本發(fā)明涉及血液凈化領(lǐng)域，具體涉及一種碳化樹(shù)脂DNA免疫吸附劑的制備方法。
背景技術(shù)：
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemiclupuserythematosus,以下簡(jiǎn)稱(chēng)SLE)是一種常見(jiàn)的累及多系統(tǒng)多器官的自身免疫性疾病。由于患者機(jī)體免疫調(diào)節(jié)障礙及自身免疫耐受狀態(tài)被打破，產(chǎn)生多種針對(duì)自身組織的抗體，導(dǎo)致組織和器官的損傷，這些抗體主要是抗Sm抗體、抗核抗體以及抗DNA抗體。其中抗DNA抗體可分為抗單鏈DNA抗體(抗ss-DNA抗體)和抗雙鏈DNA抗體(抗ds-DNA抗體)。
根據(jù)國(guó)內(nèi)外臨床及基礎(chǔ)研究表明，抗ds-DNA抗體的滴度與疾病嚴(yán)重程度及活動(dòng)性呈正相關(guān)。最近幾年，激素及免疫抑制劑的應(yīng)用使SLE患者的愈后效果得到明顯改善，但依舊存在很多患者藥物療效不顯著的現(xiàn)象，過(guò)度的免疫抑制治療所引起的感染是引起SLE患者死亡的主要原因。另外，多方面研究證實(shí)，抗雙鏈DNA抗體(抗ds-DNA抗體)與DNA結(jié)合成為免疫復(fù)合物在腎小球基底膜沉積，或ds-DNA抗體直接作用于腎小球抗原，從而造成SLE患者的腎損傷。
使用DNA免疫吸附(IA)對(duì)患者進(jìn)行血液灌流，是近二、三十年發(fā)展起來(lái)的新型療法。Jones,Frank R(EP0272792A1,1987)對(duì)這種方法作了詳細(xì)說(shuō)明。DNA免疫吸附劑的吸附作用是依靠DNA對(duì)致病性抗ds-DNA抗體的特異識(shí)別作用，清除患者血液中的致病物質(zhì)，緩解病情，改善患者的免疫功能，從而逐漸恢復(fù)健康。
美國(guó)的TermanDS等人(Lancet,1979,2(8147):824-7)首次使用活性炭為載體材料，采用火棉膠包膜固定DNA，得到DNA免疫吸附劑用于血液灌流治療一名重度SLE患者，使患者生命延長(zhǎng)，從此開(kāi)辟了DNA吸附劑治療SLE的先河。使用火棉膠包膜，雖使DNA免疫吸附劑的安全有效性得到了保證，但吸附率僅為50％左右。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種可提高DNA免疫吸附劑吸附率新的DNA免疫吸附劑的制備方法。
本發(fā)明提供一種DNA免疫吸附劑的制備方法，包括以下步驟：
步驟一：吸附劑包膜
步驟1.1將干燥的碳化樹(shù)脂倒入到DNA包膜溶液中，攪拌、過(guò)濾、烘干，其中所述碳化樹(shù)脂與所述DNA包膜溶液的體積比為1：(2-4)；
步驟1.2向步驟1.1所得產(chǎn)物中加入有機(jī)溶劑，所述碳化樹(shù)脂與所述有機(jī)溶劑的體積比為1：(0.5-1)，所述有機(jī)溶劑為乙醇或乙醇乙醚混合溶劑，所述乙醇乙醚混合溶劑中乙醇的體積百分比濃度至少為60％；
步驟二：將步驟一所得產(chǎn)物攪拌、過(guò)濾、干燥、冷卻，得到成品DNA免疫吸附劑。
上述方法采用“濕蝕”包膜法，在對(duì)吸附劑進(jìn)行一次包膜后，再加入適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑部分溶解包膜溶液，從而將黏附于膜層表面的DNA“局部釋放”，使溶解后的包膜溶液再次成膜，使包膜厚度更加均勻，固定DNA，從而達(dá)到提高DNA有效吸附率的效果。其中，有機(jī)溶劑可以是乙醇或乙醇乙醚混合溶劑。當(dāng)有機(jī)溶劑為乙醇乙醚混合溶劑時(shí)，混合溶劑中乙醇優(yōu)選的體積百分比濃度為不低于60％。更為優(yōu)選的，有機(jī)溶劑為乙醇乙醚混合溶劑，其中乙醇的體積百分比濃度為70％-90％，此種情況下，吸附率可達(dá)90％。
更好的方案是步驟一中的DNA包膜溶液通過(guò)包含以下步驟的方法配制：
步驟A向濃度為1-2mg/ml的DNA原液中加入相當(dāng)于DNA質(zhì)量的0.1％-2％的氨基酸和與DNA原液等體積的無(wú)水乙醇，攪拌或振蕩至完全溶解，得DNA溶液；
步驟B將步驟A所得DNA溶液與0.5％-1％質(zhì)量濃度的火棉膠溶液按體積比(0.25-0.5)：1充分混合，得DNA包膜溶液。
再好的方案是步驟A中所述氨基酸為極性氨基酸，選自甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸中的一種或多種。更優(yōu)選的是甘氨酸。
氨基酸可提高DNA在水中的溶解性，因此在包膜溶液加入一定量的氨基酸，可以改善DNA的溶解性能，達(dá)到均相溶液的效果。其中，甘氨酸是一種人體必需氨基酸，基本無(wú)毒副作用，同時(shí)，甘氨酸還可以大大提高水溶液的介電常數(shù)，從而提高DNA在水中的溶解性。
另一較好的技術(shù)方案步驟一中的碳化樹(shù)脂通過(guò)聚合制得，在聚合時(shí)，向聚合體系中加入納米粒子作為模板劑。
通過(guò)將作為模板劑的納米粒子加入到制備大孔吸附樹(shù)脂的共聚反應(yīng)體系中，可使制備出的富含納米中孔的吸附樹(shù)脂。將樹(shù)脂在馬弗爐中碳化后，對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行酸充分去除模板劑，即可制備出富含納米中孔孔徑可控的碳化樹(shù)脂。
再一較好的技術(shù)方案是步驟一中的炭化樹(shù)脂通過(guò)包含以下步驟的方法制得：
步驟a制備出聚苯乙烯樹(shù)脂
向由水相和油相構(gòu)成的混合體系中加入引發(fā)劑、納米模板劑，緩慢升溫至95℃-100℃反應(yīng)3-5小時(shí)，經(jīng)過(guò)濾、洗滌處理后，制備出聚苯乙烯樹(shù)脂；
其中，所述水相是質(zhì)量濃度為0.5％-5％的明膠水溶液；所述油相為苯乙烯和二乙烯苯的混合單體，所述二乙烯苯占混合單體總質(zhì)量的0.5-1.5％；水相和油相體積比為(3-4)：1；所述引發(fā)劑的用量為混合單體總質(zhì)量的1-3％，所述納米模板劑的用量占混合單體總質(zhì)量的0.5-1％；
步驟b碳化樹(shù)脂的制備
在電阻爐中加入步驟a制得的聚苯乙烯樹(shù)脂，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下逐漸升溫，以80-100℃每小時(shí)的升溫速度升到800-1000℃，水蒸氣活化1-2小時(shí)；用1-3mol/L HCl水溶液煮沸0.5-1小時(shí)，用蒸餾水洗至中性，得碳化樹(shù)脂。
較為優(yōu)選的方案是，納米粒子為納米碳酸鹽或納米氫氧化物。更為優(yōu)選的納米粒子可以是納米CaCO3、MgCO3、BaCO3、SrCO3、ZnCO3、Mg(OH)2、Bi(OH)3、Fe(OH)3、Ti(OH)3、Cd(OH)2、Co(OH)2、Cr(OH)3、Mn(OH)2中的任一一種或多種。再優(yōu)選的是，納米粒子的粒徑為2-50nm。
本發(fā)明對(duì)上述方法中的引發(fā)劑沒(méi)有嚴(yán)格的限制，其中步驟a中的引發(fā)劑可以是過(guò)氧化苯甲酰，步驟b中的引發(fā)劑可以為PBO。本發(fā)明對(duì)上述方法中的DNA原液的配制方法沒(méi)有嚴(yán)格的際制，可采用現(xiàn)有技術(shù)中配制DNA原液的方法，如：將高純度小牛胸腺DNA(DNA純度85％以上)溶解于0.2mol/LTris-HCL(pH＝7.4)緩沖溶液中，配制濃度為DNA濃度為1-2mg/ml DAN原液。
本發(fā)明以上及以下所提及的溫度，均指攝氏溫度。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
實(shí)施例1制備樣品編號(hào)為1號(hào)的DNA免疫吸附劑
量取一定體積的干燥碳化樹(shù)脂，倒入到體積為碳化樹(shù)脂2倍的包膜溶液中，攪拌5min然后過(guò)濾，將過(guò)濾后的樹(shù)脂放在60℃下烘干2小時(shí)左右，冷卻后即制得一次包膜的DNA免疫吸附劑。
上述過(guò)程中使用的包膜液和碳化樹(shù)脂分別通過(guò)以下方法制得。
一、包膜液的制備：
取高純度小牛胸腺DNA(DNA含量85％以上)溶解于0.2mol/LTris-HCL(pH＝7.4)緩沖溶液中，配制濃度為2mg/ml的DNA原液。往配好的DNA原液中加入等體積的無(wú)水乙醇，攪拌或振蕩至完全溶解，即為DNA溶液。
將DNA溶液與1％火棉膠溶液按體積比0.25：1充分混合，得到包膜液。
二、碳化樹(shù)脂的制備
步驟a制備聚苯乙烯樹(shù)脂
在常溫下，將明膠溶解于水中，配成0.5％的反應(yīng)水相，加熱到30℃。以苯乙烯和二乙烯苯的混合單體為反應(yīng)油相，其中二乙烯苯占混合單體總質(zhì)量的0.5％。將水相和油相按體積比為3：1混合，向體系中加入過(guò)氧化苯甲酰為引發(fā)劑，加入粒徑約為10nm的納米CaCO3為模版劑，緩慢升溫至95℃反應(yīng)3小時(shí)，經(jīng)過(guò)濾、洗滌處理后，制備出聚苯乙烯樹(shù)脂。其中，過(guò)氧化苯甲酰的用量為混合單體總質(zhì)量的1％，納米CaCO3的用量為混合單體總質(zhì)量的1％。
步驟b制備碳化樹(shù)脂
在電阻爐中加入步驟a得到的聚苯乙烯樹(shù)脂，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下逐漸升溫，以100℃每小時(shí)的升溫速度升到800℃，水蒸氣活化1小時(shí)，用3mol/LHCl水溶液煮沸半小時(shí)，用蒸餾水洗至中性，得到碳化樹(shù)脂。
實(shí)施例2制備樣品編號(hào)為2號(hào)的DNA免疫吸附劑
本實(shí)施例制備2號(hào)DNA免疫吸附劑的方法與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于在步驟a制備聚苯乙烯樹(shù)脂中所使用的模版劑為粒徑約為50nm的納米CaCO3。
實(shí)施例3制備樣品編號(hào)為3號(hào)的DNA免疫吸附劑
本實(shí)施例制備3號(hào)DNA免疫吸附劑的方法與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于在步驟a制備聚苯乙烯樹(shù)脂中所使用的模版劑為粒徑約為10nm左右的納米Mg(OH)2。
實(shí)施例4制備樣品編號(hào)為4號(hào)的DNA免疫吸附劑
本實(shí)施例制備4號(hào)DNA免疫吸附劑的方法與實(shí)施例1基本相同，不同之處在于在步驟a制備聚苯乙烯樹(shù)脂中所使用的模版劑為粒徑約為粒徑約為50nm左右的納米Mg(OH)2。
實(shí)施例5制備樣品編號(hào)為5號(hào)的DNA免疫吸附劑
量取一定體積的干燥碳化樹(shù)脂，倒入到體積為碳化樹(shù)脂4倍的包膜溶液中，攪拌10min，然后過(guò)濾，將過(guò)濾后的樹(shù)脂放在60℃下烘干2小時(shí)后冷卻即制得一次包膜的DNA免疫吸附劑。
上述過(guò)程中使用的包膜液和碳化樹(shù)脂分別通過(guò)以下方法制得。
一、包膜液的制備：
取高純度小牛胸腺DNA(DNA含量85％以上)溶解于0.2mol/LTris-HCL(pH＝7.4)緩沖溶液中，配制濃度為1mg/ml的DNA原液。往配好的DNA原液中加入甘氨酸(相當(dāng)于DNA原液中DNA質(zhì)量的0.1％)和與DNA原液等體積的無(wú)水乙醇，攪拌或振蕩至完全溶解，即為DNA溶液。
將DNA溶液與1％火棉膠溶液按體積比0.25：1充分混合，得到包膜液。
二、碳化樹(shù)脂的制備
步驟a制備聚苯乙烯樹(shù)脂
在常溫下，將明膠溶解于水中，配成0.5％的反應(yīng)水相，加熱到30℃。以苯乙烯和二乙烯苯的混合單體為反應(yīng)油相，其中二乙烯苯占混合單體總質(zhì)量的0.5％。將水相和油相按體積比為4：1混合，向體系中加入過(guò)氧化苯甲酰為引發(fā)劑，加入粒徑約為50nm的納米CaCO3為模版劑，緩慢升溫至95℃反應(yīng)4小時(shí)，經(jīng)過(guò)濾、洗滌處理后，制備出聚苯乙烯樹(shù)脂。其中，過(guò)氧化苯甲酰的用量為混合單體總質(zhì)量的3％，納米CaCO3的用量為混合單體總質(zhì)量的1％。
步驟b制備碳化樹(shù)脂
在電阻爐中加入步驟a得到的聚苯乙烯樹(shù)脂，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下逐漸升溫，以100℃每小時(shí)的升溫速度升到800℃，水蒸氣活化1小時(shí)，用1.5mol/L HCl水溶液煮沸半小時(shí)，用蒸餾水洗至中性，得到碳化樹(shù)脂。
實(shí)施例6制備樣品編號(hào)為6號(hào)的DNA免疫吸附劑
本實(shí)施例制備6號(hào)DNA免疫吸附劑的方法與實(shí)施例5基本相同，不同之處在于包膜液的制備過(guò)程中向配好的DNA原液中加入的是絲氨酸(相當(dāng)于DNA原液中DNA質(zhì)量的0.1％)和與DNA原液等體積的無(wú)水乙醇。
實(shí)施例7制備樣品編號(hào)為7號(hào)的DNA免疫吸附劑
量取一定體積的干燥碳化樹(shù)脂，倒入到體積為樹(shù)脂2倍的包膜溶液中，攪拌1min過(guò)濾后加入樹(shù)脂體積比為1/1的乙醇乙醚混合溶劑，乙醇的體積百分比濃度為為60％，將過(guò)濾后的樹(shù)脂放在60℃下烘干2小時(shí)后冷卻即為DNA免疫吸附劑。
上述過(guò)程中使用的包膜液和碳化樹(shù)脂分別通過(guò)以下方法制得。
一、包膜液的制備：
取高純度小牛胸腺DNA(DNA含量85％以上)溶解于0.2mol/LTris-HCL(pH＝7.4)緩沖溶液中，配制濃度為1mg/ml的DNA原液。往配好的DNA原液中加入酪氨酸(相當(dāng)于DNA原液中DNA質(zhì)量的0.1％)和與DNA原液等體積的無(wú)水乙醇，攪拌或振蕩至完全溶解，即為DNA溶液。
將DNA溶液與1.5％火棉膠溶液按體積比0.5：1(50％v/v)充分混合，得到包膜液。
二、碳化樹(shù)脂的制備
步驟a制備聚苯乙烯樹(shù)脂
在常溫下，將明膠溶解于水中，配成0.5％的反應(yīng)水相，加熱到30℃。以苯乙烯和二乙烯苯的混合單體為反應(yīng)油相，其中二乙烯苯占混合單體總質(zhì)量的0.5％。將水相和油相按體積比為3：1混合，向體系中加入過(guò)氧化苯甲酰為引發(fā)劑，加入粒徑約為50nm的納米CaCO3為模版劑，緩慢升溫至95℃反應(yīng)5小時(shí)，經(jīng)過(guò)濾、洗滌處理后，制備出聚苯乙烯樹(shù)脂。其中，過(guò)氧化苯甲酰的用量為混合單體總質(zhì)量的1％，納米CaCO3的用量為混合單體總質(zhì)量的1％。
步驟b制備碳化樹(shù)脂
在電阻爐中加入步驟a得到的聚苯乙烯樹(shù)脂，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下逐漸升溫，以100℃每小時(shí)的升溫速度升到800℃，水蒸氣活化1小時(shí)，用3mol/L HCl水溶液煮沸半小時(shí)，用蒸餾水洗至中性，得到碳化樹(shù)脂。
實(shí)施例8制備樣品編號(hào)為8號(hào)的DNA免疫吸附劑
本實(shí)施例制備8號(hào)DNA免疫吸附劑的方法與實(shí)施例7基本相同，不同之處在于包膜過(guò)程中乙醇乙醚混合溶劑中乙醇的體積百分比濃度為為70％。
實(shí)施例9制備樣品編號(hào)為9號(hào)的DNA免疫吸附劑
量取一定體積的干燥碳化樹(shù)脂，倒入到體積為樹(shù)脂4倍的包膜溶液中，攪拌5min，過(guò)濾后加入樹(shù)脂體積比為1/1的乙醇乙醚混合溶劑，乙醇的體積百分比濃度為80％，攪拌1min，將過(guò)濾后的樹(shù)脂放在60℃下烘干2小時(shí)后冷卻得到樣品編號(hào)為9號(hào)的DNA免疫吸附劑。
上述過(guò)程中使用的包膜液和碳化樹(shù)脂分別通過(guò)以下方法制得。
一、包膜液的制備：
取高純度小牛胸腺DNA(DNA含量85％以上)溶解于0.2mol/LTris-HCL(pH＝7.4)緩沖溶液中，配制濃度為1mg/ml的DNA原液。往配好的DNA原液中加入甘氨酸(用量為DNA原液中DNA質(zhì)量的0.1％)和與DNA原液等體積的無(wú)水乙醇，攪拌或振蕩至完全溶解，即為DNA溶液。
將DNA溶液與1％火棉膠溶液按體積比0.25：1(25％v/v)充分混合，得到包膜液。
二、碳化樹(shù)脂的制備
步驟a制備聚苯乙烯樹(shù)脂
在常溫下，將明膠溶解于水中，配成0.5％的反應(yīng)水相，加熱到30℃。以苯乙烯和二乙烯苯的混合單體為反應(yīng)油相，其中二乙烯苯占混合單體總質(zhì)量的0.5％。將水相和油相按體積比為3：1混合，向體系中加入過(guò)氧化苯甲酰為引發(fā)劑，加入粒徑約為50nm的納米CaCO3為模版劑，緩慢升溫至100℃反應(yīng)3小時(shí)，經(jīng)過(guò)濾、洗滌處理后，制備出聚苯乙烯樹(shù)脂。其中，過(guò)氧化苯甲酰的用量為混合單體總質(zhì)量的1％，納米CaCO3的用量為混合單體總質(zhì)量的1％。
步驟b制備碳化樹(shù)脂
在電阻爐中加入步驟a得到的聚苯乙烯樹(shù)脂，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下逐漸升溫，以100℃每小時(shí)的升溫速度升到1000℃，水蒸氣活化1小時(shí)，用3mol/L HCl水溶液煮沸半小時(shí)，用蒸餾水洗至中性，得到碳化樹(shù)脂。
實(shí)施例10制備樣品編號(hào)為10號(hào)的DNA免疫吸附劑
量取一定體積的干燥碳化樹(shù)脂，倒入到體積為樹(shù)脂2倍的包膜溶液中，攪拌10min，過(guò)濾后加入樹(shù)脂體積比為1/1的乙醇乙醚混合溶劑，乙醇比例為90％，攪拌1min，將過(guò)濾后的樹(shù)脂放在60℃下烘干2小時(shí)后冷卻得到樣品編號(hào)為10號(hào)的DNA免疫吸附劑。
上述過(guò)程中使用的包膜液和碳化樹(shù)脂分別通過(guò)以下方法制得。
一、包膜液的制備：
取高純度小牛胸腺DNA(DNA含量85％以上)溶解于0.2mol/LTris-HCL(pH＝7.4)緩沖溶液中，配制濃度為2mg/ml的DNA原液。往配好的DNA原液中加入蘇氨酸(用量為DNA原液中DNA質(zhì)量的0.1％)和與DNA原液等體積的無(wú)水乙醇，攪拌或振蕩至完全溶解，即為DNA溶液。
將DNA溶液與0.5％火棉膠溶液按體積比0.25：1(25％v/v)充分混合，得到包膜液。
二、碳化樹(shù)脂的制備
步驟a制備聚苯乙烯樹(shù)脂
在常溫下，將明膠溶解于水中，配成5％的反應(yīng)水相，加熱到30℃。以苯乙烯和二乙烯苯的混合單體為反應(yīng)油相，其中二乙烯苯占混合單體總質(zhì)量的0.5％。將水相和油相按體積比為3∶1混合，向體系中加入過(guò)氧化苯甲酰為引發(fā)劑，加入粒徑約為50nm的納米CaCO3為模版劑，緩慢升溫至95℃反應(yīng)3小時(shí)，經(jīng)過(guò)濾、洗滌處理后，制備出聚苯乙烯樹(shù)脂。其中，過(guò)氧化苯甲酰的用量為混合單體總質(zhì)量的2％，納米CaCO3的用量為混合單體總質(zhì)量的1％。
步驟b制備碳化樹(shù)脂
在電阻爐中加入步驟a得到的聚苯乙烯樹(shù)脂，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下逐漸升溫，以100℃每小時(shí)的升溫速度升到800℃，水蒸氣活化1小時(shí)，用3mol/L HCl水溶液煮沸半小時(shí)，用蒸餾水洗至中性，得到碳化樹(shù)脂。
實(shí)施例11制備樣品編號(hào)為11號(hào)的DNA免疫吸附劑
量取一定體積的干燥碳化樹(shù)脂，倒入到體積為樹(shù)脂2倍的包膜溶液中，攪拌10min，過(guò)濾后加入樹(shù)脂體積比為1/1的乙醇，攪拌1min，將過(guò)濾后的樹(shù)脂放在60℃下烘干2小時(shí)后冷卻得到樣品編號(hào)為11號(hào)的DNA免疫吸附劑。
上述過(guò)程中使用的包膜液和碳化樹(shù)脂分別通過(guò)以下方法制得。
一、包膜液的制備：
取高純度小牛胸腺DNA(DNA含量85％以上)溶解于0.2mol/LTris-HCL(pH＝7.4)緩沖溶液中，配制濃度為2mg/ml的DNA原液。往配好的DNA原液中加入甘氨酸(用量為DNA原液中DNA質(zhì)量的0.1％)和與DNA原液等體積的無(wú)水乙醇，攪拌或振蕩至完全溶解，即為DNA溶液。
將DNA溶液與1％火棉膠溶液按體積比0.25：1(25％v/v)充分混合，得到包膜液。
二、碳化樹(shù)脂的制備
步驟a制備聚苯乙烯樹(shù)脂
在常溫下，將明膠溶解于水中，配成0.5％的反應(yīng)水相，加熱到30℃。以苯乙烯和二乙烯苯的混合單體為反應(yīng)油相，其中二乙烯苯占混合單體總質(zhì)量的0.5％。將水相和油相按體積比為4∶1混合，向體系中加入過(guò)氧化苯甲酰為引發(fā)劑，加入粒徑約為50nm的納米CaCO3為模版劑，緩慢升溫至95℃反應(yīng)3小時(shí)，經(jīng)過(guò)濾、洗滌處理后，制備出聚苯乙烯樹(shù)脂。其中，過(guò)氧化苯甲酰的用量為混合單體總質(zhì)量的1％，納米CaCO3的用量為混合單體總質(zhì)量的1％。
步驟b制備碳化樹(shù)脂
在電阻爐中加入步驟a得到的聚苯乙烯樹(shù)脂，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下逐漸升溫，以100℃每小時(shí)的升溫速度升到800℃，水蒸氣活化1小時(shí)，用3mol/L HCl水溶液煮沸半小時(shí)，用蒸餾水洗至中性，得到碳化樹(shù)脂。
實(shí)施例12制備樣品編號(hào)為12號(hào)的DNA免疫吸附劑
量取一定體積的干燥碳化樹(shù)脂，倒入到體積為樹(shù)脂2倍的包膜溶液中，攪拌5min，過(guò)濾后加入樹(shù)脂體積比為1.5/1的乙醇乙醚混合溶劑，乙醇的體積百分比濃度為70％，攪拌1min，將過(guò)濾后的樹(shù)脂放在60℃下烘干2小時(shí)后冷卻得到樣品編號(hào)為12號(hào)的DNA免疫吸附劑。
上述過(guò)程中使用的包膜液和碳化樹(shù)脂分別通過(guò)以下方法制得。
一、包膜液的制備：
取高純度小牛胸腺DNA(DNA含量85％以上)溶解于0.2mol/LTris-HCL(pH＝7.4)緩沖溶液中，配制濃度為2mg/ml的DNA原液。往配好的DNA原液中加入甘氨酸(用量為DNA原液中DNA質(zhì)量的0.1％)和與DNA原液等體積的無(wú)水乙醇，攪拌或振蕩至完全溶解，即為DNA溶液。
將DNA溶液與1％火棉膠溶液按體積比0.25：1(25％v/v)充分混合，得到包膜液。
二、碳化樹(shù)脂的制備
步驟a制備聚苯乙烯樹(shù)脂
在常溫下，將明膠溶解于水中，配成1.0％的反應(yīng)水相，加熱到30℃。以苯乙烯和二乙烯苯的混合單體為反應(yīng)油相，其中二乙烯苯占混合單體總質(zhì)量的1.5％。將水相和油相按體積比為3：1混合，向體系中加入過(guò)氧化苯甲酰為引發(fā)劑，加入粒徑約為50nm的納米CaCO3為模版劑，緩慢升溫至95℃反應(yīng)3小時(shí)，經(jīng)過(guò)濾、洗滌處理后，制備出聚苯乙烯樹(shù)脂。其中，過(guò)氧化苯甲酰的用量為混合單體總質(zhì)量的1％，納米CaCO3的用量為混合單體總質(zhì)量的1％。
步驟b制備碳化樹(shù)脂
在電阻爐中加入步驟a得到的聚苯乙烯樹(shù)脂，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下逐漸升溫，以100℃每小時(shí)的升溫速度升到800℃，水蒸氣活化1小時(shí)，用3mol/L HCl水溶液煮沸半小時(shí)，用蒸餾水洗至中性，得到碳化樹(shù)脂。
實(shí)施例13制備樣品編號(hào)為13號(hào)的DNA免疫吸附劑
量取一定體積的干燥碳化樹(shù)脂，倒入到體積為樹(shù)脂2倍的包膜溶液中，攪拌5min，過(guò)濾后加入樹(shù)脂體積比為0.75/1的乙醇乙醚混合溶劑，乙醇的體積百分比濃度為70％，攪拌1min，將過(guò)濾后的樹(shù)脂放在60℃下烘干2小時(shí)后冷卻得到樣品編號(hào)為13號(hào)的DNA免疫吸附劑。
上述過(guò)程中使用的包膜液和碳化樹(shù)脂分別通過(guò)以下方法制得。
一、包膜液的制備：
取高純度小牛胸腺DNA(DNA含量85％以上)溶解于0.2mol/LTris-HCL(pH＝7.4)緩沖溶液中，配制濃度為1mg/ml的DNA原液。往配好的DNA原液中加入絲氨酸(用量為DNA原液中DNA質(zhì)量的2.0％)和與DNA原液等體積的無(wú)水乙醇，攪拌或振蕩至完全溶解，即為DNA溶液。
將DNA溶液與1.5％火棉膠溶液按體積比0.5：1(50％v/v)充分混合，得到包膜液。
二、碳化樹(shù)脂的制備
步驟a制備聚苯乙烯樹(shù)脂
在常溫下，將明膠溶解于水中，配成3.0％的反應(yīng)水相，加熱到30℃。以苯乙烯和二乙烯苯的混合單體為反應(yīng)油相，其中二乙烯苯占混合單體總質(zhì)量的0.5％。將水相和油相按體積比為3：1混合，向體系中加入過(guò)氧化苯甲酰為引發(fā)劑，加入粒徑約為50nm的納米CaCO3為模版劑，緩慢升溫至100℃反應(yīng)3小時(shí)，經(jīng)過(guò)濾、洗滌處理后，制備出聚苯乙烯樹(shù)脂。其中，過(guò)氧化苯甲酰的用量為混合單體總質(zhì)量的1％，納米CaCO3的用量為混合單體總質(zhì)量的1％。
步驟b制備碳化樹(shù)脂
在電阻爐中加入步驟a得到的聚苯乙烯樹(shù)脂，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下逐漸升溫，以100℃每小時(shí)的升溫速度升到800℃，水蒸氣活化2小時(shí)，用2mol/L HCl水溶液煮沸半小時(shí)，用蒸餾水洗至中性，得到碳化樹(shù)脂。
實(shí)施例14制備樣品編號(hào)為14號(hào)的DNA免疫吸附劑
量取一定體積的干燥碳化樹(shù)脂，倒入到體積為樹(shù)脂4倍的包膜溶液中，攪拌5min，過(guò)濾后加入樹(shù)脂體積比為0.5/1的乙醇乙醚混合溶劑，乙醇的體積百分比濃度為70％，攪拌1min，將過(guò)濾后的樹(shù)脂放在60℃下烘干2小時(shí)后冷卻得到樣品編號(hào)為14號(hào)的DNA免疫吸附劑。
上述過(guò)程中使用的包膜液和碳化樹(shù)脂分別通過(guò)以下方法制得。
一、包膜液的制備：
取高純度小牛胸腺DNA(DNA含量85％以上)溶解于0.2mol/LTris-HCL(pH＝7.4)緩沖溶液中，配制濃度為1mg/ml的DNA原液。往配好的DNA原液中加入甘氨酸(用量為DNA原液中DNA質(zhì)量的0.1％)和與DNA原液等體積的無(wú)水乙醇，攪拌或振蕩至完全溶解，即為DNA溶液。
將DNA溶液與1％火棉膠溶液按體積比0.25：1(25％v/v)充分混合，得到包膜液。
二、碳化樹(shù)脂的制備
步驟a制備聚苯乙烯樹(shù)脂
在常溫下，將明膠溶解于水中，配成0.5％的反應(yīng)水相，加熱到30℃。以苯乙烯和二乙烯苯的混合單體為反應(yīng)油相，其中二乙烯苯占混合單體總質(zhì)量的0.5％。將水相和油相按體積比為4：1混合，向體系中加入過(guò)氧化苯甲酰為引發(fā)劑，加入粒徑約為50nm的納米CaCO3為模版劑，緩慢升溫至95℃反應(yīng)5小時(shí)，經(jīng)過(guò)濾、洗滌處理后，制備出聚苯乙烯樹(shù)脂。其中，過(guò)氧化苯甲酰的用量為混合單體總質(zhì)量的1％，納米CaCO3的用量為混合單體總質(zhì)量的1％。
步驟b制備碳化樹(shù)脂
在電阻爐中加入步驟a得到的聚苯乙烯樹(shù)脂，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下逐漸升溫，以80℃每小時(shí)的升溫速度升到800℃，水蒸氣活化1小時(shí)，用3mol/L HCl水溶液煮沸半小時(shí)，用蒸餾水洗至中性，得到碳化樹(shù)脂。
實(shí)施例15制備樣品編號(hào)為15號(hào)的DNA免疫吸附劑
量取一定體積的干燥碳化樹(shù)脂，倒入到體積為樹(shù)脂4倍的包膜溶液中，攪拌5min，過(guò)濾后加入樹(shù)脂體積比為0.25/1的乙醇乙醚混合溶劑，乙醇的體積百分比濃度為70％，攪拌2min，將過(guò)濾后的樹(shù)脂放在60℃下烘干2小時(shí)后冷卻得到樣品編號(hào)為15號(hào)的DNA免疫吸附劑。
上述過(guò)程中使用的包膜液和碳化樹(shù)脂分別通過(guò)以下方法制得。
一、包膜液的制備：
取高純度小牛胸腺DNA(DNA含量85％以上)溶解于0.2mol/LTris-HCL(pH＝7.4)緩沖溶液中，配制濃度為1mg/ml的DNA原液。往配好的DNA原液中加入甘氨酸(用量為DNA原液中DNA質(zhì)量的1.0％)和與DNA原液等體積的無(wú)水乙醇，攪拌或振蕩至完全溶解，即為DNA溶液。
將DNA溶液與1％火棉膠溶液按體積比0.25：1(25％v/v)充分混合，得到包膜液。
二、碳化樹(shù)脂的制備
步驟a制備聚苯乙烯樹(shù)脂
在常溫下，將明膠溶解于水中，配成3.0％的反應(yīng)水相，加熱到30℃。以苯乙烯和二乙烯苯的混合單體為反應(yīng)油相，其中二乙烯苯占混合單體總質(zhì)量的0.5％。將水相和油相按體積比為3：1混合，向體系中加入過(guò)氧化苯甲酰為引發(fā)劑，加入粒徑約為50nm的納米CaCO3為模版劑，緩慢升溫至95℃反應(yīng)3小時(shí)，經(jīng)過(guò)濾、洗滌處理后，制備出聚苯乙烯樹(shù)脂。其中，過(guò)氧化苯甲酰的用量為混合單體總質(zhì)量的0.5％，納米CaCO3的用量為混合單體總質(zhì)量的1％。
步驟b制備碳化樹(shù)脂
在電阻爐中加入步驟a得到的聚苯乙烯樹(shù)脂，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下逐漸升溫，以100℃每小時(shí)的升溫速度升到800℃，水蒸氣活化1小時(shí)，用3mol/L HCl水溶液煮沸1小時(shí)，用蒸餾水洗至中性，得到碳化樹(shù)脂。
實(shí)施例16制備樣品編號(hào)為16號(hào)的DNA免疫吸附劑
量取一定體積的干燥碳化樹(shù)脂，倒入到體積為樹(shù)脂4倍的包膜溶液中，攪拌5min，過(guò)濾后加入樹(shù)脂體積比為0.5/1的乙醇乙醚混合溶劑，乙醇的體積百分比濃度為70％，攪拌1min，將過(guò)濾后的樹(shù)脂放在60℃下烘干2小時(shí)后冷卻得到樣品編號(hào)為16號(hào)的DNA免疫吸附劑。
上述過(guò)程中使用的包膜液和碳化樹(shù)脂分別通過(guò)以下方法制得。
一、包膜液的制備：
取高純度小牛胸腺DNA(DNA含量85％以上)溶解于0.2mol/LTris-HCL(pH＝7.4)緩沖溶液中，配制濃度為1mg/ml的DNA原液。往配好的DNA原液中加入與DNA原液等體積的無(wú)水乙醇，攪拌或振蕩至完全溶解，即為DNA溶液。
將DNA溶液與1％火棉膠溶液按體積比0.25：1(25％v/v)充分混合，得到包膜液。
二、碳化樹(shù)脂的制備
步驟a制備聚苯乙烯樹(shù)脂
在常溫下，將明膠溶解于水中，配成0.5％的反應(yīng)水相，加熱到30℃。以苯乙烯和二乙烯苯的混合單體為反應(yīng)油相，其中二乙烯苯占混合單體總質(zhì)量的0.5％。將水相和油相按體積比為3：1混合，向體系中加入過(guò)氧化苯甲酰為引發(fā)劑，加入粒徑約為50nm的納米CaCO3為模版劑，緩慢升溫至95℃反應(yīng)3小時(shí)，經(jīng)過(guò)濾、洗滌處理后，制備出聚苯乙烯樹(shù)脂。其中，過(guò)氧化苯甲酰的用量為混合單體總質(zhì)量的1％，納米CaCO3的用量為混合單體總質(zhì)量的1％。
步驟b制備碳化樹(shù)脂
在電阻爐中加入步驟a得到的聚苯乙烯樹(shù)脂，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下逐漸升溫，以100℃每小時(shí)的升溫速度升到800℃，水蒸氣活化1小時(shí)，用3mol/L HCl水溶液煮沸半小時(shí)，用蒸餾水洗至中性，得到碳化樹(shù)脂。
測(cè)試：
采用ASAP2000比表面積及孔徑分析儀對(duì)1-16號(hào)的DNA免疫吸附劑樣品樹(shù)脂的孔徑進(jìn)行檢測(cè)。
DNA免疫吸附劑樣品制備方式及孔徑檢測(cè)結(jié)果匯總?cè)缦卤?所示：
表1 DNA免疫吸附劑樣品制備方式匯總表
從表1中可以看出，在碳化樹(shù)脂載體制備過(guò)程中使用不同粒徑(10nm、50nm)的模板劑可以制備出含有不同中孔孔徑的碳化樹(shù)脂；相同粒徑下，使用納米CaCO3作為模板劑時(shí)比納米Mg(OH)2作為模板劑時(shí)制備出的碳化樹(shù)脂的孔徑要高，這可能是因?yàn)樵诤罄m(xù)的樹(shù)脂處理過(guò)程中納米CaCO3分解出CO2造成中孔孔徑的進(jìn)一步擴(kuò)大。
取編號(hào)為1-16號(hào)的DNA免疫吸附劑樣品各2ml，分別加入至20ml SLE患者血漿中，于37℃下震蕩吸附2小時(shí)，取吸附前后的SLE患者血漿檢測(cè)抗ds-DNA抗體濃度。檢測(cè)方法為酶聯(lián)免疫吸附法，試劑盒為上海科新生產(chǎn)，儀器為深圳愛(ài)康Uranus AE120。編號(hào)為1-16號(hào)的DNA免疫吸附劑樣品的性能檢測(cè)結(jié)果如下表2所示
表2 吸附性能檢測(cè)結(jié)果
結(jié)合表1和表2的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，我們可以得出：
(1)從實(shí)施例1-4的結(jié)果來(lái)看，維持其他條件不變?cè)谥苽涮蓟瘶?shù)脂時(shí)加入納米模板劑(納米CaCO3、Mg(OH)2)后，制備的DNA免疫吸附劑的性能有了一定程度的提高，與載體碳化樹(shù)脂孔徑變化一致，隨著樹(shù)脂孔徑增大，DNA免疫吸附劑性能逐步提高。
(2)對(duì)比實(shí)施例2、5和6的結(jié)果可知，在使用粒徑約為50nm的納米CaCO3作為模板制備碳化樹(shù)脂的統(tǒng)一前提下，在包膜液配制過(guò)程中加入極性氨基酸可以提高DNA免疫吸附劑產(chǎn)品的吸附性能(吸附率從75％提高到82％)，另一方面實(shí)施例5和實(shí)施例6的吸附性能差別很小，說(shuō)明不同種類(lèi)的氨基酸(甘氨酸、絲氨酸)對(duì)吸附劑產(chǎn)品的性能影響不大。
(3)對(duì)比實(shí)施例2和16的結(jié)果可知，在使用粒徑約為50nm的納米CaCO3作為模板制備碳化樹(shù)脂的統(tǒng)一前提下，在一次包膜完成后再次加入適當(dāng)?shù)幕旌先軇┎糠秩芙饣鹈弈z，從而將黏附于膜層表面的DNA“局部釋放”，使溶解后的火棉膠再次成膜，固定DNA，采用該“濕蝕”的包膜方式制備的免疫吸附劑的吸附性能(85.6％)高于采用一次包膜方式制備的免疫吸附劑的吸附性能(75.5％)。這說(shuō)明采用“濕蝕”的包膜方式可以達(dá)到提高DNA有效吸附率的效果。
(4)將實(shí)施例5、6和實(shí)施例7-15進(jìn)行對(duì)比，在包膜液中均加入有極性氨基酸的前提下，采用“濕蝕”的包膜方式制備的免疫吸附劑的吸附性能更好。
在基本相同的條件下，在復(fù)溶溶劑中乙醇含量為70％-90％時(shí)，DNA免疫吸附劑吸附率顯著提高，達(dá)到90％左右。乙醇含量過(guò)低(60％)或者單純使-用乙醇，DNA吸附劑的吸附效果都略遜于使用乙醇含量為70％-90％的乙醇乙醚混合溶劑。
此外，復(fù)溶溶劑與樹(shù)脂的體積比在(0.5-1)/1時(shí)，DNA免疫吸附劑的吸附率(90％左右)可達(dá)到非常優(yōu)秀。在復(fù)溶溶劑與樹(shù)脂的體積比過(guò)低(0.25/1)或者過(guò)高(1.5/1)時(shí)，對(duì)提高DNA免疫吸附劑的吸附效果的影響基本沒(méi)有。這說(shuō)明在“濕蝕”包膜過(guò)程中復(fù)溶溶劑的成分以及復(fù)溶溶劑與樹(shù)脂的體積比對(duì)提高DNA免疫吸附劑產(chǎn)品的吸附性能方有重要影響。
(5)從實(shí)施例5、14和16的結(jié)果可知，單獨(dú)采用濕蝕包膜方式制備的免疫吸附劑的吸附性能(85.6％)高于單獨(dú)采用在包膜液中加入氨基酸方式制備的免疫吸附劑的吸附性能(82.2％)，低于同時(shí)采取濕蝕包膜方式和在包膜液中加入氨基酸方式制備的免疫吸附劑的吸附性能(89.9％)，這說(shuō)明在提升免疫吸附劑性能方面，采取濕蝕包膜方式比在包膜液中加入氨基酸的效果顯著。
總之，本發(fā)明提供了一種碳化樹(shù)脂DNA免疫吸附劑的制備方法，即制備含有納米模板劑的中性苯乙烯-二乙烯基苯吸附樹(shù)脂，通過(guò)碳化及后處理去除模板劑，得到中孔富集的碳化樹(shù)脂，配制均相DNA-火棉膠包膜液，與碳化樹(shù)脂一同包膜，通過(guò)采用“濕蝕”包膜的方式，有效地提高了DNA的有效固載率和固載穩(wěn)定性，使吸附劑總體性能得到顯著提升。