(gòu)片包括有反應(yīng)池25和密封腔24，蓋片上有切片石蠟22。本實施例中的基片26可以是玻璃、PDMS、塑料、金屬等材質(zhì)，結(jié)構(gòu)上可以是獨立結(jié)構(gòu)，也可以與結(jié)構(gòu)片是一個整體結(jié)構(gòu)。

本實施例中的結(jié)構(gòu)片23包括1-4個反應(yīng)池，容積為6-20微升，優(yōu)選為10微升，密封腔，容積為30-60微升，優(yōu)選為40微升。

本實施例中蓋片是玻璃、PDMS等透明材質(zhì)，在對應(yīng)密封腔的位置固化有切片石蠟(熔點在等溫擴增溫度之下，即在等溫擴增反應(yīng)與檢測時為透明液體，便于檢測；常溫是固體，便于密封。)熔點小于60攝氏度，優(yōu)選為48-50攝氏度。目的是在等溫擴展反應(yīng)室熔化成液態(tài)，而在反應(yīng)停止后冷卻到一定溫度以下后變?yōu)楣虘B(tài)，起到密封效果。

優(yōu)選的，在本實施例中可以同時反應(yīng)1個微流控芯片，也可以同時反應(yīng)多個微流控芯片。

參見圖2所示，本實施例典型的加熱片大小為：70mm長×30mm寬，可以同時對3個微流控芯片加熱。

但需要說明的是以上只是典型尺寸，可以根據(jù)實際情況有所變化。

其中，溫控模塊3配置為與所述微流控芯片2固定，用于對所述反應(yīng)池內(nèi)反應(yīng)物進(jìn)行加熱、溫度測量和溫度控制。其包括加熱單元、測溫單元和控溫單元。具體的，溫控模塊3可包括加熱模塊，溫度傳感器，PID、繼電器和開關(guān)電源組成的控溫單元。

本實施例中，典型的加熱模塊是電阻加熱片，典型的溫度傳感器是貼片式Pt100測溫元件。在電子加熱片有一套可移動的機械卡栓，用于固定微流控芯片，使其微流控芯片的反應(yīng)池在檢測模塊1中的檢測窗口的正下方，同時可調(diào)節(jié)X軸位置。

參見圖1所示，整個溫控模塊的典型尺寸為：210mm長×150mm寬×70mm高。

但需要說明的是以上只是典型尺寸，可以根據(jù)實際情況有所變化。其中，檢測模塊1包括光源、檢測器和控制單元，用于對反應(yīng)池內(nèi)的反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行檢測。具體的可包括光源、檢測器和控制單元。

本實施中，典型的光源是LED光源，檢測器是光電二極管，控制單元包括分光鏡、檢測窗口、電源、信號輸出等部分，采用軟件控制，檢測結(jié)果直接在電腦上實時顯示。

參見圖1所示，檢測模塊的典型尺寸為：60mm長×20mm寬×100mm高。相應(yīng)的整個系統(tǒng)的典型尺寸為：60mm長×20mm寬×200mm高。

但需要說明的是以上只是典型尺寸，可以根據(jù)實際情況有所變化。

其中，機械支撐結(jié)構(gòu)4用于將所述檢測模塊1固定在溫控模塊3上，還用于調(diào)節(jié)檢測模塊3的垂直位移和水平位移。

本實施例中，機械支撐結(jié)構(gòu)4固定檢測模塊1在溫控模塊3上，同時可以通過機械支撐結(jié)構(gòu)4調(diào)節(jié)檢測模塊1在Z軸方向的位置，以控制檢測窗口與微流控芯片反應(yīng)池的在Z軸上的距離?？梢酝ㄟ^機械支撐結(jié)構(gòu)4調(diào)節(jié)檢測模塊1在X和Y軸方向的位置，也可以通過溫控模塊3中的可移動機械卡栓來調(diào)節(jié)微流控芯片在X和Y軸方向的位置，也可以二者配合調(diào)節(jié)，目的是使得檢測窗口可以與任何一個微流控芯片中的任何一個反應(yīng)池相對應(yīng)。

基于同一發(fā)明構(gòu)思，還提供一種根據(jù)上述微流控芯片系統(tǒng)進(jìn)行等溫擴增反應(yīng)的方法。

圖3為本發(fā)明一實施例的檢測模塊和微流控芯片的光路與位置示意圖?？梢砸淮螜z測一個微流控芯片中的一個反應(yīng)池，可以通過調(diào)節(jié)加熱片上的可移動機械卡栓確定檢測某一個微流控芯片上的某一個反應(yīng)池。將檢測器檢測到的光信號通過轉(zhuǎn)換輸入到電腦中(參見圖1所示)，實時顯示反應(yīng)池中的熒光信號。

具體操作中，在微流控芯片中滴加反應(yīng)液到反應(yīng)池25中，再滴加液體石蠟(常溫液體狀態(tài))充滿反應(yīng)池25部分，部分液體石蠟進(jìn)入密封腔24；然后蓋上蓋片，將該芯片放置在加熱單元的卡槽內(nèi)固定，打開溫控單位，開始加熱，恒溫在60-65攝氏度范圍內(nèi)。蓋片上的切片石蠟22(常溫固體，熔點小于60攝氏度，優(yōu)選為48-50攝氏度)迅速熔化充滿微流控芯片的密封腔。擴增反應(yīng)結(jié)束，檢測結(jié)束后，切斷溫度，隨著溫度的下降切片石蠟迅速固化密封。

通過進(jìn)行實時熒光檢測，獲得熒光曲線(參見圖4所示)。圖4是采用本發(fā)明一實施例的微流控芯片系統(tǒng)進(jìn)行LAMP反應(yīng)的實時熒光檢測結(jié)果圖。圓點表示陽性反應(yīng)的熒光實時定量檢測散點圖，在13分鐘處起峰，開始迅速擴增；三角表示陰性對照反應(yīng)的熒光實時定量檢測散點圖，熒光光強未見明顯改變。

上述是本發(fā)明的定量檢測，下面是可替代技術(shù)方案，一種定性檢測方案。

對于定性檢測，可以不需要檢測模塊1和機械支撐結(jié)構(gòu)4；溫控模塊3中的機械卡栓只是用于固定微流控芯片，不需要移動。另外，也不需要電腦，直接溫控模塊面板控制，肉眼檢測，至少同時進(jìn)行3個反應(yīng)適用，其中一個是待測反應(yīng)，另外兩個為陽性和陰性對照，直接比對顏色初步判斷是否為陽性反應(yīng)。

上述檢測采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)，其能在等溫(60～65℃)條件下，在恒溫條件下進(jìn)行擴增反應(yīng)，可在15～60分鐘內(nèi)實現(xiàn)10⁹～10¹⁰倍的擴增，是一種“簡便、快速、精確、低價”的基因擴增方法。LAMP是一種全新的核酸擴增方法，具有簡單、快速、特異性強的特點。

以上所述的具體實施例，對本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果進(jìn)行了進(jìn)一步詳細(xì)說明，應(yīng)理解的是，以上所述僅為本發(fā)明的具體實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。