本發(fā)明涉及高分子表面活性劑技術領域，特別是涉及一種氟表面活性劑及其制備方法和應用。

背景技術：

微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)在傳統(tǒng)的PCR擴增前對樣品進行微滴化處理。在微流控芯片中利用油包水的原理，將含有核酸分子的反應體系分成成千上萬個納升級的微滴，其中每個微滴含或不舍待檢核酸靶分子，或者含有一個至數(shù)個待檢核酸靶分子。在經PCR擴增后，逐個對每個微滴進行檢測，利用泊松分布對熒光信號進行處理。

而表面活性劑通過降低油水界面張力，可以避免液滴發(fā)生融合，甚至可以在加熱加壓條件下保持液滴系統(tǒng)的穩(wěn)定，穩(wěn)定的液滴可以使液滴內部成為一個反應倉，利于將DNA模板細分成單一進行擴展。目前報道有全氟聚醚酯化物，全氟聚醚酰胺化物等非離子型氟表面活性劑。

微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)作為21世紀科研含量極高，備受生物醫(yī)療界關注的一項技術，現(xiàn)階段僅有Bio-Rad及RainDance外國品牌具備相關成熟產品，因此市面上數(shù)字PCR儀器所需生成油，包括探針法及染料法，幾乎全部都來源于以上廠家。

現(xiàn)有的氟表面活性劑中非離子型產品以聚氧乙烯鏈為親水基團的類型為主。從專利文獻可知該類活性劑制備工藝非常復雜，一般制作步驟在兩步以上且中間產物市面上并無銷售，因此導致該液滴生成所需的耗材價格高昂，滿足不了更廣闊的市場。

杜克大學的Ya-Ling Chui等在ACS NANO期刊中提到，可將含氟聚醚羧酸與二氯亞砜反應生成酰氯完成第一步之后，接著溶解于三氟甲苯與HFE-7100混合液中，再加入三(羥甲基)氨基甲烷在惰性氣體保護下進行反應生成含氟聚醚羧酸酰胺。但反應過程中間產物酰氯非常容易與水發(fā)生反應，導致后續(xù)步驟效果不佳甚至產物報廢。

技術實現(xiàn)要素：

基于此，有必要針對上述問題，提供一種氟表面活性劑，該氟表面活性劑具有制備簡單，性能優(yōu)越的特點。

具有式I所示結構特征的氟表面活性劑：

所述氟表面活性劑的平均分子量為4000-9000。

上述氟表面活性劑可作為PCR探針法油相使用，實現(xiàn)在液滴式數(shù)字PCR上應用，且液滴穩(wěn)定性可以得到保證，該氟表面活性劑具有優(yōu)越的表面性能。

在其中一個實施例中，所述氟表面活性劑的平均分子量為6000-9000。

本法明還公開了上述的氟表面活性劑的制備方法，包括如下反應步驟：

在其中一個實施例中，以4-二甲氨基吡啶作為上述反應的催化劑。以4-二甲氨基吡啶作為催化劑，對反應物實現(xiàn)酰化，其具有較高的催化能力，對提高收率有極其明顯的效果。

在其中一個實施例中，所述反應的具體條件為：在惰性氣體保護下，將式II的全氟聚醚、式III的三羥甲基氨基甲烷與4-二甲氨基吡啶溶于反應溶劑中，在60℃-120℃的范圍下攪拌反應12hr-36hr，回收溶劑，即得；所述反應溶劑為氟油。反應溫度優(yōu)選80℃-100℃?？刂品磻凑丈鲜鰲l件進行，能夠減少副反應的發(fā)生，提高產物得率。

在其中一個實施例中，所述反應溶劑還包括極性有機溶劑，所述極性有機溶劑選自：三氟甲苯、二甲基甲酰胺、四氫呋喃和二甲基亞砜中的至少一種。優(yōu)選三氟甲苯。將極性有機溶劑和氟油混合作為反應溶劑使用，能夠提高最終得到產物的純度。進一步優(yōu)選的，所述氟油與所述極性有機溶劑的體積此為1.2-2.0。

在其中一個實施例中，所述氟油為甲氧基-九氟代丁烷。以甲氧基-九氟代丁烷作為反應溶劑，具有溶解性好，易控的優(yōu)點。

在其中一個實施例中，上述制備方法還包括純化步驟，所述純化步驟中，將反應步驟得到的產物再次加入氟油溶解，然后滴加二氯甲烷，使產物中的式I化合物析出，干燥后即得所述氟表面活性劑。通過上述純化步驟，可以大幅度提高產物純度。

本發(fā)明還公開了上述的氟表面活性劑在PCR擴增的微滴化處理過程中的應用。將上述氟表面活性劑應用于液滴式數(shù)字PCR中，作為PCR探針法油相使用，能夠降低液滴表面張力，提高微滴穩(wěn)定性。

本發(fā)明還公開了上一種液滴生成油，包括上述的氟表面活性劑作為溶質的氟油溶液，所述氟表面活性劑的質量百分濃度為1.5％-2.5％。

上述液滴生成油能夠保證液滴的穩(wěn)定性，具有較好的效果。

在其中一個實施例中，作為液滴生成油使用的氟油型號為HFE-7500。

與現(xiàn)有技術相此，本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明的氟表面活性劑，可作為PCR探針法油相使用，實現(xiàn)在液滴式數(shù)字PCR上應用，且液滴穩(wěn)定性可以得到保證。

本發(fā)明的氟表面活性劑的制備方法，為創(chuàng)新的一步法制備工藝，具有工藝簡單，成本低廉的優(yōu)點。

選用上述方法制備的氟表面活性劑制備液滴生成油，具有成本低，穩(wěn)定性好的特點。

附圖說明

圖1為實施例1中反應原料與產物紅外光譜對此圖。

其中：實線表示產物PFPE-Tris紅外光譜，虛線表示原料PFPE-COOH紅外光譜。

圖2為實施例1中產物PFPE-Tris氟譜圖。

圖3為實施例2中產物PFPE-Tris氫譜圖。

圖4為實施例3中液滴生成后及時取樣顯微鏡下觀察圖，圖中圖例長度為200μm。

圖5為實施例3中液滴生成靜置7天后取樣顯微鏡下觀察圖，圖中圖例長度為200μm。

圖6為實施例3中液滴生成后及時取樣顯微鏡下觀察圖，圖中圖例長度為100μm。

圖7為實施例3中液滴生成靜置7天后取樣顯微鏡下觀察圖，圖中圖例長度為100μm。

圖8為實施例3中微流控芯片生成均一的油包水液滴示意圖。

圖9為實施例3中PCR擴增熱循環(huán)前顯微鏡下觀察圖，圖中圖例長度為200μm。

圖10為實施例3中PCR擴增熱循環(huán)后顯微鏡下觀察圖，圖中圖例長度為200μm。

圖11為圖10虛線框放大視野圖，圖中圖例長度為100μm。

圖12為圖11在汞燈環(huán)境下調整曝光率后液滴熒光示意圖。

圖13為液滴進行熒光信號采集波形圖。

圖14為圖13經濾波處理后的波形圖。

具體實施方式

為了便于理解本發(fā)明，下面將參照相關附圖對本發(fā)明進行更全面的描述。附圖中給出了本發(fā)明的較佳實施例。但是，本發(fā)明可以以許多不同的形式來實現(xiàn)，并不限于本文所描述的實施例。相反地，提供這些實施例的目的是使對本發(fā)明的公開內容的理解更加透徹全面。

除非另有定義，本文所使用的所有的技術和科學術語與屬于本發(fā)明的技術領域的技術人員通常理解的含義相同。本文中在本發(fā)明的說明書中所使用的術語只是為了描述具體的實施例的目的，不是旨在于限制本發(fā)明。

以下實施例中所用原料均為市售購得。

實施例1

一種氟表面活性劑，通過以下方法制備得到：

一、反應。

按照如下反應線路進行：

所述反應的具體條件為：在惰性氣體保護下，將式II的全氟聚醚(購自杜邦，型號為FSH157，該全氟聚醚的平均分子量為7000-7500)、式III的三羥甲基氨基甲烷(tris)與4-二甲氨基吡啶溶(DMAP)于氟油(購自杜邦，型號為HFE-7100)與三氟甲苯的混合反應溶劑中，所述HFE-7100與所述三氟甲苯的體積此為1.6，在80℃-100℃的范圍下攪拌反應24hr，抽濾后旋干溶劑。

二、純化。

將步驟一得到的產物再次加入HFE-7100溶解，滴加二氯甲烷清洗將最終產物析出并進行旋蒸，然后真空干燥12小時后得到白色透明油狀物的最終產物，即得式I的氟表面活性劑(PFPE-Tris)。

三、驗證。

將上述PFPE-Tris進行紅外圖譜及核磁圖譜(氟譜、氫譜)檢測核實。

從圖譜中可以看出，如圖1所示，在紅外圖譜中可以清晰觀察到在1675cm-1位置上有明顯的產物酰胺C＝O特征吸收峰。如圖2所示，氟譜中虛線圖框內即化學位移在-83～-74范圍的一系列共振峰可以核實是PFPE該成分；此外氫譜中化學位移3.5～5范圍中的兩個單峰的積分面積此值約為3∶4，可以證實為Tris結構，即驗證所得產物即為式I的PFPE-Tris。

實施例2

一種液滴生成油，將實施例1制備得到的氟表面活性劑按質量百分濃度2％的量溶于HFE-7500氟油(購自杜邦，型號為HFE-7500)中，即得。

實施例3

利用實施例2的液滴生成油進行液滴生成實驗。

一、靜置穩(wěn)定性測試。

對實施例2的液滴生成油進行了液滴靜置穩(wěn)定性的測試，使用生成后立即取樣的液滴與放置7天后的液滴進行對比，如圖4-7所示，在顯微鏡可以觀察到兩者幾乎沒有區(qū)別，液滴照樣能呈現(xiàn)蜂巢式均一性排布，可以說明該油相所制液滴具備優(yōu)秀的靜置穩(wěn)定性能。

二、液滴式數(shù)字PCR測試。

對實施例2的液滴生成油進行液滴式數(shù)字PCR測試。具體為：以Hotstart master mix配合引物、探針及DNA模板作為水相，如圖8所示，在微流控芯片中生成均一的油包水液滴，進行PCR擴增熱循環(huán)。

PCR擴增熱循環(huán)前顯微鏡下觀察到液滴形態(tài)如圖9所示，PCR擴增熱循環(huán)后顯微鏡下觀察到液滴形態(tài)如圖10所示。在顯微鏡下觀察到，液滴經30至50圈熱循環(huán)后，其均一性狀態(tài)依然保持良好，仍然呈現(xiàn)規(guī)律的蜂窩形貌，破損及融合液滴的存在率(CV值)遠低于5％。

將圖10中虛線框的局部放大，得到圖11的局部視圖。在汞燈環(huán)境下調整曝光率，清晰觀察到，擴增后呈陽性的液滴熒光強度相對其他陰性液滴更加明亮，如圖12所示，該圖12為圖11相同視野圖。

再對液滴熒光強度進行定量分析，利用光機模塊對每個通過的液滴進行熒光信號采集并進行濾波處理，如圖13-14所示，在隨機一段采集片段中可以清晰看到，幾個陽性峰的峰值強度是眾多陰性峰值的4倍左右，符合顯微鏡觀察結果。

以上所述實施例的各技術特征可以進行任意的組合，為使描述簡潔，未對上述實施例中的各個技術特征所有可能的組合都進行描述，然而，只要這些技術特征的組合不存在矛盾，都應當認為是本說明書記載的范圍。

以上所述實施例僅表達了本發(fā)明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但并不能因此而理解為對發(fā)明專利范圍的限制。應當指出的是，對于本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本發(fā)明的保護范圍。因此，本發(fā)明專利的保護范圍應以所附權利要求為準。