本發(fā)明涉及一種雙酚A的適配體親和柱及其制備方法和用途。屬食品安全檢測領域。

背景技術：

雙酚A 是2，2-雙（4-羥基苯基）丙烷的俗稱，又稱二酚基丙烷， 由2 分子苯酚和1 分子丙酮在酸性介質(zhì)中催化縮合而成的酚類物質(zhì)。它是生產(chǎn)聚碳酸酯（Polycarbonate，PC） 及環(huán)氧樹脂（epoxyResin，EP）的主要原料，又可用作酚醛樹脂、可塑性聚酯、抗氧劑及聚氯乙烯（PVC）穩(wěn)定劑等。在食品包裝方面， 添加BPA 的塑料具有無色透明、耐用、輕便以及抗摔等特性，在食品包裝材料、容器內(nèi)壁涂料等方面有著重要的用途，尤以嬰兒奶瓶，金屬罐容器的內(nèi)涂層最為普遍存在。

雙酚A 可通過食品包裝和塑料薄膜遷移到食品或是飲料中，被人體吸收，進而逐步危害人體健康，可使人類和野生動物的內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)異常，還會嚴重干擾人類和動物的生殖遺傳功能。研究報道，雙酚A 具有雌性激素的特性，對肝臟、腎臟、乳腺有一定的損傷; 同時雙酚A 也與肥胖癥、糖尿病以及男性不孕有關，研究證實，低劑量的雙酚A( 10 ^-7 mol /L) 即能引起支持細胞和精子細胞死亡。雙酚A 的危害已引起諸多研究者及世界衛(wèi)生組織的廣泛關注，很多國家已經(jīng)頒布了相關法律，禁止在食品包裝材料中添加含雙酚A 的物質(zhì)，尤其是嬰兒用品。2014 年，歐洲食品安全局提議將目前雙酚A 每日最大攝入量由0．05 mg /( kg·d) 降低到0．005 mg /( kg·d) 。1994 年，我國公布的衛(wèi)生標準中對雙酚A 用量規(guī)定為每升蒸餾水中所含的雙酚A 要小于0.05 mg。盡管目前對雙酚A 的限量在不斷降低，但由于管理不夠規(guī)范，人們在日常生活中經(jīng)常食用的食品常常使用以雙酚A 作為添加劑的材料包裝。有研究表明，在某些食品、紙杯、人體血液、人體尿液、人體唾液、自然界中的水、奶瓶等樣品中均可檢測出雙酚A。由于雙酚A 危害極大，因此建立檢出限低、準確、快速的雙酚A 檢測方法尤為重要。

雙酚A的檢測方法包括熒光法、酶聯(lián)免疫吸附法、紫外分光光度法、氣相色譜發(fā)及高效液相色譜法等。

紫外分光光度法利用雙酚A在278nm波長是具有吸收峰來檢測，其優(yōu)點是操作簡單便捷。但此方法受到環(huán)境影響及溶劑影響很大，準確度不高，并且變異較大。

酶聯(lián)免疫吸附技術法利用抗原抗體特異性結合的特點來檢測，具有特異性高，靈敏性強，且檢測成本低的優(yōu)點。BPA 是一種小分子，不能直接用于免疫動物， 但可以與抗體發(fā)生特異性結合反應。競爭型酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）就是利用這種特性。石春紅[食品工業(yè)科技，2011（01），290-292]等建立了間接競爭ELISA檢測雙酚A的方法，檢測限為1 ng/mL， 對PC 材質(zhì)的桶裝水做回收試驗， 回收率為92.5%～107.7%。但是由于雙酚A是小分子，免疫原性弱，難以獲得高親和力的抗體。從而限制了此方法的開發(fā)。

原子熒光光譜法是以原子在輻射能激發(fā)下發(fā)射的熒光強度進行定量分析的發(fā)射光譜分析法．唐舒雅等[工業(yè)水處理，２００６，２６（３）：７４－７６］利用在ｐＨ＝１的酸性介質(zhì)中，β－環(huán)糊精對ＢＰＡ熒光強度有增強作用的特點，建立了熒光測定法．該方法的線性范圍為0.4-300ug/L，相對標準偏差為1.3%，檢出限為0.02ug/L。

高效液相色譜法( HPLC)具有準確度高、靈敏性強、可微量測定等優(yōu)點,是目前常用于食品中小分子檢測的方法。尤其是高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術在雙酚A的檢測中廣泛應用。但因其此方法對樣品中小分子純度的要求較高,導致檢測成本高、周期長,無法滿足大批量樣品快速篩選的需要,所以使用受到限制。今年來發(fā)展起來的固相萃取柱-高效液相色譜（SPE-HPLC)）將固相萃取技術與高效液相色譜相結合。使HPLC的使用更加廣泛。固相萃取作為一種新的凈化技術,在食品安全分析檢測中應用越來越廣泛。它是將疏水性固相載體上填充柱管制備而成。當樣品提取液通過柱子時,由于樣本中物質(zhì)的極性的不同而分離開來。分步洗脫就能得到純度較高的目的物。

但是由于樣本中成分復雜，很多物質(zhì)都具有相似的極性，導致固相萃取得到的洗脫產(chǎn)物常常組分較多。導致固相萃取得到的雙酚A雜質(zhì)較多，影響隨后的HPLC檢測。因而，需要一種特異性的雙酚A純化方法。

免疫親和柱是替代固相萃取柱常用的凈化手段，利用抗原抗體特異性的親和作用來分離目標物。是替代固相萃取柱的理想選擇。免疫親和柱-高效液相色譜聯(lián)用（IAC-HPLC）也是目前食品安全檢測常用的檢測技術。免疫親和柱具有操作簡單，特異性高的優(yōu)點。但是由于抗體獲得困難，免疫親和柱通常比較昂貴。并且由于抗體本身是一種蛋白質(zhì)，其活性受到周圍環(huán)境的影響。保存不當或者操作不當很容易造成抗體失活從而影響免疫親和柱的效率。由于雙酚A是小分子物質(zhì)，免疫原性差，用于制備抗體難度很大。導致無法得到有效的雙酚A抗體用于制備免疫親和柱。

適配體是一段核酸序列，通常為DNA或者RNA序列。 單鏈的核酸序列可以形成二級結構，從而能與靶點特異性結合。通過多次的富集和篩選，能夠篩選到與靶點有高親和力的特異性適配體。Herman等描述了核酸適配體的結合特異性，[Science 287,820-825].核酸適配體相對于抗體來說更穩(wěn)定，不易受到環(huán)境的影響，并且核酸適配體可以化學合成，保證序列的準確性。[Song. Trends Analy. Chem 2008.27(2)]。

核酸適配體被應用于小分子的檢測，在專利CN105505940A中，描述了一種黃曲霉毒素B1的適配體DNA傳感器。通過黃曲霉毒素B1的適配體，及多條互補探針序列制備DNA傳感器，通過酶底物反應，實現(xiàn)黃曲霉毒素B1的檢測。在專利CN104399283中，描述了一種黃曲霉毒素B1的適配體親和柱。該專利利用環(huán)氧基活化的瓊脂糖微球，將黃曲霉毒素B1的適配體偶聯(lián)，制備成親和柱。實現(xiàn)黃曲霉毒素B1的分離。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種雙酚A適配體親和柱及其制備方法和用途

在本發(fā)明中，我們利用SELEX系統(tǒng)，從適配體文庫中篩選出來一組高特異性、高親和力的的新的雙酚A的單鏈DNA適配體。適配體修飾后與N-羥基琥珀酰亞胺活化的載體通過共價鍵進行偶聯(lián)。經(jīng)過洗滌和封閉得到雙酚A的特異性載體。載體裝柱后就形成了高親和力的雙酚A適配體親和柱

該親和柱操作簡便，純化雙酚A效率高。能耐受有機溶劑，并且可以重復使用。樣本經(jīng)過簡單的處理后就可以進行純化，得到純度很高的雙酚A。用于高效液相色譜檢測和質(zhì)譜檢測。

具體操作如下：

本發(fā)明最大的優(yōu)勢就是利用了核酸適配體的特性，通過多輪的富集、洗滌、擴增等步驟，篩選出針對雙酚A的特異性適配體。通過序列測定得到適配體的序列

核酸適配體相對于抗體來說，具有適應環(huán)境廣泛，能夠耐受高溫、能耐受有機溶劑并且操作方便等優(yōu)點。最主要的，適配體在制備過程中不需要經(jīng)過動物體內(nèi)的過程，而是通過化學合成來獲得。因此，生產(chǎn)周期短，并且可以通過合成條件保證序列的準確性

以核酸適配體為基礎制備的親和柱具有特異性好，雙酚A結合量大，純化效率高的特點

雙酚A適配體親和柱及其制備方法說明如下

1.選擇N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）修飾的瓊脂糖載體sepharose4B，進行活化

取1gN-羥基琥珀酰亞胺修飾的瓊脂糖，加入用50ml 1mM的HCl，溶脹30min后，凝膠用100ml 1mM HCl洗滌6次，再用100ml超純水洗滌

2.將活化好的瓊脂糖凝膠sepharose4B用偶聯(lián)緩沖液（0.1M的NaHCO₃，0.8M NaCl，PH8.2）洗滌3次。加入20mol/L的氨基修飾的雙酚A適配體，室溫偶聯(lián)8小時

3.將偶聯(lián)好的雙酚A適配體-瓊脂糖載體用20mM，PH7.4的磷酸緩沖液PBS洗滌3次

4.封閉

將偶聯(lián)好的雙酚A適配體-瓊脂糖載體中加入100mmol/L的Tris.Cl PH8.0 ，室溫反應2小時

5.將封閉好的雙酚A適配體-瓊脂糖載體用20mM，PH7.4的磷酸緩沖液PBS洗滌3次

6.裝柱

將雙酚A—瓊脂糖載體根據(jù)需要裝入層析柱中，可根據(jù)需要制備不同容量的雙酚A親和柱。層析柱的結構如附圖1所示：

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

1.本發(fā)明充分的利用了核酸適配體的優(yōu)點，通過多輪的篩選和富集。得到了高特異性高親和力的雙酚A核酸適配體。該適配體能夠特異性的結合樣本中的雙酚A，有效去除了固相萃取柱常見的雜質(zhì)較多，組分復雜的缺點。降低了抗體親和柱經(jīng)常遇到的交叉反應性。親和柱效率大幅度提高

核酸適配體不受操作環(huán)境和有機溶劑的影響，尤其適合真菌毒素類的脂溶性物質(zhì)的純化。相比較，具有同樣結合特異性的免疫親和柱，因為其中的抗體不耐有機溶劑，有機溶劑常常會造成抗體的失活而使親和柱效率降低

此外，由于有機溶劑導致抗體失活，因此免疫親和柱通常為一次性使用。而核酸適配體親和柱可以耐受有機溶劑，可以重復使用多次，大幅度降低了使用成本

2.本發(fā)明使用的核酸適配體可以通過化學合成法獲得，可以保證序列的正確性。大幅度降低了不同批次間的變異。而相對來說，不同批次的抗體來自于不同的小鼠或者兔子，導致抗體間質(zhì)量變異較大，使親和柱質(zhì)量存在差別

3.使用本發(fā)明純化雙酚A操作簡便，幾步就可以得到純度較高的雙酚A。更方便操作者使用

4.使用本發(fā)明的產(chǎn)品得到的雙酚A純度很高，后續(xù)不用再做別的純化處理就可以直接用于高效液相色譜檢測或者熒光檢測。節(jié)省了操作者的時間和費用。

附圖說明

圖1：雙酚A適配體親和柱結構組份示意圖

A：進樣口塞；B：活塞適配器；C：穩(wěn)定箍；D：上篩板；E：柱體；F：載體填料；G：下篩板；H：出樣口堵頭

圖2：雙酚A適配體親和柱外觀結構圖

A：進樣口塞；B：活塞適配器；C：穩(wěn)定箍；D：上篩板；E：柱體；F：載體填料； G：下篩板；H：出樣口堵頭

圖3：水中雙酚A檢測的質(zhì)譜檢測圖

圖4：奶粉樣本中雙酚A檢測的質(zhì)譜檢測圖。

具體實施方式

實施例1：利用氨基修飾的雙酚A適配體制備親和柱

本發(fā)明制備雙酚A適配體親和柱的一個優(yōu)選的實施方案如下：

1.載體活化

選擇N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）修飾的瓊脂糖載體sepharose4B，進行活化

取1gN-羥基琥珀酰亞胺修飾的瓊脂糖，加入用50ml 1mM的HCl，溶脹30min后，凝膠用100ml 1mM HCl洗滌6次，再用100ml超純水洗滌

2.將活化好的瓊脂糖凝膠sepharose4B用偶聯(lián)緩沖液（0.1M的NaHCO₃，0.8M NaCl，PH8.2）洗滌3次。加入20mol/L的氨基修飾的雙酚A適配體，室溫偶聯(lián)8小時

3.將偶聯(lián)好的雙酚A適配體-瓊脂糖載體用20mM，PH7.4的磷酸緩沖液PBS洗滌3次

4.封閉

將偶聯(lián)好的雙酚A適配體-瓊脂糖載體中加入100mmol/L的Tris.Cl PH8.0 ，室溫反應2小時

5.將封閉好的雙酚A適配體-瓊脂糖載體用20mM，PH7.4的磷酸緩沖液PBS洗滌3次

6.裝柱

將交聯(lián)后的雙酚A-瓊脂糖凝膠用10毫升20mM PBS PH7.4重懸，然后裝入空的親和純化柱柱體中

1) 取空的柱體，加入下方篩板，加入1mlPBS，使其自然流干

2)加下方出樣口堵頭，在柱體中加入1ml上述處理后的雙酚A適配體-瓊脂糖凝膠載體，靜止5分鐘，使載體自然沉降

3)加入上方篩板，按壓篩板，使其到達載體上方

4)加入活塞適配器，適配器有一個壓緊作用，使上方篩板緊貼載體

5)從下方將穩(wěn)定箍套在柱體上，使其緊貼進樣口

6)拔掉出樣口堵頭，用注射器取5mlPBS，將注射器接在進樣口上，緩慢的將PBS注入親和柱中，使出液速度保持在1-2滴/秒。直至全部液體注入親和柱

7)套上出樣口堵頭，套上進樣口塞，將制備好的雙酚A適配體親和柱放入4℃保存。

實施例2：利用生物素修飾的雙酚A適配體制備親和柱

本發(fā)明制備雙酚A適配體親和柱的一個優(yōu)選的實施方案如下：

1.取1ml鏈霉親和素（SA）修飾的瓊脂糖凝膠sepharose4B，用10ml超純水洗滌3次

2.將（SA）修飾的瓊脂糖凝膠sepharose4B用偶聯(lián)緩沖液（0.02M的PBS，0.8M NaCl，PH7.4）洗滌3次。加入20mol/L的生物素修飾的雙酚A適配體，室溫偶聯(lián)4小時

3.將偶聯(lián)好的雙酚A適配體-瓊脂糖載體用20mM，PH7.4的磷酸緩沖液PBS洗滌3次

4.裝柱

將雙酚A—瓊脂糖載體根據(jù)需要裝入層析柱中，可根據(jù)需要制備不同容量的雙酚A親和純化柱

1)取空的柱體，加入下方篩板，加入1mlPBS，使其自然流干

2)加下方出樣口堵頭，在柱體中加入1ml上述處理后的雙酚A適配體-瓊脂糖凝膠載體，靜止5分鐘，使載體自然沉降

3)加入上方篩板，按壓篩板，使其到達載體上方

4)加入活塞適配器，適配器一個壓緊作用，使上方篩板緊貼載體

5)從下方將穩(wěn)定箍套在柱體上，使其緊貼進樣口

6)拔掉出樣口堵頭，用注射器取5mlPBS，將注射器接在進樣口上，緩慢的將PBS注入親和柱中，使出液速度保持在1-2滴/秒。直至全部液體注入親和柱

7)套上出樣口堵頭，套上進樣口塞，將制備好的雙酚A適配體親和柱放入4℃保存。

實施例3：利用雙酚A適配體親和柱純化和水中的雙酚A

本實施例利用正常的純化水樣本中加入雙酚A的標準品，然后用雙酚A適配體親和柱進行純化，純化后用高效液相色譜檢測。測定回收率

1.樣品處理

按照每毫升水樣品10ng的標準，在水中添加雙酚A標準品；

w將免疫親和柱連接于10.0 ml一次性注射器下

w準確移取10ml加入雙酚A標準品后的水樣，注入一次性注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接調(diào)節(jié)開關，使液體以1～2滴/秒的速度流出

w待液體排干后，首先用0.1%Tween-20水溶液洗滌10mL，再用蒸餾水或去離子水洗滌10mL，流速2～3滴/秒

w待液體排干后，更換新針筒，上樣2ml乙腈，用刻度試管接洗脫液，流速1滴/秒；

w 洗脫后液體用氮氣在 30℃條件下吹至近干

w 用10%乙腈水溶液溶解并定容到1ml

w 洗脫液用0.22μm微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶用于HPLC分析

2.洗脫產(chǎn)物用高效液相色譜HPLC檢測

高效液相色譜檢測結果顯示，從檢測結果可以看出，在10毫升的水中加入100ng的雙酚A，用本發(fā)明的適配體親和柱可以回受到92.4ng，回收率為92.4%

質(zhì)譜圖見附圖3。

實施例4：利用雙酚A適配體親和柱純化和檢測奶粉樣品中的雙酚A

1.前處理

按照每克奶粉樣品100ng的標準，在奶粉樣品中添加雙酚A標準品

w取1g奶粉樣本，加入100ng雙酚A標準品，加入10ml 10mmolPBSPH7.4緩沖液，充分震蕩混勻

w用快速定性濾紙過濾，收集濾液

w 全部濾液作為上樣液過親和柱凈化

2. 凈化

w 將親和柱連接于10.0 ml一次性注射器下。按照前處理要求，準確移取相應體積的樣品提取液注入一次性注射器中，將空氣壓力泵與玻璃注射器連接調(diào)節(jié)開關，使液體以1～2滴/秒的速度流出

w 待液體排干后，用蒸餾水或去離子水洗滌2次，每次10mL

w 待液體排干后，上樣1mL甲醇，流速1滴/秒，收集洗脫液并定容至1mL

w 洗脫液用0.22μm微孔濾器過濾后轉(zhuǎn)移至樣品瓶用于HPLC分析

檢測結果顯示，在1g奶粉中加入100ng雙酚A標準品，回收89.8ng，回收率89.8%

質(zhì)譜圖見附圖4。

實施例5：雙酚A適配體親和柱重復使用柱容量的變化

本實施例利用定量的雙酚A的標準品，然后用雙酚A適配體親和柱進行純化。親和柱上的雙酚A用有機溶劑洗脫后，用高效液相色譜檢測其濃度。親和柱重新平衡后重復上樣和洗脫，測定洗脫的雙酚A濃度。主要目的是測試雙酚A適配體親和柱的重復使用性

1. 配制1ug/ml的雙酚A標準品

2.取出雙酚A適配體親和柱，打開進樣口塞，進樣口與注射器針筒連接，注射器接入到氣控操作架上

3.打開出樣口塞，用10mmol/L PBS PH7.4洗滌親和柱3次，每次10毫升，調(diào)節(jié)氣孔操作架氣泵壓力，使液體以3滴/秒的流速流出

4.取100ul上述配制的雙酚A標準品，總量100ng，加入親和柱柱中，調(diào)節(jié)流量至1-2滴/秒。直至樣品全部流出親和柱

5.用蒸餾水洗滌純化柱3次，每次5毫升

6.加入1ml甲醇，收集洗脫產(chǎn)物

7.洗脫產(chǎn)物用高效液相色譜HPLC檢測

8.親和柱用超純水洗滌3次，每次10ml，然后用10mmol/L PBS PH7.4洗滌親和柱3次，每次10毫升

9.再次上樣100ul雙酚A標準品，總量100ng

10. 按照上述操作洗滌及洗脫，洗脫產(chǎn)物用高效液相色譜檢測其濃度

11. 再重復步驟8.9.10三次。檢測洗脫產(chǎn)物的濃度

12. 計算總共5次的雙酚A適配體親和柱純化的回收率

高效液相色譜檢測結果見表4：

從上述結果可以看出，雙酚A適配體親和柱重復使用5次后，其結合能力沒有明顯的降低。

雙酚A適配體序列1：

5'-CCGGTGGGTGGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA-3'

雙酚A適配體序列2：

5'-CCGCCGTTGGTGTGGTGGGCCTAGGGCCGGCGGCGCACAGCTGTTATAGACGTCTCCAGC-3'

雙酚A適配體序列3：

5'-CCGCCGTTGGTGTGGTGGGCCTAGGGCCGGCGGCGCACAGCTGTTATAGACGCCTCCAGC-3'