本發(fā)明屬于高效液相色譜固定相領(lǐng)域，具體涉及一種陰陽離子分別接枝的兩性離子鍵合硅膠作為親水作用色譜固定相、制備方法和分離應(yīng)用。

背景技術(shù)：

近年來，親水作用色譜(HILIC)在分離極性和親水性樣品方面得到越來越多的應(yīng)用，得到了廣泛的關(guān)注，目前已經(jīng)成為色譜領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，其能夠很好的保留反相色譜(RPLC)中不保留或保留弱的強(qiáng)極性和親水性物質(zhì)，同時(shí)解決了正相色譜(NPLC)中樣品的溶解性問題并提高了與質(zhì)譜的兼容性，顯示出非常好的應(yīng)用前景。對(duì)HILIC的應(yīng)用來說，固定相的開發(fā)對(duì)選擇性和分離效率具有很大的影響，在一定程度上決定著HILIC的應(yīng)用。然而，目前HILIC固定相方面仍然存在親水性不足、柱效低下、壽命較短以及種類有限對(duì)極性化合物的覆蓋不足等問題，因此，新型HILIC固定相的開發(fā)對(duì)于擴(kuò)展HILIC的覆蓋范圍，促進(jìn)其發(fā)展具有重要意義，現(xiàn)在已經(jīng)成為色譜領(lǐng)域的重要研究分支。HILIC固定相目前主要包括直接使用的NPLC固定相(如裸硅膠、氨基、氰基和二醇基修飾的材料)以及近年來開發(fā)的專門用于HILIC的固定相，主要是將一些極性和親水性分子鍵合到基質(zhì)支撐材料表面(通常是硅膠)，如常見的酰胺基團(tuán)、糖類等多羥基分子和兩性離子等。其中，兩性離子分子中同時(shí)存在著正負(fù)電荷中心，具有良好的親水性使其非常適合作為HILIC鍵合相，這類HILIC固定相目前顯示很好的色譜性能，得到廣泛的應(yīng)用?；趦尚噪x子的HILIC固定相主要有基于磺基甜菜堿和磷酸膽堿的兩性離子鍵合硅膠材料(ZIC-HILIC和ZIC-cHILIC)和一些新開發(fā)的兩性離子鍵合固定相，如通過“巰基-烯基”點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)制備的基于半胱氨酸的Click TE-Cys兩性離子HILIC固定相，以及基于3-P，P-二苯基膦-丙基磺酸、賴氨酸、谷胱甘肽和1-乙烯基-3-(4-磺酸根丁烷)咪唑的兩性離子HILIC固定相。這些兩性離子固定相中，電荷基團(tuán)和分布形式有一定差異，但是正負(fù)電荷中心均通過共價(jià)鍵連接于分子結(jié)構(gòu)中，整個(gè)分子通過一定的方式鍵合于固定相表面，盡管對(duì)親水性物質(zhì)顯示良好的HILIC保留和分離，但是正負(fù)電荷排布互相束縛，不能自由伸展以與分析物相互作用。

離子液體作為固定相鍵合分子，其設(shè)計(jì)性強(qiáng)，可以根據(jù)需求設(shè)計(jì)合成不同類型的滿足要求的鍵合相，另外，離子液體多重溶劑化相互作用有利于與溶質(zhì)分子的相互作用，從而提供良好的保留和分離選擇性。因此，離子液體鍵合固定相在近十年來得到極大的發(fā)展，主要用于反相和離子交換模式，而近幾年在HILIC領(lǐng)域也顯示出初步的潛力，新報(bào)道的新型表面鍵合離子液體固定相在HILIC模式下顯示很好的保留和分離，包括咪唑兩性離子、葡糖胺離子液體、雙陽和三陽離子液體表面鍵合HILIC固定相，而離子液體的可設(shè)計(jì)性也使得便于設(shè)計(jì)親水性能良好的結(jié)構(gòu)HILIC保留。目前離子液體鍵合硅膠固定相均是通過單一的陰離子或陽離子鍵合引入固定相表面，假如將陰陽離子均設(shè)計(jì)成具有活性官能團(tuán)可鍵合于固定相表面的結(jié)構(gòu)，那么得到的HILIC固定相是陰陽離子各自通過共價(jià)鍵分別鍵合于硅膠表面的固定相，既是表面鍵合離子液體固定相，也是新形式的兩性離子固定相，正負(fù)電荷分布相互不受束縛，便于各自更好的與分析物相互作用，帶來更好的保留和獨(dú)特的分離選擇性，并且陰陽離子比例調(diào)節(jié)來改善分離。本發(fā)明基于此，擬發(fā)展陰陽離子可分別共價(jià)接枝的離子液體，，將其鍵合至固體基質(zhì)表面作為新型兩性離子HILIC固定相，應(yīng)該會(huì)顯示良好的HILIC保留行為和獨(dú)特的色譜性能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種陰陽離子分別鍵合的兩性離子親水作用色譜固定相、制備方法及其應(yīng)用。該兩性離子親水作用色譜固定相表面的陰陽離子分別通過化學(xué)鍵各自接枝于填料表面，正負(fù)電荷分布自由，可以更好的與分析物作用。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：

陰陽離子分別鍵合的兩性離子親水作用色譜固定相，該兩性離子親水作用色譜固定相為3-巰基丙基修飾的二氧化硅球表面鍵合離子液體A的材料；通過“巰基-雙鍵”點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)，將離子液體A鍵合至3-巰基丙基修飾的二氧化硅球表面制備得到，鍵合分子為末端均為丙烯酸酯結(jié)構(gòu)的陰陽離子的離子液體A。

所述的3-巰基丙基修飾的二氧化硅球，通過(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷或(3-巰基丙基)三乙氧基硅烷與二氧化硅球在無水甲苯中惰性氣氛下加熱回流制得。二氧化硅球表面的3-巰基丙基基團(tuán)的鍵合摩爾量為2.0～4.0μmol/m²。

所述的離子液體A末端均為丙烯酸酯結(jié)構(gòu)的陰陽離子，是由反離子為無機(jī)負(fù)離子和無機(jī)正離子的兩種離子液體通過離子交換制備得到的；固定相中離子液體A的表面鍵合摩爾量為1.5～3.0μmol/m²；其結(jié)構(gòu)式如下：

其中，n和m為0～2的整數(shù)；陰離子部分X^-為SO₃^-、PO₄^-、PF₆^-、BF₄^-或COO^-中的一種；陽離子部分Y⁺為咪唑正電荷季銨根正離子、膦鹽正離子或其它一些正離子結(jié)構(gòu)。

上述兩性離子親水作用色譜固定相的制備方法，包括如下步驟：

1)制備3-巰基丙基修飾的二氧化硅球

將二氧化硅球與(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷或(3-巰基丙基)三乙氧基硅烷按質(zhì)量比為1：1～2：1加入無水甲苯中，惰性氣體保護(hù)下，在105-115℃條件加熱回流反應(yīng)18～25小時(shí)，得到表面鍵合有3-巰基丙基的二氧化硅球。其中，二氧化硅球質(zhì)量與無水甲苯的體積用量比為1g：10～15mL。

2)將步驟1)得到的表面鍵合有3-巰基丙基的二氧化硅球分散于溶解離子液體A的甲醇中，再加入引發(fā)劑AIBN，攪拌均勻后，惰性氣體保護(hù)下，在50～70℃條件加熱至回流反應(yīng)16～30小時(shí)得到目標(biāo)固定相。

所述的離子液體A中的丙烯酸酯雙鍵與3-巰基丙基官能團(tuán)的摩爾比為1.0～2.0：1；所述的引發(fā)劑的質(zhì)量為3-巰基丙基的二氧化硅球和離子液體A總質(zhì)量的0.5～2％。

離子液體A的制備方法為：制備末端為丙烯酸酯結(jié)構(gòu)的甲基咪唑離子液體，并通過離子交換得到末端均為丙烯酸酯結(jié)構(gòu)的陰陽離子結(jié)合的離子液體A。

3)采用勻漿法，將步驟2)得到的目標(biāo)固定相填料分散于甲醇中制成勻漿液，其中，目標(biāo)固定相質(zhì)量與甲醇體積用量的比例為1.0g：10～15mL；再以甲醇作為頂替液，在50～65MPa的壓力下，填充至不銹鋼管柱中得到陰陽離子分別鍵合的兩性離子親水作用色譜固定柱，色譜固定柱內(nèi)為陰陽離子分別鍵合的兩性離子親水作用色譜固定相。

上述兩性離子親水作用色譜固定相在親水作用色譜模式下用于分離不同類型的極性和親水性物質(zhì)，選擇性能夠通過改變陰陽離子的比例調(diào)節(jié)。所述的極性和親水性物質(zhì)為核苷和堿基、有機(jī)酸、堿性藥物以及氨基酸等兩性類物質(zhì)。

本發(fā)明的有益效果為，本發(fā)明提供的兩性離子HILIC固定相構(gòu)型和電荷排布新穎，正負(fù)電荷結(jié)構(gòu)自由且相互不受影響，還可根據(jù)需要調(diào)整正負(fù)電荷的比例，對(duì)不同類型的極性和親水性物質(zhì)分離，均顯示有效的保留和良好的分離選擇性，具有一定的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為陰陽離子分別鍵合的兩性離子固定相的制備示意圖；

圖2為17種核苷混合物在所制備的本發(fā)明兩性離子柱上的分離色譜圖；其中，色譜峰：1.5′-脫氧-5′-甲硫腺苷，2.胸腺嘧啶核苷，3.3-甲基尿苷，4.N6-甲基腺苷，5.5-甲基尿苷，6.尿苷，7.腺苷，8.5-甲基胞嘧啶，9.1-甲基鳥苷，10.肌苷，11.假尿苷，12.2′-脫氧鳥苷，13.胞苷，14.鳥苷，15.1-甲基腺苷，16.黃苷，17.7-甲基鳥苷；分離條件為流動(dòng)相95％ACN(10mM NH₄FA)/H₂O(10mM NH₄FA)＝90/10(v/v)，等度洗脫；DAD：254nm；流速：0.4mL/min；柱溫：30℃；

圖3為11種堿基的分離色譜圖；其中，色譜峰：1.胸腺嘧啶，2.尿嘧啶，3.1-甲基黃嘌呤，4.N⁴-乙酰胞嘧啶，5.1-甲基鳥嘌呤，6.腺嘌呤，7.黃嘌呤，8.次黃嘌呤，9.7-甲基鳥嘌呤，10.胞嘧啶，11.鳥嘌呤；分離條件：流動(dòng)相95％ACN(10mM NH₄FA)/H₂O(10mM NH₄FA)＝90/10(v/v)，等度洗脫；DAD：254nm；流速：0.4mL/min；柱溫：30℃

圖4為12種核苷酸混合物的分離色譜圖；其中，色譜峰：1.cTMP，2.3'：5′-cAMP，3.2′：3′-cAMP，4.cIMP，5.cGMP，6.cCMP；7.TMP，8.UMP，9.AMP，10.IMP，11.CMP，12.GMP；分離條件：流動(dòng)相A相為H₂O(10mM NH₄FA)，B相為ACN/H₂O(95/5，v/v，10mM NH₄FA)，梯度洗脫以20％A起始并保持5min，5-10min內(nèi)線性增加至40％A并保持，DAD 254nm；流速0.4mL/min，柱溫：30℃；

圖5(a)為6種堿性物質(zhì)的分離色譜圖；其中，色譜峰：1.Diphenhydramine苯海拉明；2.Nortriptyline去甲替林；3.Benzyltrimethylammonium芐基三甲銨；4.trimethylphenyl；5.procainamide；6.Benzylamine芐胺；

圖5(b)為8種酸性物質(zhì)的分離色譜圖；其中，色譜峰：1.苯酚；2.3，5-二硝基苯甲酸；3.對(duì)甲氧基苯甲酸；4.對(duì)硝基苯甲酸；5.3-氯苯甲酸；6.苯甲酸；7.對(duì)羥基苯甲酸；8.間羥基苯甲酸.分離條件：分離條件：流動(dòng)相95％ACN(10mM NH₄FA)/H₂O(10mM NH₄FA)＝90/10(v/v)，等度洗脫；DAD：254nm；流速：0.4mL/min；柱溫：30℃；

圖6為7種兩性物質(zhì)的分離色譜圖；其中，色譜峰：1.對(duì)氨基苯甲酸；2.馬尿酸；3.煙酸；4.乳清酸；5.phe；6.try；7.tyr；分離條件：流動(dòng)相95％ACN(10mM NH₄FA)/H₂O(10mM NH₄FA)＝85/15(v/v)，等度洗脫；DAD：254nm；流速：0.4mL/min；柱溫：30℃。

具體實(shí)施方式

下面通過實(shí)例進(jìn)一步闡釋本發(fā)明，實(shí)例僅限于說明本發(fā)明以便于理解，而非對(duì)本發(fā)明的限定。

陰陽離子可分別鍵合的離子液體的制備

陰陽離子分別鍵合的兩性離子固定相的制備步驟如圖1所示。將1.23g 2-溴乙基丙烯酸酯溶解在少量乙酸乙酯在中，邊攪拌邊加入3.0g 1-甲基咪唑，在氬氣保護(hù)下反應(yīng)液避光反應(yīng)約24小時(shí)，直至反應(yīng)物生成致攪拌不動(dòng)。靜置除去上層溶劑，粘稠的產(chǎn)物用乙酸乙酯洗滌4-5除去未反應(yīng)的原料，60℃真空干燥，得到產(chǎn)物1。得到的產(chǎn)物1與3-磺丙基丙烯酸鹽鉀鹽通過離子交換得到產(chǎn)物2，然后將產(chǎn)物2鍵合至二氧化硅球表面得到目標(biāo)固定相。

將合成的產(chǎn)物1與3-磺丙基丙烯酸鹽鉀鹽進(jìn)行離子交換，制備陰陽離子中均含有可反應(yīng)的活性基團(tuán)的產(chǎn)物2，具體步驟如下。將1.4957g的產(chǎn)物1溶解在15mL去離子水中，攪拌下加入溶解在15mL去離子水中的3-磺丙基丙烯酸鹽鉀鹽1.3332g，充分?jǐn)嚢柘码x子交換反應(yīng)進(jìn)行約30小時(shí)。反應(yīng)液直接減壓旋蒸出去水分，得到的產(chǎn)物2于60℃真空干燥，生成的NaBr鹽未除去，在后續(xù)將產(chǎn)物2鍵合至硅膠表面的步驟中通過洗滌和離心出去。

陰陽離子分別鍵合的兩性離子固定相的制備

首先，通過硅烷化反應(yīng)在二氧化硅球表面接枝活性官能團(tuán)3-巰基丙基，將6.6g二氧化硅球(粒徑5μm，孔徑10nm，比表面積310m²g^-1)分散在72mL無水甲苯中，攪拌均勻，加入4.0mL(3-巰基丙基)三甲氧基硅烷，在氬氣保護(hù)下加熱回流24小時(shí)，離心，用甲醇洗滌6次，得到3-巰基丙基修飾的二氧化硅球，真空60℃干燥待用。

其次，將實(shí)施例得到的產(chǎn)物2通過巰基與雙鍵的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)鍵合至3-巰基丙基修飾的二氧化硅球表面，將3.24g 3-巰基丙基修飾的硅球分散于溶解有產(chǎn)物2的55mL甲醇中，攪拌分散混合均勻，加入0.08g溶解在10mL甲醇中的引發(fā)劑AIBN，在氬氣保護(hù)下加熱至60℃回流反應(yīng)26小時(shí)，反應(yīng)液離心后，用甲醇、水、甲醇依次洗滌，得到目標(biāo)固定相，真空60℃干燥待裝柱。

最后，將得到的陰陽離子分別鍵合的兩性離子固定相填料裝填成3.0mm×15cm的液相色譜柱，采用勻漿法，以50mL甲醇作為頂替液，在60MPa的壓力下將勻漿液(目標(biāo)固定相1.2g分散在12mL甲醇中)填充至不銹鋼管柱中。

陰陽離子分別鍵合的兩性離子固定相的評(píng)價(jià)

對(duì)所得固定相進(jìn)行元素分析表征表面鍵合量，結(jié)果為C％14.94，N％1.65，S％4.27，3-巰基丙基的二氧化硅球元素分析結(jié)果為C％3.93，S％2.64，以N和S元素含量計(jì)算，固定相的陰陽離子鍵合量相當(dāng)，約為2.05～2.30μmol/m²。

對(duì)所制備的兩性離子色譜柱和HILIC保留性能和分離選擇性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，首先分離了典型的親水和極性化合物，如圖2和圖3所示分別為對(duì)核苷混合物和堿基混合物的分離色譜圖。結(jié)果顯示，制備的固定相顯示典型的HILIC保留行為，對(duì)典型親水性化合物具有很好的分離選擇性。之后，采用不同類型的親水和極性混合物對(duì)兩性離子固定相的色譜性能進(jìn)行了進(jìn)一步表征，圖4、圖5(a)、(b)和圖6分別為核苷酸、堿性化合物和酸性化合物以及兩性物質(zhì)的分離結(jié)果，可以看出，所制備的色譜柱對(duì)不同類型的極性和親水性化合物均具有良好的保留和分離選擇性，作為新型HILIC固定相具有一定的應(yīng)用潛力。