本發(fā)明屬于整體柱功能材料制備領(lǐng)域，具體涉及一種特異識別赭曲霉毒素的有機聚合整體柱及其制備方法。

背景技術(shù)：

毛細管整體柱，是一類新興的色譜微分離柱。目前，毛細管整體柱主要基于反相作用或親水作用原理進行分離。在特異分析方面，親和色譜柱利用固定于色譜固定相上的具有特異性識別功能的配體，使其與待分析物產(chǎn)生專一的相互作用，實現(xiàn)與樣品中其他物質(zhì)的分離。

分子印跡聚合物（MIP）由于其類似于“鑰匙-鎖”相互作用的識別原理，成為選擇性整體柱材料研究的主要研究對象。由于分子印跡技術(shù)自身的特點，存在合成時材料消耗大、極性溶劑干擾、剛性識別“空穴”易被破壞或變形等不足，以及MIP 合成過程中不可避免地產(chǎn)生非特異性結(jié)合位點，導(dǎo)致其選擇性與抗體抗原、酶底物等專一特異性生物識別體系相比存在較大差距。

核酸適配體具有穩(wěn)定的二級結(jié)構(gòu)和高特異性、高親和力、便于化學修飾與功能化的特點，已成為一種廣受關(guān)注的新型識別分子。核酸適配體的應(yīng)用主要包括在化學研究檢測系統(tǒng)中作為分子識別元件，在生物樣品分離富集過程中作為能夠與靶目標發(fā)生特異性結(jié)合的配基以及在醫(yī)學上用于臨床診斷和治療。Chris Le等將適配體固定在毛細管中，用于蛋白質(zhì)混合物中細胞色素C 的分離與檢測，基于細胞色素C 的核酸適配體通過非共價鍵結(jié)合在有機聚合物整體柱基質(zhì)上實現(xiàn)了對細胞色素C 和凝血酶的分離與檢測。目前，基于不飽和烯基自由基聚合引入氨基鏈霉素，再與鏈接核酸適配體的生物素特征結(jié)合，核酸適配體修飾在一維碳鏈聚合結(jié)構(gòu)上，形成的聚合物結(jié)構(gòu)為一維結(jié)構(gòu)低交聯(lián)度形成的二維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。構(gòu)建高度交聯(lián)立體結(jié)構(gòu)的核酸適配體功能化聚合整體柱有待取得突破。

納米復(fù)合材料是以聚合基體為連續(xù)相，將納米尺寸的粒子或含有孔徑的功能材料等分散相均勻分散于基體材料中，形成含有納米尺寸材料的均一相復(fù)合體系。環(huán)四硅氧烷丙烯酸酯具有由-Si-O-交替連接的硅氧骨架組成的平面八元環(huán)型無機內(nèi)核，平面八元環(huán)型環(huán)上擁有三個支化短鏈，鏈端含有環(huán)氧基團，通過這些支化結(jié)構(gòu)上的環(huán)氧基團與功能試劑發(fā)生接枝或者聚合反應(yīng)，可以實現(xiàn)分子層上的高度分散和功能化。引入環(huán)四硅氧烷丙烯酸酯，在八元環(huán)型上鍵合修飾核酸適配體功能分子，發(fā)展具有納米孔穴的高度交聯(lián)聚合結(jié)構(gòu)的核酸適配體功能化整體材料，提供穩(wěn)定的環(huán)狀構(gòu)型和高密度修飾的核酸適配體，可實現(xiàn)對特征生物樣品的分離、富集和純化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種特異識別赭曲霉毒素的有機聚合整體柱及制備方法。所述整體柱是先以環(huán)氧基環(huán)硅氧烷丙烯酸酯單體和丙烯酸酯交聯(lián)劑聚合形成帶有環(huán)氧基的支化結(jié)構(gòu)的固定相，然后開環(huán)加成，柱后修飾對赭曲霉毒素特異識別的核酸適配體；所述的環(huán)氧基環(huán)硅氧烷丙烯酸酯單體為2-羥基-3-{3-[2,4,6,8-四甲基-4,6,8-三(丙基縮水甘油醚)-2-環(huán)四硅氧烷]丙氧基}丙基甲基丙烯酸酯；所述的核酸適配體為5'-NH₂-C₆-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA；所述的核酸適配體與環(huán)硅氧烷丙烯酸酯聚合物表面支化分布的環(huán)氧基開環(huán)進一步加成，實現(xiàn)縮合偶聯(lián)；所制備的整體柱基質(zhì)固定相具有環(huán)硅氧烷八元環(huán)型結(jié)構(gòu)、支化分布環(huán)氧基，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，與核酸適配體的5’-氨基作用位點多、位阻小，實現(xiàn)對赭曲霉毒素A核酸適配體的高效鍵合。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種特異識別赭曲霉毒素的有機聚合整體柱，所述的整體柱先以環(huán)氧基環(huán)硅氧烷丙烯酸酯單體和丙烯酸酯交聯(lián)劑在烯基化的毛細管中熱引發(fā)聚合，形成具有高度交聯(lián)、帶有環(huán)氧基的支化結(jié)構(gòu)的環(huán)氧基環(huán)硅氧烷聚合整體柱基質(zhì)固定相，在此基礎(chǔ)上，對環(huán)氧基團進行氨基開環(huán)加成，柱后衍生核酸適配體制得；所述的整體柱固定相表面鍵合對赭曲霉毒素A特異識別的核酸適配體。

其中，所述的對赭曲霉毒素A特異識別的核酸適配體在平面八元環(huán)型環(huán)硅氧烷支化分布的環(huán)氧基上開環(huán)加成，實現(xiàn)高度交聯(lián)縮合；所述的特異識別赭曲霉毒素的有機聚合整體柱同時含有平面八元環(huán)型硅氧烷無機內(nèi)核結(jié)構(gòu)、胺基羥基共存的R₁-NH-CHR₂-OH極性基團以及對赭曲霉毒素A特異識別的核酸適配體；其中R₁為核酸適配體，R₂為環(huán)硅氧烷丙烯酸酯。

按質(zhì)量百分數(shù)之和為100%計，所述的毛細管整體柱基質(zhì)固定相各組分所占質(zhì)量百分比為：環(huán)氧基環(huán)硅氧烷丙烯酸酯單體31.85%~37.83%，丙烯酸酯交聯(lián)劑6.97%~12.95%，致孔劑由正丙醇和1,4-丁二醇二元體系組成，其中正丙醇16.92%~20.90%，1,4-丁二醇33.85%~37.83%，引發(fā)劑0.45%。

所述的環(huán)氧基環(huán)硅氧烷丙烯酸酯單體為2-羥基-3-{3-[2,4,6,8-四甲基-4,6,8-三(丙基縮水甘油醚)-2-環(huán)四硅氧烷]丙氧基}丙基甲基丙烯酸酯；

所述的丙烯酸酯交聯(lián)劑為二甲基丙烯酸乙二醇酯；

所述的引發(fā)劑為偶氮二異丁氰；

所述的對赭曲霉毒素A特異識別的核酸適配體為5'-NH₂-C₆-GATCGGGTGTGGGTG GCGTAAAGGGAGCATCGGACA。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備上述特異識別赭曲霉毒素的有機聚合整體柱的方法，包括以下步驟：

（1）毛細管柱壁表面烯基化：

對毛細管空柱依次采用0.1mol/L的鹽酸溶液、1.0 mol/L的NaOH溶液沖洗3小時，去離子水沖洗15分鐘、甲醇沖洗15分鐘，在50℃下氮氣吹干；注入甲醇與甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷體積比為1∶1的混合物，在60℃下反應(yīng)12小時，用甲醇沖洗15分鐘；在70℃下氮氣吹干，制得柱壁表面烯基化的毛細管；

（2）環(huán)氧基環(huán)硅氧烷聚合整體柱基質(zhì)固定相的制備：

按比例稱取環(huán)氧基環(huán)硅氧烷丙烯酸酯單體、丙烯酸酯交聯(lián)劑、致孔劑及引發(fā)劑，混合均勻，超聲振蕩15分鐘，然后將混合物注入經(jīng)烯基化預(yù)處理過的毛細管中，控制注入的液柱的長度為28~32厘米，兩端封閉并浸于60℃水浴鍋中恒溫加熱20小時；待反應(yīng)完成后，以甲醇為流動相，在液相色譜泵上沖洗毛細管柱2小時，沖去床層內(nèi)殘留的溶劑、再將毛細管柱在泵壓12Mpa狀態(tài)下平衡10~15小時，得到環(huán)氧基環(huán)硅氧烷聚合整體柱基質(zhì)固定相；

（3）核酸適配體修飾的聚合整體柱制備

將5′端帶氨基的核酸適配體使用前3000r/min離心5分鐘，加入Tris-HCl緩沖液稀釋到100 μmol/L，渦旋震蕩溶解核酸適配體，放置于90℃恒溫水浴鍋加熱3分鐘，室溫條件下自然冷卻約30分鐘；采用液相泵將冷卻后的核酸適配體溶液通入步驟（2）制備的環(huán)氧基環(huán)硅氧烷聚合整體柱基質(zhì)固定相，60℃恒溫反應(yīng)1小時，使管壁表面上環(huán)氧基與適配體分子鏈5′端的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)；反應(yīng)后用水沖洗30min，除去殘留的核酸適配體之后，通入Tris-HCl緩沖液，即制得表面核酸適配體鍵合修飾的聚合整體柱。

其中，所述步驟（3）中的Tris-HCl緩沖液組成為：10 mmol/L Tris、5mmol/L KCl、120mmol/L NaCl以及20mmol/L CaCl₂，pH=8.00。

本發(fā)明的顯著優(yōu)點在于：

（1）本發(fā)明所述的一種特異識別赭曲霉毒素的有機聚合整體柱，對赭曲霉毒素A特異識別的核酸適配體與環(huán)氧基環(huán)四硅氧烷聚合物表面支化分布的環(huán)氧基開環(huán)進一步加成，基體中硅氧烷分散相均勻分散，具有由Si-O交替連接的納米尺寸的八元環(huán)型無機內(nèi)核構(gòu)型，環(huán)氧基支化分布，形成高度交聯(lián)三維結(jié)構(gòu)，5’-氨基核酸適配體在支化分布的環(huán)氧基開環(huán)加成縮合，與核酸適配體的5’-氨基作用位點多、位阻小，提高了聚合物骨架穩(wěn)定性和對赭曲霉毒素A核酸適配體的高效鍵合。

（2）本發(fā)明所述的一種特異識別赭曲霉毒素的有機聚合整體柱，以環(huán)氧基環(huán)四硅氧烷聚合形成環(huán)氧基支化分布的有機聚合物，每個八元環(huán)型環(huán)硅氧烷單體分子上具有三個支化碳鏈獨立分布的環(huán)氧基作用位點，與帶有5’-NH₂的核酸適配體作用，每個八元環(huán)型環(huán)硅氧烷單體分子均可立體地引入核酸適配體，形成高度交聯(lián)的氨基開環(huán)鍵合核酸適配體的有機聚合固定相，提高了氨基核酸適配體的修飾鍵合效率。

（3）本發(fā)明中所述的對赭曲霉毒素A特異識別的核酸適配體在平面八元環(huán)型環(huán)硅氧烷支化分布的環(huán)氧基上開環(huán)加成，實現(xiàn)高度交聯(lián)縮合；所述的特異識別赭曲霉毒素的有機聚合整體柱同時含有平面八元環(huán)型硅氧烷無機內(nèi)核結(jié)構(gòu)、胺基羥基共存的（R₁-NH-CHR₂-OH）極性基團（R₁：核酸適配體；R₂：環(huán)硅氧烷丙烯酸酯）和對赭曲霉毒素A特異識別的核酸適配體，可以比單一功能單體納米復(fù)合整體柱提供更多的作用模式，實現(xiàn)親水、氫鍵、適配體生物識別作用等模式，適用于極性赭曲霉毒素A的高效特異識別。

圖1（A）為未修飾核酸適配體的基質(zhì)固定相對赭曲霉毒素A的識別，（B）為環(huán)氧基水解固定相對赭曲霉毒素A的識別；

圖2是核酸適配體修飾整體柱特異識別赭曲霉毒素A，峰1為赭曲霉毒素A。

具體實施方式

為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。

實施例1

一種特異識別赭曲霉毒素的有機聚合整體柱，所述的整體柱先以環(huán)氧基環(huán)硅氧烷丙烯酸酯單體和丙烯酸酯交聯(lián)劑在烯基化的毛細管中熱引發(fā)聚合，形成具有高度交聯(lián)、帶有環(huán)氧基的支化結(jié)構(gòu)的環(huán)氧基環(huán)硅氧烷聚合整體柱基質(zhì)固定相，在此基礎(chǔ)上，對環(huán)氧基團進行氨基開環(huán)加成，柱后衍生核酸適配體制得；所述的整體柱固定相表面鍵合對赭曲霉毒素A特異識別的核酸適配體。

表1 環(huán)氧基環(huán)硅氧烷丙烯酸酯聚合整體柱固定相的不同組分含量表

^*：環(huán)氧基環(huán)硅氧烷丙烯酸酯單體為2-羥基-3-{3-[2,4,6,8-四甲基-4,6,8-三(丙基縮水甘油醚)-2-環(huán)四硅氧烷]丙氧基}丙基甲基丙烯酸酯。

按表1所示的組分含量表制備毛細管整體柱基質(zhì)固定相，其制備方法如下：

（1）毛細管柱壁表面烯基化：

對毛細管空柱依次采用0.1mol/L的鹽酸溶液、1.0 mol/L的NaOH溶液沖洗3小時，去離子水沖洗15分鐘、甲醇沖洗15分鐘，在50℃下氮氣吹干；注入甲醇與甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷體積比為1∶1的混合物，在60℃下反應(yīng)12小時，用甲醇沖洗15分鐘；在70℃下氮氣吹干，制得柱壁表面烯基化的毛細管。

（1）環(huán)氧基環(huán)硅氧烷聚合整體柱基質(zhì)固定相的制備：

按比例稱取環(huán)氧基環(huán)硅氧烷丙烯酸酯單體、丙烯酸酯交聯(lián)劑、致孔劑及引發(fā)劑，混合均勻，超聲振蕩15分鐘，然后將混合物注入經(jīng)烯基化預(yù)處理過的毛細管中，控制注入的液柱的長度為28~32厘米，兩端封閉并浸于60℃水浴鍋中恒溫加熱20小時；待反應(yīng)完成后，以甲醇為流動相，在液相色譜泵上沖洗毛細管柱2小時，沖去床層內(nèi)殘留的溶劑、再將毛細管柱在泵壓12Mpa狀態(tài)下平衡10~15小時，得到得到環(huán)氧基環(huán)硅氧烷聚合整體柱基質(zhì)固定相。

（2）核酸適配體修飾的聚合整體柱制備

將5′端帶氨基的核酸適配體使用前3000r/min轉(zhuǎn)速離心5分鐘，加入緩沖液稀釋到100 μmol/L，渦旋震蕩溶解核酸適配體，放置于90℃恒溫水浴鍋加熱3分鐘，室溫條件下自然冷卻約30分鐘；采用液相泵將上述的核酸適配體溶液通入步驟（2）制備的環(huán)氧基環(huán)硅氧烷聚合整體柱基質(zhì)固定相，60℃恒溫反應(yīng)1小時，完成管壁表面上環(huán)氧基與適配體分子鏈5′端的氨基發(fā)生縮合反應(yīng)。反應(yīng)后用水沖洗30min，除去殘留的核酸適配體之后，通入采用pH=8.00、含有10 mmol/L Tris、5mmol/L KCl、120mmol/L NaCl和20mmol/L CaCl₂的Tris-HCl緩沖液，即制得表面鍵合核酸適配體鍵合修飾的聚合整體柱。

實施例2

應(yīng)用未修飾核酸適配體的基質(zhì)固定相和環(huán)氧基水解固定相，按以下步驟實施：（1）平衡：對于配方B所制得的整體柱先用結(jié)合緩沖液平衡1小時，色譜條件為流速0.10 mL/min，壓力250psi，所述的結(jié)合緩沖液pH 8.00，含有10mmol/L Tris-HCl，120 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl和20mmol/L CaCl₂；（2）富集：將20微升的0.50μg/mL 赭曲霉毒素A（OTA）溶液注入，在整體柱上富集1小時，色譜條件為0.05 mL/min，壓力250psi；（3）清洗：將富集柱裝到液相色譜泵上，用結(jié)合緩沖液對未修飾核酸適配體的基質(zhì)固定相和環(huán)氧基水解固定相分別清洗14小時、10小時；洗脫條件為流速0.03 mL/min，壓力500psi，收集最后30分鐘的清洗液待查；（4）洗脫：采用甲醇洗脫，洗脫條件為流速0.10mL/min，壓力500psi，洗脫1小時，收集1小時的洗脫液待查。應(yīng)用配方B所制得的整體柱，采用HPLC-熒光檢測器上檢測收集液，赭曲霉毒素A未見有效保留（圖1）。

應(yīng)用核酸適配體鍵合配方B制備的整體柱，制得核酸適配體鍵合整體柱，按以下步驟實施：采用液相泵將上述的核酸適配體溶液通入配方B制備的整體柱，60℃恒溫反應(yīng)1小時，反應(yīng)后用水沖洗30min，除去殘留的核酸適配體之后，通入采用pH=8.00、含有10 mmol/L Tris、5mmol/L KCl、120mmol/L NaCl和20mmol/L CaCl₂的Tris-HCl緩沖液，即制得表面鍵合核酸適配體鍵合修飾的聚合整體柱。

應(yīng)用核酸適配體鍵合的配方B整體柱，按以上平衡、富集和清洗步驟實施，其中結(jié)合緩沖液對核酸適配體鍵合的配方B整體柱清洗4小時即可清洗干凈；采用100%甲醇洗脫可以將核酸適配體鍵合的配方B整體柱所保留的OTA有效洗脫下來，實現(xiàn)了核酸適配體鍵合的配方B整體柱對OTA的特異識別和有效保留與分離（圖2），圖2中洗脫峰為： 1. 赭曲霉毒素A（OTA）。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 福州大學

<120> 一種特異識別赭曲霉毒素的有機聚合整體柱及其制備方法

<130> 1

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 36

<212> DNA

<213> 對赭曲霉毒素A特異識別的核酸適配體

<400> 1

gatcgggtgt gggtggcgta aagggagcat cggaca 36