本發(fā)明涉及用于對(duì)多核苷酸(如例如源自天然來(lái)源的遺傳物質(zhì)的rna和dna片段或其合成的類似物)進(jìn)行測(cè)序的改進(jìn)的裝置和方法。

遺傳物質(zhì)的下一代測(cè)序已經(jīng)對(duì)生物科學(xué)整體上和特別地對(duì)醫(yī)學(xué)產(chǎn)生顯著的影響，原因在于測(cè)序的單位成本降低，與越來(lái)越快的測(cè)序儀投放市場(chǎng)一致。在我們之前的申請(qǐng)wo2014/053853和wo2014/053854中，我們描述了新的測(cè)序方法和相關(guān)裝置，其涉及逐步消化多核苷酸分析物以產(chǎn)生單個(gè)-核堿基核苷酸(下文為‘單個(gè)核苷酸’)流，優(yōu)選通過(guò)焦磷酸解產(chǎn)生的其有序的流，其每一個(gè)可以逐個(gè)被捕獲到微滴流中的相應(yīng)小滴中。之后，可以化學(xué)和/或酶操作每個(gè)小滴以揭示其最初包含的特定單個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，這些化學(xué)和/或酶操作包括涉及使用一種或多種兩組分寡核苷酸探針類型的方法，所述兩組分寡核苷酸探針類型中的每個(gè)適于能夠選擇性捕獲構(gòu)成分析物的單個(gè)核苷酸類型中的一種；例如在天然存在的dna的情形中，對(duì)應(yīng)于核堿基胞嘧啶、胸腺嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤和腺嘌呤的四種類型中的一種。通常，在每個(gè)這樣的探針類型中，兩種寡核苷酸組分中的一種包含不同的和特征性熒光團(tuán)，并且在探針的未使用狀態(tài)，這些熒光團(tuán)發(fā)熒光的能力由于位于附近的猝滅劑的存在或通過(guò)自猝滅保持不存在。之后，一旦特定探針捕獲其相應(yīng)的單個(gè)核苷酸，其變得容易受外切核酸酶降解影響，由此引起熒光團(tuán)與所述猝滅劑分離和/或彼此分離，并且由此使它們能夠在其特征波長(zhǎng)自由發(fā)熒光。通過(guò)這種方式，每個(gè)小滴中最初存在的單個(gè)核苷酸的性質(zhì)可以從光譜分析推斷。

j.biotech.102(2003)，第1-14頁(yè)，us2008/0194012和labonachip(2012)，第906-915頁(yè)教導(dǎo)了用于各種不同目的的珠子的真空固定。

我們現(xiàn)在開(kāi)發(fā)了用于這種類型的測(cè)序方法的裝置的改進(jìn)的版本，其允許初始多核苷酸消化步驟容易地且可靠地進(jìn)行，并且以能夠利用數(shù)千個(gè)小滴產(chǎn)生位點(diǎn)多重地工作的方式進(jìn)行。該改進(jìn)涉及首先將要分析的多核苷酸(下文為分析物)固定在顆粒的表面，并且之后將所述顆粒固定在所述裝置內(nèi)的位置，在所述位置，通過(guò)跨越它施加負(fù)壓力梯度發(fā)生消化。我們了解，us6471917之前已經(jīng)描述了將小的固體珠子置于有組織的陣列中的系統(tǒng)和技術(shù)，但就我們所知，這樣的技術(shù)尚未應(yīng)用于在流動(dòng)中持有單個(gè)分子或單個(gè)分子測(cè)序應(yīng)用。

因此，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供對(duì)多核苷酸分析物進(jìn)行測(cè)序的裝置，所述裝置包括：

●第一區(qū)域，在其中通過(guò)逐步消化與顆粒連接的分析物的分子產(chǎn)生單個(gè)核苷酸流，所述顆粒位于所述第一區(qū)域中并且暴露于流動(dòng)的水性介質(zhì)；

●第二區(qū)域，在其中從所述水性介質(zhì)和所述核苷酸流產(chǎn)生相應(yīng)的水性小滴流，并且其中至少一些小滴含有單個(gè)核苷酸，和

●第三區(qū)域，在其中儲(chǔ)存和/或詢問(wèn)每個(gè)小滴以揭示所述小滴中可能含有的單個(gè)核苷酸特有的性質(zhì)；

其特征在于，所述第一區(qū)域包括微流體通道，所述水性介質(zhì)通過(guò)所述微流體通道流動(dòng)，并且位置在其壁中包括中空的基座，可以向所述基座中施加抽吸，并且所述顆?？梢跃o密匹配在所述基座中。

本發(fā)明的裝置涉及這樣的區(qū)域，其中通過(guò)使用酶逐步消化多核苷酸分析物產(chǎn)生單個(gè)核苷酸流，優(yōu)選有序的單個(gè)核苷酸流。在一個(gè)實(shí)施方案中，該逐步消化包括使用外切核酸酶的外切核酸酶降解。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其包括使用磷酸酶的磷酸解。在另一個(gè)實(shí)施方案中，消化包括使用聚合酶焦磷酸解。根據(jù)選擇的特定消化模式，分析物可以是單鏈的、雙鏈的或部分雙鏈的多核苷酸，并且可以具有原理上可能不限的核苷酸鏈長(zhǎng)度；例如多至并且包括基因組片段中發(fā)現(xiàn)的數(shù)百萬(wàn)的核苷酸或核苷酸對(duì)。在一個(gè)實(shí)施方案中，分析物因此將是至少50個(gè)，優(yōu)選至少150個(gè)核苷酸或核苷酸對(duì)長(zhǎng)度；適當(dāng)?shù)兀鋵⒋笥?00，大于1000，并且在一些情況下，為5000+個(gè)核苷酸對(duì)長(zhǎng)度。分析物本身適當(dāng)?shù)匕烊粊?lái)源(例如源自植物、動(dòng)物、細(xì)菌或病毒的遺傳物質(zhì))的rna或dna，盡管該方法同等適用于部分或整體合成的rna或dna或?qū)嶋H上由包含天然不常遇到的核苷酸堿基的核苷酸整體或部分制成的其他核酸(即具有除了腺嘌呤、胸腺嘧啶、鳥(niǎo)嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶之外的核堿基的核苷酸)的測(cè)序。這樣的核堿基的實(shí)例包括4-乙?；?，5-(羧基羥基甲基)尿苷，2-o-甲基胞苷，5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷，5-羧基甲基氨基-甲基尿苷，二氫尿苷，2-o-甲基假尿苷，2-o-甲基鳥(niǎo)苷，肌苷，n6-異戊基腺苷，1-甲基腺苷，1-甲基假尿苷，1-甲基鳥(niǎo)苷，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鳥(niǎo)苷，2-甲基腺苷，2-甲基鳥(niǎo)苷，3-甲基胞苷，5-甲基胞苷，n6-甲基腺苷，7-甲基鳥(niǎo)苷，5-甲基氨基甲基尿苷，5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿苷，5-甲氧基尿苷，5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷，5-甲氧基羰基甲基尿苷，2-甲基硫代-n6-異戊烯基腺苷，尿苷-5-氧基乙酸-甲酯，尿苷-5-氧基乙酸，wybutoxosine，wybutosine，假尿苷，queuosine，2-硫代胞苷，5-甲基-2-硫代尿苷，2-硫代尿苷，4-硫代尿苷，5-甲基尿苷，2-o-甲基-5-甲基尿苷和2-o-甲基尿苷。在外切核酸酶降解、磷酸解和焦磷酸解的情形下，產(chǎn)生的單個(gè)核苷酸分別是核苷單磷酸、核苷二磷酸和核苷三磷酸，其具體形式取決于分析物是dna還是rna。

在所述裝置的一個(gè)版本中，將分析物以3’-5’方向逐步焦磷酸解，產(chǎn)生單個(gè)核苷酸三磷酸流，其順序與分析物序列的順序?qū)?yīng)。焦磷酸解本身通常在20至90℃的范圍內(nèi)的溫度在反應(yīng)介質(zhì)(包括聚合酶)的存在下進(jìn)行。其還適當(dāng)?shù)剡M(jìn)行，從而單個(gè)核苷酸由流動(dòng)的水性介質(zhì)連續(xù)從顆粒周圍焦磷酸解的區(qū)域移除。該移除在產(chǎn)生小滴的出口處或與其緊鄰處發(fā)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，將該介質(zhì)緩沖，并且還包含維持焦磷酸解反應(yīng)所需的那些其他成分(聚合酶，焦磷酸根陰離子，鎂陽(yáng)離子等)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，其另外含有以下各項(xiàng)的一種或多種：(a)下文指定的探針類型(或具有等價(jià)功能的探針)；(b)引起探針結(jié)合并捕獲相關(guān)單個(gè)核苷酸所需的各種化學(xué)品和酶(例如聚合酶和/或連接酶)和(3)引起使用的探針的隨后的外切核酸酶降解發(fā)生所需的酶。備選地，這些成分中的一些或全部可以一起或分階段引入到流動(dòng)的水性介質(zhì)中或在第三區(qū)域上游的一些其他點(diǎn)處的小滴中(根據(jù)情況而定)。這樣隨后將這些成分直接引入到小滴可以例如通過(guò)使用注射器注射或通過(guò)小滴合并實(shí)現(xiàn)。

優(yōu)選地，設(shè)計(jì)裝置，使得焦磷酸解的速率盡可能快，并且在一個(gè)實(shí)施方案中，該速率落在1至50個(gè)單個(gè)核苷酸/秒的范圍內(nèi)。關(guān)于如所用的焦磷酸解反應(yīng)以逐步降解多核苷酸的其他信息可以例如在j.biol.chem.244(1969)第3019-3028頁(yè)中找到。

在本發(fā)明的裝置中，將進(jìn)行消化的分析物分子適當(dāng)?shù)嘏c顆粒提前連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，該顆粒包含珠子；例如微珠，其由惰性材料如玻璃、二氧化硅、氧化鋁，金屬或不可降解的聚合物制成。在另一實(shí)施方案中，珠子由磁性材料制成，使得其通過(guò)磁性被引入到裝置中并遞送到希望的位置。

優(yōu)選地，顆粒還包含外表面，所述外表面特異性適于與分析物物理或化學(xué)結(jié)合。存在很多分析物可以這樣結(jié)合的方式，理論上可以使用其中任一種。例如，一種方式涉及用官能化的硅烷如環(huán)氧硅烷、氨基烴基硅烷或巰基硅烷引發(fā)玻璃珠的表面。這樣產(chǎn)生的反應(yīng)性位點(diǎn)隨后可以用已經(jīng)相應(yīng)修飾以包括末端胺、琥珀?；驇€基的分析物衍生物處理。在一個(gè)實(shí)施方案中，化學(xué)連接可以通過(guò)與銜接子寡核苷酸連接或通過(guò)生物素-鏈霉親和素綴合發(fā)生。

在另一實(shí)施方案中，這樣引發(fā)的顆粒將僅具有一個(gè)反應(yīng)性位點(diǎn)，從而分析物的僅一個(gè)分子可以與其連接。如果分析物是小的多核苷酸片段，則這是重要的，原因在于，要不然多重分子傾向于成為被連接的，這是不希望的。如果片段大，則這是次要的考慮，因?yàn)榭臻g效應(yīng)將起作用以妨礙這種現(xiàn)象發(fā)生。適當(dāng)?shù)?，顆粒的最大直徑將在1至5微米的范圍內(nèi)。

裝置中使用的第一區(qū)域適當(dāng)?shù)貫槲⒘黧w尺度的，并且包括至少一個(gè)可以放置顆粒并且通過(guò)施加負(fù)壓力梯度保持固定的位置。在一個(gè)實(shí)施方案中，第一區(qū)域包括微流體通道，如微米尺寸的室或一件微流體管道，并且所述位置在室或管道的壁中包括中空的基座，例如錐臺(tái)基座(frustoconicalseating)，顆粒可以緊密匹配在所述中空的基座中。以此排列方式，基座的中空內(nèi)部與可以施加以真空抽吸的第二通道的入口連接。一旦顆粒就位，隨后可以通過(guò)，例如，施加連續(xù)的抽吸或通過(guò)排空中空的基座的內(nèi)部并在靜態(tài)真空下將其密封來(lái)維持負(fù)壓力梯度。在該裝置類型中，中空的基座適當(dāng)?shù)匚挥诰o接第二區(qū)域的上游處。

水性介質(zhì)從第一區(qū)域以含有彼此在空間上臨時(shí)性分離并且以與分析物的核苷酸序列對(duì)應(yīng)的順序排列的單個(gè)核苷酸的液體流的形式流出。之后，在第二區(qū)域中，通過(guò)使水性介質(zhì)從合適的尺寸和幾何形狀的產(chǎn)生小滴的頭部流向包含不混溶溶劑(如礦物油或烴油，例如硅油)的流動(dòng)的載體介質(zhì)，該水性流隨后轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)應(yīng)的水性小滴流，適當(dāng)?shù)匚⒌瘟?，它們中的至少一些含有單個(gè)核苷酸。備選地，并且在優(yōu)選的實(shí)施方案中，顆粒可以固定在打印機(jī)噴嘴或類似組件的第一區(qū)域上游，在此情況下，任選地，涉及的載體介質(zhì)可以被分散或使其不流動(dòng)。為了避免給定微滴含有多于一個(gè)單個(gè)核苷酸的風(fēng)險(xiǎn)，優(yōu)選的是在焦磷酸解步驟釋放單個(gè)核苷酸和/或調(diào)整水性介質(zhì)通過(guò)第一區(qū)域的流動(dòng)，使得每個(gè)通過(guò)噴嘴產(chǎn)生的填充的(filled)微滴由1至20個(gè)優(yōu)選2至10個(gè)空的微滴分開(kāi)。之后，填充的和未填充的微滴流(任選地在溶劑中)，以微滴維持離散狀態(tài)并且不具有彼此合并的機(jī)會(huì)的速率和方式打印在第三區(qū)域上或使其沿流動(dòng)路徑(適當(dāng)?shù)厥俏⒘黧w流動(dòng)路徑)流到第三區(qū)域。適當(dāng)?shù)兀褂玫奈⒌沃睆叫∮?00微米，優(yōu)選小于50微米，更優(yōu)選小于20微米并且甚至更優(yōu)選小于15微米。所有中最優(yōu)選的是，其直徑在2至20微米的范圍內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，微滴從第二區(qū)域到第三區(qū)域的流速在50至3000小滴/秒的范圍內(nèi)，優(yōu)選100至2000小滴/秒的范圍內(nèi)。

與第二區(qū)域流體連通的第三區(qū)域適于接收和儲(chǔ)存小滴。在一個(gè)實(shí)施方案中，該第三區(qū)域包含表面，如金屬或塑料片或載玻片的表面，其相對(duì)于第二區(qū)域(例如打印機(jī)噴嘴)的外出點(diǎn)(egresspoint)可移動(dòng)，實(shí)際上使得每個(gè)小滴以與噴墨打印機(jī)相似的可重復(fù)方式打印在表面上的指定點(diǎn)。在該設(shè)計(jì)的一個(gè)實(shí)施方案中，接收表面以離散的小滴接收位置(如孔或小滴結(jié)合位點(diǎn))的陣列形成樣式，每個(gè)小滴可以被遞送和固定到所述小滴接收位置。在另一實(shí)施方案中，表面用與小滴不混溶的液體層預(yù)覆蓋，其幫助防止相鄰的小滴經(jīng)歷遷移和合并。在本設(shè)計(jì)的優(yōu)選的版本中，該液體層包含可uv光固化的單體，使得一旦所有小滴接收位置被填滿，液體可以被固化并且小滴可以被永久包封在半透明的固體聚合物基質(zhì)中。

之后依次在每個(gè)小滴接收位置詢問(wèn)樣式化的表面，以揭示每個(gè)小滴可能含有的單個(gè)核苷酸特有的性質(zhì)。盡管可以使該詢問(wèn)與裝置分開(kāi)，例如任選地在另一專門的裝置如分光光度計(jì)內(nèi)，其優(yōu)選使用作為第三區(qū)域的整體部分的詢問(wèn)工具進(jìn)行。

由詢問(wèn)工具檢測(cè)的性質(zhì)理論上可能是直接或間接使其顯示的單個(gè)核苷酸的任意特征性性質(zhì)。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)單個(gè)核苷單磷酸、二磷酸或三磷酸的性質(zhì)，酌情通過(guò)利用電磁輻射詢問(wèn)每個(gè)小滴并且研究經(jīng)歷拉曼散射的光來(lái)確定。在該實(shí)施方案中，源自單個(gè)核苷酸的拉曼散射優(yōu)選通過(guò)在小滴內(nèi)包括能夠被刺激以經(jīng)歷等離子共振的金屬(如金或銀)的膠體來(lái)增強(qiáng)。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，測(cè)量由小滴中存在的熒光團(tuán)產(chǎn)生的熒光射線。在這兩種實(shí)施方案中，詢問(wèn)工具適當(dāng)?shù)匕劢沟娜肷涔庠?，例如激光束；光檢測(cè)器或類似裝置，其調(diào)節(jié)至核苷酸的振動(dòng)模式或熒光團(tuán)的熒光模式的特征波長(zhǎng)或波長(zhǎng)包絡(luò)(wavelengthenvelope)；移除相對(duì)于彼此(例如機(jī)械臺(tái))的表面上的入射光源、光檢測(cè)器和小滴的工具和用于引導(dǎo)和聚焦入射光和熒光束的相關(guān)光學(xué)器件。

兩種裝置類型還可以進(jìn)一步包含與其整體的微處理器，用于分析由詢問(wèn)工具產(chǎn)生的數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)是分析物的序列特有的。如果非常需要，該責(zé)任可以備選地使用獨(dú)立的計(jì)算機(jī)遠(yuǎn)程進(jìn)行。

該裝置特別用于產(chǎn)生和詢問(wèn)這樣的小滴，在所述小滴中，它們含有的單個(gè)核苷酸之前已經(jīng)由僅在它們已經(jīng)被使用并且經(jīng)歷隨后的外切核酸酶降解后能實(shí)質(zhì)上發(fā)熒光的探針選擇性捕獲。概括地，這通過(guò)保證裝置能夠處理在一些點(diǎn)含有對(duì)構(gòu)成分析物的多種單個(gè)核苷酸的一種有選擇性的至少一個(gè)探針類型的分子和酶的小滴，從而允許使用例如聚合酶和/或連接酶將單個(gè)核苷酸結(jié)合入其相應(yīng)探針來(lái)實(shí)現(xiàn)。每個(gè)小滴還將在一些點(diǎn)包含3’-5’外切核酸酶或表現(xiàn)出等價(jià)活性的聚合酶；焦磷酸酶，緩沖液，表面活性劑和生物化學(xué)領(lǐng)域常見(jiàn)的其他成分。在一個(gè)實(shí)施方案中，將這些探針、酶、外切核酸酶和其他成分中的一些、全部或任何排列引入第一區(qū)域中的最初的水性介質(zhì)或包含在最初的水性介質(zhì)進(jìn)料自身內(nèi)。另外，在產(chǎn)生每個(gè)小滴時(shí)或之后，將這些探針、酶、外切核酸酶和其他成分中的一些、全部或任何排列引入水性介質(zhì)。在該情形中，這些物質(zhì)可以通過(guò)例如直接注射或通過(guò)將它們首先放置在包含次級(jí)小滴流的次級(jí)小滴中并之后將來(lái)自該流的小滴逐個(gè)與初級(jí)流中的相應(yīng)小滴合并而被引入到小滴中。

關(guān)于探針本身，可以有利地使用的一種類型是基于各種捕獲系統(tǒng)的那些，并且其使用模式在我們的專利申請(qǐng)wo2014/053853，wo2014/053854，wo2014/167323，和wo2014/167324中教導(dǎo)；它們的內(nèi)容通過(guò)參考結(jié)合于本文。簡(jiǎn)言之，這些探針中的一個(gè)亞型，在其未使用狀態(tài)，特征為包含單鏈核苷酸區(qū)，其末端各自連接兩個(gè)不同的雙鏈寡核苷酸區(qū)。優(yōu)選地，至少一個(gè)所述寡核苷酸區(qū)包含呈現(xiàn)特征性熒光的多個(gè)熒光團(tuán)和任選的猝滅劑。熒光團(tuán)在寡核苷酸區(qū)上排列，使得它們顯現(xiàn)的熒光基本上小于當(dāng)相同數(shù)量的熒光團(tuán)結(jié)合在相應(yīng)數(shù)量的單個(gè)核苷酸時(shí)的熒光。優(yōu)選地，處于其未使用狀態(tài)的探針完全不顯現(xiàn)或基本上不顯現(xiàn)熒光。這些探針這樣起作用：通過(guò)使用聚合酶和任選地連接酶捕獲其相應(yīng)的單個(gè)核苷酸以產(chǎn)生使用過(guò)的探針，隨后該使用過(guò)的探針容易被外切核酸酶降解，導(dǎo)致產(chǎn)生多個(gè)攜帶熒光團(tuán)的單個(gè)核苷酸，所述熒光團(tuán)隨后能夠完全發(fā)熒光。在另一優(yōu)選的亞類中，這些探針由兩種組分組成；互補(bǔ)的i-和j-型寡核苷酸，其中之一或二者可以被標(biāo)記，其可以在它們的靶標(biāo)單個(gè)核苷酸的存在下一起雜交成基本上雙鏈的寡核苷酸，所述基本上雙鏈的寡核苷酸也可以由外切核酸酶消化，如上文解釋的。

在另一優(yōu)選的亞類(在我們的待審申請(qǐng)pct/gb2015/052119中公開(kāi)并且通過(guò)參考結(jié)合于本文)中，探針包含：(a)第一單鏈寡核苷酸，將其用處于不可檢測(cè)狀態(tài)的特征性熒光團(tuán)標(biāo)記，和(b)第二和第三單鏈寡核苷酸，其能夠與第一寡核苷酸上的互補(bǔ)區(qū)雜交。在該特別亞類的情況下，可以將使用的探針用具有雙鏈核酸外切降解活性的酶消化，得到處于可檢測(cè)狀態(tài)的可檢測(cè)元件和單鏈的第四寡核苷酸，所述第四寡核苷酸至少部分與第一寡核苷酸序列互補(bǔ)。結(jié)果，可以引起第四寡核苷酸與另一標(biāo)記的第一寡核苷酸反應(yīng)，再次產(chǎn)生基本上雙鏈的寡核苷酸產(chǎn)物，其對(duì)應(yīng)于使用的探針。通過(guò)循環(huán)重復(fù)該步驟和外切核酸酶降解步驟，可以引起能夠發(fā)熒光的自由熒光團(tuán)的數(shù)量級(jí)聯(lián)并顯著增加。該類型中最優(yōu)選的項(xiàng)包括其中第二和第三寡核苷酸包含共有第四寡核苷酸的單個(gè)寡核苷酸區(qū)的那些探針，其在捕獲其互補(bǔ)靶標(biāo)單個(gè)核苷酸后，產(chǎn)生抗外切核酸酶降解的單鏈閉環(huán)寡核苷酸，并且其可以用作模板用于一系列第一寡核苷酸的雜交和隨后的外切核酸酶降解。

從以上顯而易見(jiàn)的是，在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選設(shè)計(jì)本發(fā)明的裝置從而以用于在包含單個(gè)核苷酸的小滴中產(chǎn)生熒光的特定方法使用。因此，根據(jù)本發(fā)明的第二方面，進(jìn)一步提供對(duì)多核苷酸分析物進(jìn)行測(cè)序的方法，所述方法包括以下步驟：

(a)通過(guò)將與顆粒連接的分析物分子逐步焦磷酸解產(chǎn)生單個(gè)核苷酸三磷酸流，所述顆粒暴露于流動(dòng)的水性介質(zhì)；

(b)從所述水性介質(zhì)和所述單個(gè)核苷酸流產(chǎn)生小滴流，其中至少一些小滴含有單個(gè)核苷酸；和

(c)儲(chǔ)存和/或詢問(wèn)每個(gè)小滴并且檢測(cè)所述小滴中可能含有的單個(gè)核苷酸特有的性質(zhì)；

其特征在于步驟(a)還包括將所述顆粒固定在微流體通道中緊密匹配的中空的基座中的亞步驟，能夠向所述中空的基座中施加抽吸。

在該方法的一個(gè)實(shí)施方案中，水性介質(zhì)在給定點(diǎn)還包含對(duì)捕獲構(gòu)成分析物的核苷酸類型中的一種有選擇性的至少一個(gè)單個(gè)-核苷酸探針，并且所述探針能夠僅在它們已經(jīng)捕獲了單個(gè)核苷酸并且經(jīng)歷隨后的外切核酸酶降解后實(shí)質(zhì)上發(fā)熒光。優(yōu)選這些探針是上述類型的成員。在另一實(shí)施方案中，探針包含在最初流動(dòng)的水性介質(zhì)內(nèi)或在每個(gè)小滴產(chǎn)生后隨后直接引入每個(gè)小滴中。另外，方法還包括步驟(d)，其包括檢測(cè)由每個(gè)小滴發(fā)出的熒光射線并由其組裝序列數(shù)據(jù)。

在另一實(shí)施方案中，方法包括下述在前步驟：將分析物分子連接于多個(gè)顆粒的表面；選擇使用的顆粒和通過(guò)抽吸的方式將選擇的顆粒連接到其位置。這里的顆粒適當(dāng)?shù)匕ň哂蟹磻?yīng)性表面的珠子。

現(xiàn)在通過(guò)下圖1和2說(shuō)明本發(fā)明所述的裝置，圖1和2示例性說(shuō)明本發(fā)明所述的測(cè)序裝置，其中產(chǎn)生并詢問(wèn)包含單個(gè)核苷酸和檢測(cè)核苷酸的寡核苷酸探針系統(tǒng)的水滴。

向直徑為十微米的微流體管1提供側(cè)通道2，可以向所述側(cè)通道2施加真空抽吸。2與1在接合點(diǎn)相交，所述接合點(diǎn)包含具有兩微米內(nèi)徑的環(huán)狀橫截面的錐臺(tái)孔口3。之前將直徑為四微米的球形玻璃珠4引入1并且就位在3中，使得當(dāng)使水性介質(zhì)5的流從3上游的引入點(diǎn)流過(guò)1時(shí)，其外表面的大部分突出進(jìn)入水性介質(zhì)5的流中。通過(guò)鏈霉親和素綴合連接于4的是包含1000個(gè)核堿基的dna雙鏈片段的分析物。5包含在37℃緩沖的(ph7.5)反應(yīng)介質(zhì)，包含bst大片段dna聚合酶和2毫摩爾/升濃度的焦磷酸鈉和氯化鎂中的每一種。將珠子的溫度維持在37℃，并且在這些條件下，聚合酶逐步在3’到5’方向上消化分析物，由此釋放單個(gè)核苷酸(脫氧核糖核苷酸三磷酸)流，其隨后通過(guò)介質(zhì)的流動(dòng)被攜帶到4的下游。5的下游部分中的單個(gè)核苷酸的順序因此對(duì)應(yīng)于其在分析物中的最初序列。5的下游部分從小滴頭6出現(xiàn)，進(jìn)入第一室7中，在那里其與一個(gè)或多個(gè)輕硅油8流接觸。選擇這些流在接觸點(diǎn)的速度以避免湍流混合，并且產(chǎn)生基本上水性的球狀小滴9，其懸浮在油中，各自具有約八微米的直徑。然后9的流以1000小滴/秒的速度沿相同直徑的第二微流體管向前進(jìn)入第二室10，同時(shí)使用第二小滴頭12將五微米水性球狀小滴11的第二流進(jìn)料至所述第二室10中。小滴11包含檢測(cè)核苷酸的寡核苷酸探針系統(tǒng)，如下文概述的那種，并且使其以順序的方式與9合并，形成直徑約為九微米的放大的水性小滴13。隨后將這樣產(chǎn)生的小滴13的流遞送到打印機(jī)組件14(提供有小滴打印機(jī)頭14a)，在這里每個(gè)小滴依次被打印到載玻片15上，所述載玻片15可沿平面的限定了其面的兩個(gè)軸移動(dòng)，并且用對(duì)于含有單個(gè)小滴的孔16的二維陣列形成樣式。

然后將小滴在載玻片上溫育，之后用包含一個(gè)或多個(gè)激光器17和檢測(cè)器18(調(diào)節(jié)到適當(dāng)波長(zhǎng)用于激發(fā)和檢測(cè)來(lái)自用于探針系統(tǒng)的熒光染料的熒光)的檢測(cè)系統(tǒng)詢問(wèn)。然后在高于確定的閾值的給定波長(zhǎng)的熒光檢測(cè)表明在小滴內(nèi)存在給定類型的單個(gè)核苷酸堿基。因此，隨著依次詢問(wèn)小滴，可以有效讀出最初多核苷酸分析物中的核苷酸堿基的序列。

現(xiàn)在詳細(xì)描述可以用于上述系統(tǒng)的寡核苷酸探針系統(tǒng)的實(shí)例。

制備單鏈第一寡核苷酸1，其具有以下核苷酸序列：

5′tcgtgcctcatcgaacatgacgaggxxqxxggtttgtggt3′

其中a，c，g，和t表示攜帶dna的相關(guān)特征性核苷酸堿基的核苷酸；x表示使用常規(guī)胺連接化學(xué)用atto655染料標(biāo)記的脫氧胸苷核苷酸(t)，并且q表示用bhq-2猝滅劑標(biāo)記的脫氧胸苷核苷酸。其進(jìn)一步包含對(duì)捕獲脫氧胸苷三磷酸核苷酸(dttps)具有選擇性的捕獲區(qū)(a核苷酸)。

還制備另一單鏈寡核苷酸2，其包含：(1)第二寡核苷酸區(qū)，其具有以單個(gè)堿基錯(cuò)配與第一寡核苷酸的3’末端互補(bǔ)的序列；(2)第三寡核苷酸區(qū)，其具有與第一寡核苷酸的5’末端互補(bǔ)的序列，和(3)76個(gè)堿基對(duì)的單鏈接頭區(qū)。其具有以下核苷酸序列：

5′pcatgttcgatgaggcacgatagatgtacgctttgacatacgctttgacaatacttgagcagtcggcagatataggatgttgcaagctccgtgagtcccacaaaccaaaaacctcg3′

其中另外的p表示5’磷酸基團(tuán)。

然后制備包含探針系統(tǒng)的反應(yīng)混合物，其具有與源自以下配方相對(duì)應(yīng)的組成：

56ul5x緩沖液ph7.5

28ul寡核苷酸1，100nm

28ul寡核苷酸2，10nm

2.8uldntps(包括dttp)的混合物，10nm

0.4uphusionii熱啟動(dòng)聚合酶(外切核酸酶)

1.6ubst大片段聚合酶

20u大腸桿菌(e.coli)連接酶

4u熱穩(wěn)定性無(wú)機(jī)焦磷酸酶

加水到280ul

其中5x緩沖液包含以下混合物：

200ultrizma鹽酸鹽，1m，ph7.5

13.75ul水性mgcl2，1m

2.5ul二硫蘇糖醇，1m

50ultritonx-100表面活性劑(10％)

20ul煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，100um

166.67ulkcl

加水至1ml

在存在單個(gè)dttp核苷酸的情況下，將所述核苷酸結(jié)合在寡核苷酸2中的一個(gè)的3’末端并且發(fā)生寡核苷酸2的連接，形成閉環(huán)的使用的探針。通過(guò)在37℃溫育50分鐘進(jìn)行該過(guò)程。然后將反應(yīng)介質(zhì)在70℃另外溫育50分鐘，激活phusionii聚合酶。寡核苷酸1中的一個(gè)在此溫度可以與成環(huán)的寡核苷酸2退火，并且該雙鏈形式由聚合酶消化，釋放其熒光團(tuán)成為可檢測(cè)狀態(tài)。然后另一寡核苷酸1能夠與成環(huán)的探針退火，使得該過(guò)程以連續(xù)的循環(huán)重復(fù)，并且導(dǎo)致熒光強(qiáng)度隨時(shí)間增長(zhǎng)。

還制備其他組的類似寡核苷酸探針，它們具有不同的捕獲位點(diǎn)、序列和熒光團(tuán)，它們與第一探針組組合，從而實(shí)現(xiàn)四種核苷酸堿基的捕獲、檢測(cè)和區(qū)分。

序列表

<110>貝斯4創(chuàng)新有限公司

<120>具有珠定位器的小滴測(cè)序儀

<130>p62385wo

<150>gb1501012.7

<151>2015-01-21

<160>2

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>40

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸1

<220>

<221>misc_feature

<222>(26)..(26)

<223>用atto655染料標(biāo)記的脫氧胸苷核苷酸(t)

<220>

<221>misc_feature

<222>(27)..(27)

<223>用atto655染料標(biāo)記的脫氧胸苷核苷酸(t)

<220>

<221>misc_feature

<222>(28)..(28)

<223>用bhq-2猝滅劑標(biāo)記的脫氧胸苷核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(29)..(29)

<223>用atto655染料標(biāo)記的脫氧胸苷核苷酸(t)

<220>

<221>misc_feature

<222>(30)..(30)

<223>用atto655染料標(biāo)記的脫氧胸苷核苷酸(t)

<400>1

tcgtgcctcatcgaacatgacgaggtttttggtttgtggt40

<210>2

<211>115

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸2

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1)

<223>連接于胞嘧啶的5'磷酸基團(tuán)

<400>2

catgttcgatgaggcacgatagatgtacgctttgacatacgctttgacaatacttgagca60

gtcggcagatataggatgttgcaagctccgtgagtcccacaaaccaaaaacctcg115