本發(fā)明涉及一種基于單域重鏈抗體(又稱納米抗體技術(shù))的免疫親和吸附材料，特別是針對c-myc標(biāo)簽的免疫親和吸附材料。

技術(shù)背景

c-myc標(biāo)簽蛋白的發(fā)現(xiàn)源于1985年evan制備獲得了一株針對人原癌基因產(chǎn)物myc蛋白的單克隆抗體9e10，此后研究發(fā)現(xiàn)該抗體識別的表位由10個氨基酸殘基組成，其序列為glu-gln-lys-leu-ile-ser-glu-glu-asp-leu，并且這10個氨基酸與其它蛋白融合表達(dá)后依然能夠保持很強的抗原活性，可以被相應(yīng)抗體識別，而且不受到蛋白框架的影響。因此，c-myc標(biāo)簽系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)檢測、細(xì)胞成像、親和純化以及蛋白質(zhì)工程等領(lǐng)域。

免疫親和層析、免疫親和磁珠及免疫共沉淀等技術(shù)常用于分離純化含有c-myc標(biāo)簽融合蛋白。這類親和純化技術(shù)基于配基與c-myc標(biāo)簽特異性結(jié)合的原理，一般地，將特異性結(jié)合c-myc標(biāo)簽的配基與載體偶聯(lián)或吸附，然后用于從溶液中特異性吸附c-myc標(biāo)簽融合蛋白。

市場上針對c-myc標(biāo)簽融合蛋白純化用的親和柱和親和磁珠，偶聯(lián)的配基大都是單克隆抗體或多克隆抗體。單克隆抗體的研發(fā)和生產(chǎn)過程較為繁瑣和復(fù)雜，多克隆抗體來源有限。現(xiàn)有的針對c-myc標(biāo)簽融合蛋白純化的親和柱和親和磁珠價格普遍偏高。而納米抗體可以在大腸桿菌、酵母等生物中大量表達(dá)，有利于降低相關(guān)制品的生產(chǎn)成本。

蛋白純化過程中需要用到酸或堿性溶液對目的蛋白進(jìn)行洗脫。由于單克隆抗體或多克隆抗體由重鏈和輕鏈組成，酸堿洗脫會不可避免的導(dǎo)致抗體活性降低，因而不能重復(fù)使用。相比之下，單域重鏈抗體僅由一個結(jié)構(gòu)域組成，具有耐酸堿、耐高溫。本發(fā)明中提供的親和吸附材料可重復(fù)多次使用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種針對c-myc標(biāo)簽的免疫親和吸附材料及其應(yīng)用。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

針對c-myc標(biāo)簽的免疫親和吸附材料包括載體和配基，所述配基為單域重鏈抗體，具有seqidno.:1所示的氨基酸序列。該配基可特異性識別c-myc標(biāo)簽。

所述配基還可以為在前述單域重鏈抗體基礎(chǔ)上通過隨機或定點突變技術(shù)進(jìn)行改造所獲得的能與c-myc標(biāo)簽特異性結(jié)合的抗體。

所述載體為磁珠、瓊脂糖凝膠微球、硅膠微球或多孔材料。

上述c-myc標(biāo)簽免疫親和吸附材料的制備方法，其特征為：

所述載體為磁珠時，制備方法為：取1mg羧基磁珠于離心管中，加入600～1000μl活化緩沖液(10mm，nah2po4，ph6.0)，渦旋混合均勻，磁力架回收磁珠，再用活化緩沖液洗滌2遍。分別加入1～5mg碳二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，渦旋混合后，靜置35min。用偶聯(lián)緩沖液(10mm，na2hpo4，ph7.4)洗滌磁珠5遍，加入抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體，室溫反應(yīng)3～5h，得到共價偶聯(lián)了抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體的免疫磁珠；

所述載體為瓊脂糖凝膠微球時，制備方法為：將cnbr活化的干膠用0.1mhcl洗滌10～20次，每次平衡6～10min。用偶聯(lián)緩沖液(10mm，na2hpo4，ph7.2)洗滌5～20次，加入抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體，室溫反應(yīng)3～10h，得到共價偶聯(lián)了抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料；

所述載體為硅膠微球時，制備方法為：將硅膠微球用純水和磷酸緩沖液(pbs，10mm，ph6.5)交替洗滌5～15次，用pbs緩沖液懸浮硅膠微球，加入抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體，混勻，加入終濃度1～10mg/ml的碳二亞胺(edc)，迅速混勻，4℃攪拌反應(yīng)12～20h，得到共價偶聯(lián)了抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料。

將上述免疫親和吸附材料(載體為瓊脂糖凝膠微球和硅膠微球)裝填至層析柱，即得到c-myc標(biāo)簽免疫親和層析柱，方法為：根據(jù)層析柱容量，取適量上述免疫親和吸附材料于層析柱，加入8～10倍柱床體積的pbs(10mm，ph7.2)洗滌后，4℃，保存于20％乙醇溶液。

本發(fā)明還涉及裝載有權(quán)利要求1所述c-myc標(biāo)簽免疫親和吸附材料的親和層析柱。

上述c-myc標(biāo)簽免疫親和吸附材料的應(yīng)用，用所述c-myc標(biāo)簽免疫親和吸附材料對樣品中含c-myc標(biāo)簽的蛋白進(jìn)行純化。當(dāng)免疫吸附材料的載體為瓊脂糖凝膠微球和硅膠微球時，方法為：首先用pbs(10mm，ph7.2)洗滌免疫吸附材料，加入樣品提取液，然后用純水淋洗，再用甘氨酸鹽酸(ph2.2)洗脫特異性吸附的含c-myc標(biāo)簽重組蛋白，收集的洗脫液，純化后的樣品提取液，可用于后續(xù)分析檢測。當(dāng)載體為磁珠時，方法為：將免疫磁珠加入純水中，磁力架回收磁珠，重復(fù)清洗3～5次，然后將免疫磁珠加入樣品提取液中，混勻，磁力架回收磁珠，純水清洗3～5次后，用甘氨酸鹽酸(ph2.2)洗脫特異性吸附的c-myc標(biāo)簽重組蛋白，收集的洗脫液，即為純化后的樣品提取液，可用于后續(xù)分析檢測。

本發(fā)明針對c-myc標(biāo)簽的免疫親和吸附材料配基為單域重鏈抗體，具有seqidno.:1所示的氨基酸序列，該配基可特異性識別c-myc標(biāo)簽。該單域重鏈抗體容易獲得，耐熱，可以通過生物學(xué)方法大量培養(yǎng)生產(chǎn)配基為單域重鏈抗體，避免了人工抗體等繁瑣生產(chǎn)方法，大大降低了生產(chǎn)成本，并且可重復(fù)使用，應(yīng)用前景廣闊。

具體實施方式

下面通過c-myc標(biāo)簽免疫親和吸附材料的制備及應(yīng)用，對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，這些具體實施例不應(yīng)以任何方式被解釋為限制本發(fā)明的應(yīng)用范圍。

實施例1：

抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體(即針對c-myc標(biāo)簽的單域重鏈抗體)免疫文庫的構(gòu)建

將c-myc標(biāo)簽與牛血清白蛋白(bovineserumalbumin，bsa)共價偶聯(lián)，得到c-myc人工抗原c-myc-bsa，取300μgc-myc-bsa與弗氏完全佐劑乳化后，對羊駝(lamapacos)進(jìn)行皮下多點注射免疫。加強免疫采用150μgc-myc-bsa與弗氏不完全佐劑乳化，間隔2周進(jìn)行，每次免疫7天后靜脈取血，采用間接elisa法測定血清效價，選擇血清效價最高的樣品分離淋巴細(xì)胞，提取rna。

rna的提取參照takara公司rnaiso試劑說明書進(jìn)行。以rna為模板，oligodt為引物，參照takara公司反轉(zhuǎn)錄酶說明書合成cdna第一鏈。

采用primestar高保真dna聚合酶，經(jīng)巢式pcr獲得重鏈抗體的可變區(qū)編碼基因(采用的引物見表1)。第一輪pcr分別以引物alpvh-ld和ch2-r擴(kuò)增cdna，反應(yīng)條件為，98℃，10s，55℃，20s，72℃，1min，20個循環(huán)，98℃，10s，68℃，1min，72℃延伸10min。

將第一輪pcr產(chǎn)物用1.2％的瓊脂糖凝膠電泳，回收600bp～750bp的dna片段，作為第二輪pcr的模板，分別用引物alpvh-sfii和alpvhhr1-noti，alpvh-sfii和alpvhhr2-noti，進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為，98℃，10s，50℃，20s，72℃，40s，5個循環(huán)，98℃，10s，68℃，40s，30個循環(huán)，72℃延伸10min。經(jīng)dna片段回收試劑盒回收、定量，于-20℃保存?zhèn)溆谩⑹删hen1和pcr擴(kuò)增產(chǎn)物分別用sfii、noti雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收、定量后，以1∶3摩爾比，在16℃，過夜連接。

表1文庫構(gòu)建及鑒定所用的引物

注：下劃線表示限制性內(nèi)切酶識別序列

連接產(chǎn)物經(jīng)乙醇沉淀后，溶于10μl無菌水，分十次進(jìn)行電穿孔轉(zhuǎn)化大腸桿菌tg1。取10μl電擊、培養(yǎng)后的菌液倍比稀釋，涂布氨芐青霉素2×yt培養(yǎng)板，計算庫容。其余部分全部涂布于24cm×24cm氨芐青霉素2×yt培養(yǎng)板，37℃，倒置培養(yǎng)13～16h。用10ml，2×yt培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上的菌苔刮洗后，加入終濃度20～30％甘油，分裝，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)計算的庫容量結(jié)果，接種10倍庫容量的活細(xì)胞于20ml的2×yt(含2％葡萄糖，100μg/ml氨芐青霉素)，37℃，200r/min培養(yǎng)至od600達(dá)0.5，按感染復(fù)數(shù)20∶1加入輔助噬菌體，37℃，200r/min，60min。將培養(yǎng)物離心，用50ml的2×yt(含100μg/ml氨芐青霉素和50μg/ml卡那霉素)重懸沉淀，37℃，200r/min過夜培養(yǎng)后，8000rpm離心取上清，加入5×peg/nacl溶液，冰上放置1.5h或4℃過夜，8000rpm離心30min，重懸沉淀于含10％甘油的磷酸緩沖液(pbs，0.01m，ph7.4)，即得到抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體免疫文庫，取10μl測定滴度，其余分裝于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例2：

抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體的淘選與鑒定

采用固相親和淘選的方法從實施例1所得抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體免疫文庫中淘選針對c-myc標(biāo)簽的單域重鏈抗體。向每個酶標(biāo)孔中加入120μl用pbs稀釋的myc-gst融合蛋白(myc標(biāo)簽與谷胱甘肽融合的蛋白)，4℃，包被過夜，每輪淘選的包被濃度分別為100，75，50μg/ml；吸出包被液，pbs洗板5次，每孔加入300μl3％bsa-pbs，37℃，封閉2h；pbs洗板5次，加入100μl噬菌體抗體文庫(約含1×10¹¹cfu)，37℃，孵育2.0h；吸出未結(jié)合的噬菌體，用pbst(含0.5％tween-20)洗板3-5次(逐輪增加5次)，再用pbs洗板15-25次；以100μl洗脫液(甘氨酸-鹽酸，ph2.2)洗脫吸附在酶標(biāo)孔中的噬菌體，用35μltris-hcl(1mol/l，ph8.0)中和洗脫物，取10μl用于滴度測定，其余125μl洗脫物擴(kuò)增后用于下一輪淘選。

經(jīng)四輪淘選后，采用輔助噬菌體km13對隨機挑取的單克隆進(jìn)行救援，分別得到展示抗體可變區(qū)的噬菌體顆粒，再用間接phage-elisa測定噬菌體顆粒的結(jié)合活性和特異性，實驗設(shè)定對照，具體加樣步驟見表2。

表2間接phage-elisa加樣表

將elisa陽性克隆送生物技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行序列測定，得到插入片段的dna序列，其編碼針對c-myc標(biāo)簽的單域重鏈抗體。

dna序列(seqidno.:2)：

cagttgcagctcgtggagtcagggggaggcttggtgcagcctggggggtctctgacgctctcctgtctagcctctggattcactcttagtaactactacatgagctgggtccgccaggctccaggaaaggggcccgagtgggtcgcggaggttaatgatagtggctttggcagaaactatggagactccgtgaagggccgattcaccatctctagagacaacgccaagagcacggtatacttggaaatgaatgacctgaaacctgaggacacggccctatattactgtgcgcgcgatcggtatcttgacctcagagagtatgattactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca

編碼具有seqidno.:1所示的氨基酸序列：

qlqlvesggglvqpggsltlsclasgftlsnyymswvrqapgkgpewvaevndsgfgrnygdsvkgrftisrdnakstvylemndlkpedtalyycardryldlreydywgqgtqvtvss。

實施例3：

抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體的規(guī)模制備

編碼抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體的dna片段的獲取：1.采用限制性內(nèi)切酶sfii/noti，雙酶切噬菌粒phen-anti-c-myc單域重鏈抗體基因，瓊脂糖凝膠電泳回收抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體基因；2.直接將抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體編碼序列送生物技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行化學(xué)合成；3.設(shè)計特異性引物，通過pcr技術(shù)從羊駝(lamapacos)來源的cdna庫中擴(kuò)增。

將得到的抗c-myc標(biāo)簽標(biāo)簽單域重鏈抗體基因片段克隆至表達(dá)載體pet25-flag(已將載體本身所帶c-myc標(biāo)簽替換為flag標(biāo)簽：dykddddk)，經(jīng)pcr和酶切鑒定，構(gòu)建完成抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒。

將表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌rosetta，挑取單菌落進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。將單菌落接入5mllb-a(luria-bertanibrothwith100μg/mlampicillin)液體培養(yǎng)基中，37℃、220r/min振蕩培養(yǎng)12h；以1％培養(yǎng)基體積的接種量將其轉(zhuǎn)接到50mllb-a液體培養(yǎng)基中，37℃、220r/min振蕩培養(yǎng)至od600達(dá)到0.5(約需3～3.5h)，加入終濃度0.1mm的iptg，30℃、200r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)。

誘導(dǎo)培養(yǎng)物8000r/min離心，在細(xì)胞沉淀中加入25ml磷酸緩沖液(ph7.4)混勻，8000r/min離心，去上清，保留細(xì)胞沉淀；在細(xì)胞沉淀中加入15ml相同緩沖液，混勻，冰上超聲波細(xì)胞破碎處理，超聲破碎條件為200w，破碎2s，間歇5s，共250個循環(huán)，在4℃下對細(xì)胞破碎物8000r/min離心15min，取上清進(jìn)行親和層析純化和sds-page電泳分析，或在上清中加入終濃度20％的甘油，混勻，保存于-20℃冰柜待用。

通過優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件(如宿主菌、表達(dá)載體、誘導(dǎo)培養(yǎng)時間、溫度以及iptg濃度等)，可以進(jìn)一步提高目的蛋白(單域重鏈抗體)表達(dá)量，為大量制備抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體提供了途徑。

抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體的融合表達(dá)：

將本發(fā)明抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體基因克隆至融合表達(dá)載體pap(含有堿性磷酸酶基因)，經(jīng)pcr和酶切鑒定，構(gòu)建完成抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體的堿性磷酸酶融合表達(dá)質(zhì)粒。

堿性磷酸酶可以非特異性催化磷酸單酯水解生成無機磷酸和相應(yīng)的醇、酚或糖類化合物。該酶常作為信號元件用于elisa、免疫印跡、組織化學(xué)等檢測方法。融合表達(dá)質(zhì)粒將抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體融合于堿性磷酸酶的n端，參考應(yīng)用實例3中的表達(dá)方法，可以在大腸桿菌中表達(dá)、純化出融合蛋白ap-anti-c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體。

抗c-myc標(biāo)簽的納米抗體的耐熱實驗

通過elisa實驗對納米抗體熱穩(wěn)定性進(jìn)行測定，實驗方法如下：

取濃度為5μg/mlmyc-gst蛋白，以每孔100μl加入96孔酶標(biāo)板中，4℃包被過夜；0.05％pbst洗板3次；3％的脫脂牛奶37℃封閉lh；加入稀釋后的c-myc納米抗體，每孔100μl，37℃，孵育1h；加入1：2000工作濃度hrp標(biāo)記的抗his標(biāo)簽二抗，每孔加入100μl，37℃，孵育1h；加入tmb顯色液，每孔加入100μl；在多組不同在溫度下孵育30min；反應(yīng)結(jié)束后，加入2m硫酸終止反應(yīng)，每孔加入50μl，混勻終止反應(yīng)后測定450nm吸光值。

結(jié)果顯示即使溫度高達(dá)70℃、80℃、90℃，蛋白活性依然具有生物活性，od450值分別為1.4、1.3、1.2，具有較好的耐熱性。

實施例4：

c-myc標(biāo)簽免疫親和磁珠的小量制備

采用納米磁珠作為載體，偶聯(lián)抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體后，得到c-myc標(biāo)簽免疫磁珠，具體制備方法如下：

取1mg羧基修飾的磁珠于離心管中，加入500μl活化緩沖液(10mm，nah2po4，ph6.0)，渦旋混合均勻，磁力架回收磁珠，再用活化緩沖液洗滌3遍。分別加入2mg碳二亞胺(edc)和n-羥基琥珀酰亞胺(nhs)，渦旋混合后，靜置25min。用偶聯(lián)緩沖液(10mm，na2hpo4，ph7.4)洗滌磁珠3遍，加入溶于偶聯(lián)緩沖液的抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體1mg，室溫反應(yīng)3.5h，用偶聯(lián)緩沖液洗滌磁珠5次，加入500μl含1％(w/v)牛血清白蛋白(bsa)或1％(w/v)卵清蛋白(ova)的偶聯(lián)緩沖液封閉未反應(yīng)的活性基團(tuán)，室溫反應(yīng)35min。用偶聯(lián)緩沖液洗滌磁珠5次，pbs溶液(10mm，ph7.2，0.02％w/v，na3n)重懸后保存于4℃。

實施例5：

c-myc標(biāo)簽免疫親和吸附材料及親和柱的制備

采用瓊脂糖微球作為載體，偶聯(lián)抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體，具體制備方法如下：

將cnbr活化的干膠用0.1mhcl洗滌10次，每次平衡5min。用偶聯(lián)緩沖液(10mm，na2hpo4，ph7.2)洗滌10次，加入抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體(2mg/每克瓊脂糖微球)，室溫反應(yīng)3.5h，使抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體與cnbr活化的瓊脂糖凝膠微球共價偶聯(lián)。用偶聯(lián)緩沖液(10mm，na2hpo4，ph7.2)洗滌3次后，加入封閉液室溫反應(yīng)2.5h以封閉未反應(yīng)的活性基團(tuán)。用6倍膠體積的磷酸緩沖液(10mm，ph7.2)和醋酸緩沖液(0.1m，ph4.5)交替洗滌3次，得到共價偶聯(lián)了抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料。取0.2ml上述免疫親和吸附材料于容量為1ml的層析柱，8～10倍柱床體積的pbs(10mm，ph7.2)洗滌后，加入20％乙醇溶液，4℃保存。

實施例6：

c-myc標(biāo)簽免疫親和吸附材料及親和柱的制備

采用硅膠微球作為載體，偶聯(lián)抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體，具體制備方法如下：

取2g硅膠微球用純水和磷酸緩沖液(pbs，10mm，ph6.5)交替洗滌6～10次，用10mlpbs緩沖液懸浮硅膠微球，加入5mg抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體，混勻，加入終濃度5mg/ml的碳二亞胺(edc)，迅速混勻，4℃攪拌反應(yīng)12～20h，得到共價偶聯(lián)了抗c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體的免疫親和吸附材料。取0.2ml上述免疫親和吸附材料于容量為1ml的層析柱，58～10倍柱床體積的pbs(10mm，ph6.5)洗滌后，加入含0.02％(w/v)na3n的pbs(10mm，ph6.5)，4℃保存。

實施例7：

c-myc標(biāo)簽親和層析柱的吸附量、重復(fù)使用測定

用6倍柱床體積pbs(10mm，ph7.2)清洗柱子，加入蛋白樣品溶液，流出液重新過柱。然后用3倍柱床體積純水淋洗，再用甘氨酸鹽酸(ph2.2)洗脫特異性吸附的含c-myc標(biāo)簽重組蛋白，收集的洗脫液，即為純化后的蛋白溶液。實驗結(jié)果表明，裝填有1ml實施例5、6、7制備的親和柱/磁珠可以特異性吸附目的蛋白。重復(fù)使用10次之后，回收率仍然大于80％?？梢酝ㄟ^生物學(xué)方法大量培養(yǎng)生產(chǎn)配基為單域重鏈抗體，避免了人工抗體等繁瑣生產(chǎn)方法，大大降低了生產(chǎn)成本，并且可重復(fù)使用，應(yīng)用前景廣闊。

sequencelisting

<110>南昌大學(xué)

<120>基于特異識別c-myc標(biāo)簽單域重鏈抗體的親和吸附材料

<130>2017

<160>9

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>360

<212>prt

<213>人工序列

<400>1

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151015

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202530

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<213>lamapacos

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<220>

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<222>(47)..(47)

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