本發(fā)明涉及本發(fā)明涉及手性藥物拆分技術領域，具體地說，是一種多柱模擬移動床色譜技術連續(xù)分離氨魯米特外消旋體的方法。

背景技術：

氨魯米特，化學名為3-乙基-3-(4-氨基苯基)-2,6-哌啶二酮，英文化學名為3-ethyl-3-(4-aminophenyl)-2,6-piperidinedione。氨魯米特是外消旋體化合物，有一對對映體，分別稱為R-氨魯米特對映體和S-氨魯米特對映體，分子結(jié)構式分別為：

氨魯米特由瑞士Novartis公司研制，最早于1955年以抗驚厥藥的形式出現(xiàn)在市場上。到了60年代，研究發(fā)現(xiàn)它還具有抑制腎上腺甾體激素的效果，被廣泛用于治療乳腺癌以及皮質(zhì)醇增多癥(柯興綜合征)。與另一種乳腺癌治療藥物莫昔芬相比，氨魯米特無交叉耐藥性，常用于二、三線內(nèi)分泌治療，并且取得一定療效。但是外消旋氨魯米特用作藥物時副作用明顯，會出現(xiàn)食欲不振、腹脹、腹瀉、頭暈等不良反應。根據(jù)相關藥物動力學和毒理學研究發(fā)現(xiàn)，該藥物的兩種異構體中，R型對映體對甾體激素抑制作用的效果為外消旋氨魯米特的2至3倍，且毒副作用能明顯降低；而S型對映體的甾體激素抑制作用很弱，即使在劑量水平高10倍的情況下藥效仍然很低。從用藥安全和新藥研發(fā)角度考慮，對外消旋氨魯米特進行制備拆分研究具有重要意義。

氨魯米特單一對映體的制備可通過化學合成法制得。Fadel等提出了由苯丙二酸為初始原料合成氨魯米特單一對映體，在豬肝酯酶的作用下進行選擇性水解，再由水解后的化合物經(jīng)一系列加成還原反應，最終得到R-氨魯米特對映體，產(chǎn)率為79％(Fadel A.,Garcia-Argote S.Asymmetric construction of benzylic quaternary carbons from chiral malonates:Formal synthesis of both(-)-and(+)-aminoglutethimides AG and analogues[J].Tetrahedron:Asymmetry,1996,7(4):1159–1166.)。Bunegr.等報道了以對硝基氯芐為原料合成高純R-氨魯米特對映體，最終收獲到純度高達99.9％的R型氨魯米特對映體(Bunegar M.J.,Dyer U.C.,Evans G.R.,Hewitt R.P.Production of(R)-Aminoglutethimide:A New Route from1-Chloro-4-nitrobenzene[J].Org Process Res Dev,1999,3(6):442-450.)。文獻中報道較多的另一種拆分方法為色譜法，Elbashira等研究了毛細管電泳法分離氨魯米特對映體，采用熔融石英毛細管，手性固定相為甲基化的β-環(huán)糊精，濃度為30mg/ml。電解質(zhì)濃度為50mmol/L、pH等于3.0的三異丙基乙磺酰-磷酸鹽緩沖溶液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩對映體在9min以內(nèi)即可實現(xiàn)分離，分離度為2.1(Elbashir A.A.,Suliman F.E.O.,Saad B.,Aboul-Enein H.Y.Determination of aminoglutethimide enantiomers in pharmaceutical formulations by capillary electrophoresis using methylated-β-cyclodextrin as a chiral selector and computational calculation for their respective inclusion complexes[J].Talanta,2009,77(4):1388-1393)。Ali等使用Chiralpak IA手性柱和Chiralpak IB手性柱分別在甲基叔丁醚-THF(90:10,v/v)、100％二氯甲烷和100％乙腈三種溶劑組成中拆分氨魯米特外消旋體，結(jié)果表明在三組溶劑組成的流動相中Chiralpak IA柱均能實現(xiàn)拆分，分離度分別為4.19、2.27和1.88，而Chiralpak IB柱不能拆分(Ali I.,Naim L.,Ghanem A.,Aboul Enein H.Y.Chiral separations of piperidine-2,6-dione analogues on Chiralpak IA and Chiralpak IB columns by using HPLC[J].Talanta,2006,69(4):1013–1017)。Aboul-Enein等分別使用Chiralcel OD和Chiralcel OJ兩種手性固定相拆分了氨魯米特外消旋體，結(jié)果表明兩種手性固定相均能拆分。Chiralcel OD在流動相正己烷/異丙醇＝60:40時，分離度為8.87；Chiralcel OJ在流動相正己烷/異丙醇＝50:50時，分離度達到10.34(Aboul-Enein H.Y.,Islam M.R.Direct chromatographic resolution of racemic aminoglutethimide and its acetylated metabolite using different cellulose based chiral stationary phases[J].Chromatographia,1990,30(3-4):223-227)。該作者還在萬古霉素Chirobiotic V手性柱上，分別使用正相體系乙醇/正己烷(25/75,v/v)和反相體系乙腈/硝酸銨水溶液(10:90,v/v)的流動相對氨魯米特對映體進行拆分，結(jié)果顯示兩種流動性下均不能拆分(Aboul-Enein H.Y.,Serignese V.Enantiomeric separation of several cyclic imides on a macrocyclic antibiotic(vancomycin)chiral stationary phase under normal and reversed phase conditions[J].Chirality,1998,10(4):358-361)。E.R.Francotte等在1997年使用SMB色譜技術對氨魯米特對映體進行了拆分，采用16根Chiracel OJ柱串聯(lián)，流動相為15/85的正己烷/乙醇混合物，對濃度為16mg/ml氨魯米特外消旋體拆分，獲得純度為99.8％的S型氨魯米特對映體和純度為99.9％的R型氨魯米特對映體，產(chǎn)率為每千克手性固定相每天能夠得到60克單一對映體，拆分每克氨魯米特外消旋體溶劑消耗量為1.48升(Francotte E.R.,Richert P.Applications of simulated moving-bed chromatography to the separation of the enantiomers of chiral drugs[J].Journal of Chromatography A,1997,769(1):101–107)。

目前，已有消旋氨魯米特的合成與色譜拆分方法研究較多，但是規(guī)?；B續(xù)化的工藝還欠缺。

技術實現(xiàn)要素：

因此，本發(fā)明要解決的技術問題在于提供一種多柱模擬移動床色譜技術連續(xù)分離氨魯米特外外消旋體的方法。

本發(fā)明的技術方案是，一種多柱模擬移動床色譜技術連續(xù)分離氨魯米特外消旋體的方法，該方法包括：

(1)針對氨魯米特外消旋體的拆分，選擇流動相和手性固定相，所述流動相為乙醇、正己烷和乙醇胺的混合物；所述手性固定相為涂敷纖維素-三(3,5)-二甲基苯基氨基甲酸酯的硅膠；

(2)構建多柱模擬移動床構態(tài)，確定每個區(qū)填充柱數(shù)，并確定模擬移動床操作模式；

(3)基于實驗測量氨魯米特對映體吸附平衡和吸附動力學數(shù)據(jù)，依據(jù)三角理論和各區(qū)液固流速限制條件，設計模擬移動床分離區(qū)，設計限制條件為單一氨魯米特對映體純度達到預期設定值；

(4)基于設計模擬移動床分離操作區(qū)，確定各區(qū)填充柱內(nèi)流速、進出物料流速、進料濃度、切換時間和操作溫度等操作條件；操作溫度為20～60℃；

(5)實施模擬移動床分離氨魯米特外消旋體；這是一個動態(tài)吸附分離體系，需要多個循環(huán)，操作系統(tǒng)才能達到穩(wěn)定狀態(tài)；當系統(tǒng)達到穩(wěn)定后，在萃取口得到高純度R-氨魯米特對映體，在萃余口得到高純度S-氨魯米特對映體；

(6)在模擬移動床萃取口得到高純度R-氨魯米特對映體溶液和在萃余口得到高純度S-氨魯米特對映體溶液，這些溶液再經(jīng)過濃縮、重結(jié)晶、過濾、干燥，得到高純度R-氨魯米特對映體和S-氨魯米特對映體粉體產(chǎn)品。

依據(jù)三角理論，采用數(shù)學模型計算得到模擬移動床分離區(qū)。上述循環(huán)是指進出口閥門多次切換，。系統(tǒng)穩(wěn)定是指：閥門切換前和切換后，模擬移動床體系多柱內(nèi)濃度分布相同。

根據(jù)本發(fā)明的多柱模擬移動床色譜技術連續(xù)分離氨魯米特外消旋體的方法，優(yōu)選的是，所述流動相為乙醇、正己烷和乙醇胺的混合物，其體積比為2～100：2～100:0.01-1。

流動相的主要成分為乙醇和正己烷，乙醇胺為少量添加劑。

更進一步地，所述乙醇、正己烷和乙醇胺的體積比為：70:30:0.1。

優(yōu)選的是，步驟(1)所述硅膠的顆粒直徑10μm～50μm。硅膠固定相為手性固定相，纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)涂敷在硅膠上，硅膠是孔徑發(fā)達的微孔材料，顆粒直徑10μm～50μm，減少顆粒內(nèi)擴散阻力對分離效率的影響。

根據(jù)本發(fā)明的多柱模擬移動床色譜技術連續(xù)分離氨魯米特外消旋體的方法，優(yōu)選的是，步驟(2)所述操作模式選自SMB工藝、Varicol工藝、Modicon工藝和Powerfeed工藝中的一種或一種以上。

進出口閥門同步切換時，分離性能Modicon工藝>Powerfeed工藝>SMB工藝。

異步控制Varicol工藝分離性能>SMB工藝。

異步控制Varicol工藝與Modicon工藝和Powerfeed工藝組合，分離性能最佳。

優(yōu)選的是，步驟(2)所述模擬移動床構態(tài)為：所述模擬移動床色譜系統(tǒng)采用的色譜柱數(shù)量為4～12根連接成四個分離區(qū)、閉路、溶劑循環(huán)使用系統(tǒng)。

優(yōu)選的是，步驟(2)所述每個區(qū)填充柱數(shù)的數(shù)值范圍：1～3根。

根據(jù)本發(fā)明的多柱模擬移動床色譜技術連續(xù)分離氨魯米特外消旋體的方法，優(yōu)選的是，所述高純度為99.0％以上。

優(yōu)選的是，步驟(4)所述操作溫度為20～30℃。

模擬移動床色譜分離技術涉及四種操作模式，即同步控制模擬移動床分離(SMB工藝)、異步控制模擬移動床分離(Varicol工藝)、進料速度周期變化模擬移動床分離(Powerfeed工藝)和進料濃度周期變化模擬移動床分離(Modicon工藝)。手性固定相為涂敷纖維素-三(3,5)-二甲基苯基氨基甲酸酯的硅膠，流動相為乙醇、正己烷和乙醇胺的混合物。采用本發(fā)明的模擬移動床色譜技術拆分氨魯米特外消旋體，能夠獲得純度高于99％的S-氨魯米特對映體和純度高于99％的R-氨魯米特對映體。

本發(fā)明采用多柱模擬移動床色譜技術分離氨魯米特外消旋體，涉及四種模擬移動床技術操作模式，即同步控制模擬移動床分離法(SMB工藝)、異步控制模擬移動床分離法(Varicol工藝)、進料速度周期變化模擬移動床分離法(Powerfeed工藝)和進料濃度周期變化模擬移動床分離法(Modicon工藝)。手性固定相擬采用涂敷纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯的硅膠，流動相為乙醇、正己烷和乙醇胺的混合物。該方法能夠連續(xù)高效分離氨魯米特外消旋體，獲得高純度(大于99％)的S-氨魯米特對映體和高純度R-氨魯米特對映體。此方法填補了國內(nèi)對于制備光學純氨魯米特對映體空白，為進一步研究單一氨魯米特對映體藥用機理奠定了基礎。

同步控制模擬移動床分離法(SMB工藝)是普遍使用的色譜分離技術。模擬移動床的結(jié)構如圖1所示，包括一個料液進口、一個洗脫劑進口、一個萃取液出口以及一個萃余液出口。這四股進出口將多個填充柱分割成四個區(qū)域。區(qū)I為洗脫劑進口和萃取液出口之間，作用是保證填充柱內(nèi)手性固定相再生完全，以便手性固定相循環(huán)至區(qū)IV，強吸附組分R-AG對映體朝萃取液出口移動。區(qū)II為料液進口和萃取液出口之間，氨魯米特對映體主要分離區(qū)之一，實現(xiàn)R-AG對映體和S-AG對映體組分分離。區(qū)III為進料口和萃余液出口之間，也是氨魯米特對映體主要分離區(qū)之一，實現(xiàn)R-AG對映體和S-AG對映體組分分離。區(qū)IV為洗脫劑進口和萃余液出口之間，該區(qū)內(nèi)流動相中S-AG對映體被填充柱內(nèi)手性固定相完全吸附，以便流動相能夠循環(huán)到區(qū)I使用，降低溶劑消耗。模擬移動床技術是通過進出料口的閥門切換模擬填充柱內(nèi)吸附劑的移動。其四個進出口的位置在設定的時間間隔時沿著流動相流動方向同時移動一個填充柱的位置，柱中的固定相相對于進出料口位置移動，從而實現(xiàn)固液逆流過程，提高分離效率。

同步控制SMB工藝在進出料口位置切換周期內(nèi)進料流速、進料濃度和每區(qū)填充柱分布等操作條件保持不變，限制其分離性能。為了進一步提高SMB的分離效率，幾種改進SMB工藝被發(fā)展，如異步控制的Varicol工藝、進料濃度變化的Modicon工藝和進料流速變化的Powerfeed工藝。Modicon工藝在一個切換周期內(nèi)改變進料濃度提高SMB分離性能，但進出物料口位置仍然是同步切換。圖2a所示一個切換周期(Ts)內(nèi)進料濃度可以設定由低到高變化或者相反，如前半個切換時間(0到0.5Ts)采取低濃度物料進料，后半個切換時間(0.5Ts到Ts)以高濃度物料進料，依次循環(huán)。Powerfeed工藝在一個切換周期內(nèi)改變流速提高SMB分離性能，同樣進出物料口位置仍然是同步切換。圖2b所示一個切換周期內(nèi)進料速度可以由高至低變化或者相反，如前半個切換時間(0到0.5Ts)采取高流速進料，后半個切換時間(0.5Ts到Ts)以低流速進料，依次循環(huán)。Varicol工藝操作原理基于一個切換周期內(nèi)進出物料口位置異步切換。圖3所示典型5塔Varicol工藝進出物料口位置切換順序，在一個切換周期內(nèi)分成二步切換洗脫液、進料、萃取液和萃余液四股物料。首先進料口向前移動一個填充柱，接著洗脫液、萃取液和萃余液三股物料口向前移動一個填充柱。與同步控制SMB工藝相比，異步控制Varicol工藝各區(qū)中的填充柱分布隨著時間而變化，而且填充柱數(shù)目不受整數(shù)的限制，提高了各區(qū)中手性固定相的利用率，節(jié)省昂貴手性固定相的使用，降低分離成本。

本發(fā)明具有以下技術效果：

本發(fā)明采用模擬移動床色譜分離系統(tǒng)，從氨魯米特外消旋體中分離出光純度大于99％的S-氨魯米特對映體和光純度大于99％R-氨魯米特對映體。生產(chǎn)連續(xù)，生產(chǎn)效率高，產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定，工藝簡單。整個過程使用的溶劑可循環(huán)使用，降低成本，減少污染，實現(xiàn)清潔生產(chǎn)。

附圖說明

圖1.同步控制模擬移動床(SMB工藝),進料流速周期變化模擬移動床(Powerfeed工藝),進料濃度周期變化模擬移動床(Modicon工藝)分離氨魯米特外消旋體流程圖。D：洗脫劑；R-AG：R-氨魯米特對映體；S-AG：S-氨魯米特對映體。

圖2.Powerfeed工藝和Modicon工藝的進料流速和進料濃度切換周期變化示意圖。

圖3.異步控制模擬移動床(Varicol工藝)分離氨魯米特外消旋體流程圖。D：洗脫劑；R-AG：R-氨魯米特對映體；S-AG：S-氨魯米特對映體。

具體實施方式

實施例1.同步模擬移動床分離氨魯米特外消旋體

模擬移動床設備包括進樣泵、洗脫泵、萃取泵、萃余泵、循環(huán)泵、填充柱、控制閥、在線檢測器、控溫器和計算機自動控制系統(tǒng)。物料樣品溶液和洗脫液分別由進料入口和洗脫液入口進入模擬移動床系統(tǒng)，氨魯米特的兩個對映體分別從萃取液和萃余液兩個出口流出。每隔一定的設置時間，樣品液和洗脫液入口以及萃取液和萃余液出口同時沿流動相流動的方向切換至下一根填充柱位置，依次循環(huán)切換，實現(xiàn)流動相和手性固定相逆流流動。

外消旋氨魯米特純度99.0％，購買于大連美侖生物技術有限公司。流動相和洗脫劑均為乙醇、正己烷和乙醇胺的混合物，體積比為70：30：0.1。氨魯米特外消旋體溶解在流動相中，濃度為6.0mg/ml，由進樣泵注入。手性固定相為涂敷纖維素-三(3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯)的硅膠，顆粒粒度為20μm。模擬移動床系統(tǒng)由六個填充柱連接構成四區(qū)分離體系，每個填充柱填充高度150mm,內(nèi)徑為10mm。

根據(jù)設計的操作分離區(qū)，確定模擬移動床操作條件如下：料液中氨魯米特外消旋體濃度6.0mg/ml，料液流速0.54ml/min，洗脫液流速3.34ml/min，萃取液流速1.94ml/min，萃余液流速1.94ml/min，切換時間2.0min。樣品溶液和洗脫液分別從樣品液入口和洗脫液入口注入色譜系統(tǒng)，通過模擬移動床色譜的自動控制系統(tǒng)，定期控制電磁閥的開閉，使樣品液入口、洗脫液入口、萃取液出口、萃余液出口沿流動相方向定時切換移動一個填充柱，氨魯米特的兩個單一對映體分別從萃取液和萃余液兩個出口流出，收集得到產(chǎn)品。系統(tǒng)操作溫度控制25℃。

實驗證明采用同步控制模擬移動床工藝拆分氨魯米特外消旋，每天每升手性固定相能夠獲得75克R-氨魯米特對映體和75克S-氨魯米特對映體，R-氨魯米特對映體產(chǎn)品純度達到99.4％，S-氨魯米特對映體產(chǎn)品純度達到99.1％。得到每克單一對映體產(chǎn)品消耗溶劑2升。采用色譜分析產(chǎn)品純度，分析條件為：流動相乙醇/正己烷/乙醇胺(70/30/0.1)，0.6ml/min流速，4.6×150mm,5μm,Chiralcel OD色譜柱，ThermoFisher U3000RS紫外檢測器，254nm檢測波長。

實施例2.Modicon工藝分離氨魯米特外消旋體

在同步控制模擬移動床(SMB工藝)研究基礎上，對改進Modicon工藝分離性能進行評價。

上述實施的SMB工藝，采用6個填充柱，進出料口位置周期切換時進料濃度和進料速度不變，恒定為6.0mg/ml(消旋體)和0.54ml/min。Modicom工藝采用改變進料濃度提高分離效率，進出料口位置周期切換時間仍為2.0min，但是前1.0min，采取低濃度進料(如1.5mg/ml)，后1.0min，采取高濃度進料(如10.5mg/ml)，切換周期內(nèi)平均進料濃度為6.0mg/ml(消旋體)。通過分析發(fā)現(xiàn)Modicon工藝能夠改善同步控制SMB的分離性能。在優(yōu)化的操作條件下，Modicon工藝拆分氨魯米特外消旋體，在萃取口和萃余口均能夠得到純度高于99.0％的R-氨魯米特對映體和純度高于99.0％的S-氨魯米特對映體。與SMB工藝相比較，Modicon工藝將SMB工藝的產(chǎn)率提高25％，溶劑消耗平均降低21％。

實施例3.Powerfeed工藝分離氨魯米特外消旋體

在同步控制模擬移動床(SMB工藝)研究基礎上，對改進Powerfeed工藝分離性能進行評價。

同樣在上述實施的6個填充柱SMB工藝，進出料口位置同步周期切換中進料速度恒定為0.54ml/min，進料濃度恒定為6.0mg/ml(消旋體)。Powerfeed工藝采用改變進料速度提高分離性能。進出料口位置周期切換時間仍為2.0min，但是前1.0min，采取高進料流速(如1.08ml/min)，后1.0min，采取低進料流速(如0ml/min)，切換周期內(nèi)平均進料速度仍為0.54ml/min。為了與SMB工藝進行比較，設計時，區(qū)I和區(qū)II流動相流速與SMB工藝相同，由于進料流速變化，需要調(diào)節(jié)區(qū)III和區(qū)IV流動相流速和洗脫劑流速，使Powerfeed工藝中平均流速接近SMB工藝。當系統(tǒng)達到循環(huán)穩(wěn)定后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在萃取口和萃余口均能夠得到純度高于99.0％的R-氨魯米特對映體和S-氨魯米特對映體，與SMB工藝相比較，Powerfeed工藝將SMB產(chǎn)率平均提高10％，溶劑消耗平均降低8％。

實施例4.Varicol工藝分離氨魯米特外消旋體

在同步控制模擬移動床(SMB工藝)研究基礎上，對改進Varicol工藝分離性能進行評價。

Varicol工藝采用5個填充柱，進料、洗脫液、萃取液和萃余液四股物料位置切換順序不是同步，其它操作條件與上述同步控制6柱SMB工藝相同。四股物料位置周期切換時間仍為2.0min，但分兩次切換進出料口。1.0min時切換進料口，向前移動一個填充柱，其它物料口位置不動。2.0min時切換洗脫液、萃取液和萃余液三股物料位置，向前移動一個填充柱，進料口位置不動。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5柱Varicol工藝拆分氨魯米特外消旋體，在萃取口和萃余口均能夠得到純度高于99.0％的R-氨魯米特對映體和S-氨魯米特對映體。與6柱SMB工藝相比較，發(fā)現(xiàn)在相同的進料量下，產(chǎn)品純度達到99.0％以上，Varicol工藝相較于SMB工藝在產(chǎn)率上有較為明顯的優(yōu)勢，提高了約20％，而溶劑消耗量基本沒有增加。同時Varicol工藝還少用了一根色譜柱，節(jié)省了約17％的手性填料使用量，降低了分離成本。此外，對于串聯(lián)系統(tǒng)的模擬移動床設備，減少回路中色譜柱的數(shù)目可有效降低運行過程中系統(tǒng)的壓力，降低系統(tǒng)的耐壓要求，可實現(xiàn)減少設備投資費用的目的。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。