本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及親水的樹枝狀分子和C18長鏈修飾的磁性石墨烯材料及其制備方法和在蛋白富集中的應用。

背景技術(shù)：

生命科學隨著基因組測序計劃的完成實現(xiàn)了巨大的進展，同時也進入了后基因組時代，而蛋白質(zhì)組學也隨之成為后基因組時代的研究前沿和熱點領(lǐng)域。蛋白質(zhì)是生命功能的執(zhí)行者，也是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究將直接闡述生命在生理或病理下的變化機制。近年來，蛋白質(zhì)的分離和鑒定成為蛋白質(zhì)組學中非常重要的一個部分。以液相色譜和生物質(zhì)譜為技術(shù)手段的一系列研究手段逐漸被運用到蛋白質(zhì)的分離和鑒定中。然而也遇到了一些挑戰(zhàn)。比如有很多疾病相關(guān)的蛋白，它們在生物樣品中存在的豐度很低，直接對其進行色譜和質(zhì)譜的鑒定很困難，因而，去尋找合適而快捷的富集方法在蛋白質(zhì)的鑒定中顯的尤為重要。

石墨烯從發(fā)現(xiàn)以來由于它大的比表面積、表面富余的電子以及可修飾等特點得到了大量研究者的關(guān)注，而在生物分析研究領(lǐng)域，越來越多的以石墨烯為基底的材料也應運而生，廣泛地運用到分離和富集的目標中。同時，C18長鏈超強的疏水作用也被運用到低豐度肽段和蛋白的富集中。近年來，一種親水的聚酰胺-胺型樹枝狀分子（PAMAM）由于其表面大量的官能團和超強的親水作用引起了研究者的關(guān)注。

在眾多蛋白中，雖然大多數(shù)蛋白為疏水蛋白，但是也不乏大多親水的糖蛋白在生物體內(nèi)也發(fā)揮著重要的作用，據(jù)我們所知，尚未有研究表明一種材料同時結(jié)合親水和疏水的性能而運用于蛋白的富集中。結(jié)合這一目標，本發(fā)明設(shè)計了一種利用磁性石墨烯材料為基底，在其表面接枝一種親水的樹枝狀高分子PAMAM和C18的長鏈，從而達到分離和富集不同種蛋白的方法。這種方法成功的提高了蛋白的富集效率，對于蛋白的普適性很強，同時也有著很低的檢測限。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提出一種操作簡便，樣品損失率低，以親疏水富集為機理，高效率低檢測限的蛋白富集方法。

本發(fā)明提出的蛋白富集方法，是一種基于樹枝狀分子和C18長鏈修飾的磁性石墨烯材料對于蛋白富集方法。

本發(fā)明首先以磁性石墨烯為基底，在其表面包覆一層易于修飾的無孔二氧化硅，然后通過氨基和C18硅烷化試劑，在其表面修飾上氨基和C18長鏈，最后通過戊二醛交聯(lián)法將一種親水的樹枝狀分子聚酰胺-胺（PAMAM）接枝在氨基表面，得到親疏水的磁性材料。該新型磁性材料擁有較大的比表面積，親疏水相間的性能，用于蛋白富集，可完成對不同種蛋白的富集。

本發(fā)明提出的樹枝狀分子和C18長鏈修飾的磁性石墨烯材料的制備方法，具體步驟如下：

（1）將400-600 mg石墨烯分散到50-70 mL濃硝酸中，50-70 ℃水浴回流6-10小時；

（2）將步驟（1）所得產(chǎn)物進行離心、分離，用去離子水清洗至溶液為中性；

（3）將步驟（2）所得產(chǎn)物在40-60 ℃下真空干燥，放置保存，得到酸化石墨烯；

（4）將400-500 mg FeCl₃?6H₂O 溶于40-60 mL乙二醇中，攪拌得到黃色透明溶液；

（5）將步驟（3）所得產(chǎn)物分散在步驟（4）所得溶液中，超聲1.0-2.0小時，步驟（3）所得產(chǎn)物與步驟（4）所得溶液比例為：（150-200 mg）:（40-60 mL）；

（6）超聲攪拌情況下，將檸檬酸三鈉、醋酸鈉、聚乙二醇（20000）加入到步驟（5）所得混合溶液中，充分攪拌1.0-1.5小時，其中檸檬酸三鈉、醋酸鈉、聚乙二醇（20000）配比為（150-180 mg）：（1.5-2.0 g）:（1.0-1.5 g）；

（7）將步驟（6）所得混合溶液轉(zhuǎn)移至水熱反應釜中，在180-220 ℃下加熱8-10小時；

（8）將步驟（7）中高壓反應釜冷卻至室溫，磁性分離產(chǎn)物，并用去離子水和無水乙醇洗滌以除去多余的原料，40-60 ℃下真空干燥，得到磁性石墨烯材料，記為magG；

（9）將步驟（8）所得產(chǎn)物修飾上無孔的二氧化硅，記為magG@SiO₂；

（10）將步驟（9）所得產(chǎn)物修飾上氨基和C18長鏈，記為magG@SiO₂@-NH₂/C18；

（11）將步驟（10）所得產(chǎn)物修飾上高分子的聚酰胺-胺（PAMAM），記為magG@SiO₂@PAMAM /C18。

本發(fā)明步驟（9）中，二氧化硅修飾磁性石墨烯的步驟具體如下：

（9.1）將200-250 mg的magG材料分散在100-150 mL異丙醇中，超聲10-15分鐘，之后加入超純水，氨水和正硅酸乙酯（TEOS），其中超純水，氨水和正硅酸乙酯（TEOS）的配比為10-15 mL: 1-2 mL: 1-1.5mL；

（9.2）將步驟（9.1）所得溶液超聲混合10-15分鐘，在30-35度條件下機械攪拌10-11h充分反應；

（9.3）通過磁性分離，將步驟（9.2）所得分析物經(jīng)過水洗、乙醇洗到上清液澄清為止，以除去表面雜質(zhì)；

（9.4）將步驟（9.3）所得產(chǎn)物在40-60 ℃下真空干燥，得到magG@SiO₂材料。

本發(fā)明步驟（10）中，氨基和C18修飾磁性石墨烯的步驟具體如下：

（10.1）將200-250 magG@SiO₂材料分散在50-100 mL異丙醇中，超聲10-15分鐘，之后加入氨基硅烷化試劑（APTES）和碳十八硅烷化試劑（C18），二者的比例為1-2 mL: 1-2 mL；

（10.2）將步驟（10.1）所得溶液超聲混合10-15分鐘，在60-65度條件下機械攪拌10-11h充分反應；

（10.3）通過磁性分離，將步驟（10.2）所得分析物經(jīng)過水洗、乙醇洗；

（10.4）將步驟（10.3）所得產(chǎn)物在40-60 ℃下真空干燥，得到magG@SiO₂@-NH₂/C18材料。

本發(fā)明步驟（11）中，PAMAM修飾的步驟具體如下：

（11.1）將100-150 magG@SiO₂@-NH₂/C18材料分散在20-30 mL 5%戊二醛溶液中，活化2-2.5 h；

（11.2）將步驟（11.1）所得溶液用無水甲醇洗3-4遍，加入20-25 mL 甲醇（其中包含50-55μL PAMAM 溶液），常溫反應3-4 h；

（11.3）通過磁性分離，將步驟（11.2）所得上清液去除，加入20-30 mL氰基硼氫化鈉的甲醇溶液（10-15 mg/mL）；反應2-2.5 h；

（11.4）通過磁性分離，將步驟（11.3）所得分析物經(jīng)過甲醇洗、水洗、乙醇洗；

（11.4）將步驟（10.3）所得產(chǎn)物在40-60 ℃下真空干燥，得到magG@SiO₂@PAMAM/C18材料。

本發(fā)明把上述制備的樹枝狀分子和C18長鏈修飾的磁性石墨烯材料用于蛋白富集，具體操作步驟如下：

取 100-200 μg magG@SiO2@PAMAM/C18，用超純水洗3-4遍。加入超純水和適量的蛋白混合物，使總體積為95-110 μL；在20-30℃下富集20 min-30 min；磁性分離去除上清液，而后超純水清洗2-3次，最后用洗脫液（80%-85%乙腈和0.1-0.2%TFA 溶液），在30-37℃下洗脫20-25 min，將富集到的蛋白洗脫下來，洗脫液進行HPLC和MALDI-TOF MS分析檢測。

本發(fā)明提出的基于樹枝狀分子和C18長鏈修飾的磁性石墨烯材料對蛋白富集方法，在標準蛋白的富集中得到了很好的效果。

如圖2所示，通過本發(fā)明方法，在對標準的四種蛋白（牛血清白蛋白：BSA，肌紅蛋白：MYO，轉(zhuǎn)鐵蛋白：transferrin和溶菌酶：LYS）富集中，經(jīng)過HPLC分析有較高的回收率，圖3中它對于BSA和MYO蛋白的富集檢測限達到1ng/μL，這些結(jié)果都說明我們的材料在對蛋白的富集中有非常高的效率，由此也可以證明這種材料在以后的蛋白質(zhì)組學研究中有很好的應用前景。

附圖說明

圖1 magG@SiO2@PAMAM/C18材料的合成和富集流程圖。

圖2 magG@SiO₂@PAMAM/C18的電鏡表征圖。其中，(a)magG，(b)magG@SiO₂，(c)magG@SiO₂@PAMAM/C18。

圖3 magG@SiO2@PAMAM/C18富集四種標準蛋白的HPLC色譜圖。

圖4 magG@SiO2@PAMAM/C18富集BSA和MYO檢測限的MALDI-TOF 質(zhì)譜圖。其中，(a)BSA富集前, (b)BSA富集后，(c)MYO富集前, (d)MYO富集后。

具體實施方式

實施例1：magG@SiO₂@PAMAM/C18材料合成

（1）磁性石墨烯（magG）的合成：將400-600 mg石墨烯分散到50-70 mL濃硝酸中，50-70 ℃水浴回流6-10小時；所得產(chǎn)物進行離心、分離，用去離子水清洗至溶液為中性后在40-60 ℃下真空干燥，放置保存，得到酸化石墨烯；然后將400-500 mg FeCl₃?6H2O 溶于40-60 mL乙二醇中，攪拌得到黃色透明溶液；將上一步中的酸化石墨烯溶解在所得黃色溶液中，超聲1.0-2.0比例為：150-200 mg：40-60 mL；接著在超聲攪拌情況下，將檸檬酸三鈉、醋酸鈉、聚乙二醇（20000）加入，充分攪拌1.0-1.5小時，其中，檸檬酸三鈉、醋酸鈉、聚乙二醇（20000）配比為：（150-180 mg）：（1.5-2.0 g）：（1.0-1.5 g）；將混合溶液轉(zhuǎn)移至水熱反應釜中，在180-220 ℃下加熱8-10小時；反應結(jié)束后將反應釜冷卻至室溫，磁性分離產(chǎn)物，并用去離子水和無水乙醇洗滌以除去多余的原料，40-60 ℃下真空干燥，得到磁性石墨烯材料(記為magG)；

（2）magG@SiO₂的合成，將（1）中200-250 mg的magG材料分散在100-150 mL異丙醇中，超聲10-15分鐘，之后加入超純水，氨水和正硅酸乙酯（TEOS），其中超純水，氨水和正硅酸乙酯（TEOS）的配比為10-15 mL: 1-2 mL: 1-1.5mL；所得溶液超聲混合10-15分鐘，在30-35度條件下機械攪拌10-11h充分反應。通過磁性分離后，所得分析物經(jīng)過水洗、乙醇洗到上清液澄清為止，以除去表面雜質(zhì)；最后產(chǎn)物在40-60 ℃下真空干燥，得到magG@SiO₂材料；

（3）magG@SiO₂@-NH₂/C18的合成：將（2）中200-250 magG@SiO₂材料分散在50-100 mL異丙醇中，超聲10-15分鐘，之后加入氨基硅烷化試劑（APTES）和碳十八硅烷化試劑（C18），二者的比例為1-2 mL: 1-2 mL；所得溶液超聲混合10-15分鐘，在60-65度條件下機械攪拌10-11h充分反應；通過磁性分離，將所得分析物經(jīng)過水洗、乙醇洗；最后所得產(chǎn)物在40-60 ℃下真空干燥，得到magG@SiO₂@-NH₂/C18材料；

（4）magG@SiO₂@PAMAM/C18的合成：將（3）中100-150 magG@SiO₂@-NH₂/C18材料分散在20-30 mL 5%戊二醛溶液中，活化2-2.5 h; 所得溶液用無水甲醇洗3-4遍，加入20-25 mL 甲醇（其中包含50-55μL PAMAM 溶液），常溫反應3-4 h；通過磁性分離，將所得上清液去除，加入20-30 mL氰基硼氫化鈉的甲醇溶液（10-15 mg/mL），反應2-2.5 h；通過磁性分離后，所得分析物經(jīng)過甲醇洗、水洗、乙醇洗；最后所得產(chǎn)物在40-60 ℃下真空干燥，得到magG@SiO₂@PAMAM/C18材料。

實施例2：100-200 μg magG@SiO2@PAMAM/C18材料用于蛋白的富集

取 100-200 μg magG@SiO2@PAMAM/C18，用超純水洗3-4遍。加入超純水和適量的蛋白混合物，使總體積為95-110 μL；在20-30℃下富集20 min-30 min；磁性分離去除上清液，而后超純水清洗2-3次，最后用洗脫液（80%-85%乙腈和0.1-0.2%TFA 溶液），在30-37℃下洗脫20-25 min，將富集到的蛋白洗脫下來，洗脫液進行HPLC和MALDI-TOF MS分析檢測。