本發(fā)明涉及一種從樣品中移除平面剛性結(jié)構(gòu)分子的技術(shù)方法，適用于食品、藥物、污水處理等領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

平面剛性分子在這里既指整個(gè)分子為平面剛性構(gòu)型的分子，又指部分結(jié)構(gòu)為平面剛性構(gòu)型的分子。在這些分子中，往往存在著一個(gè)或多個(gè)芳香環(huán)系。這些芳香環(huán)系通過(guò)共軛體系（例如π-π共軛）使得所涉及的原子束縛在一個(gè)平面，形成剛性的平面結(jié)構(gòu)。

這種平面構(gòu)型以及所具有的疏水性質(zhì)，使得平面剛性分子能夠與dna雙鏈螺旋發(fā)生相互作用。據(jù)信許多平面剛性分子能夠嵌入到dna雙螺旋結(jié)構(gòu)的相鄰兩對(duì)堿基對(duì)之間，也可以結(jié)合到dna的大溝和小溝中。由于能與dna發(fā)生相互作用，因此這類物質(zhì)有可能對(duì)dna的功能造成影響。

溴乙錠是一種在實(shí)驗(yàn)室頻繁使用到的生化試劑，其具有平面剛性結(jié)構(gòu)，為超強(qiáng)的dna嵌入劑，是公認(rèn)的dna誘變劑。

苯并芘也是一種平面剛性分子，在煉油以及食用油生產(chǎn)使用過(guò)程中都有可能產(chǎn)生。據(jù)信苯并芘是一種高活性間接致癌物，其在哺乳動(dòng)物體內(nèi)能夠在酶的分解代謝作用下生成帶平面剛性結(jié)構(gòu)的活性衍生物。苯并芘進(jìn)入體內(nèi)后，除少部分以原形隨糞便排出外，一部分經(jīng)肝、肺細(xì)胞微粒體中混合功能氧化酶激活而轉(zhuǎn)化為數(shù)十種代謝產(chǎn)物。其中一部分可轉(zhuǎn)化為環(huán)氧化物，特別是轉(zhuǎn)化成7,8-環(huán)氧化物，7,8-環(huán)氧化物再代謝產(chǎn)生7,8-二氫二羥基-9,10-環(huán)氧化苯并[a]芘。這種物質(zhì)據(jù)信是一種致癌物。這種致癌物有四種異構(gòu)體，其中的(+)-bp-7β，8α-二醇體-9α,10α-環(huán)氧化物-苯并[a]芘，已證明致癌性最強(qiáng)，它與dna形成共價(jià)鍵結(jié)合，造成dna損傷，如果dna不能修復(fù)或修而不復(fù)，細(xì)胞就可能發(fā)生癌變。

黃曲霉毒素也帶有平面剛性結(jié)構(gòu)，是黃曲霉產(chǎn)生的有毒代謝物質(zhì)，被世界衛(wèi)生組織（who）的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為1類致癌物。黃曲霉毒素在生物體內(nèi)經(jīng)過(guò)羥化而衍生成的各種代謝產(chǎn)物，成為強(qiáng)致癌性物質(zhì)。黃曲霉毒素廣泛的分布于發(fā)霉的糧食及其制品中，特別是花生、花生油、玉米及其制品、乳及乳制品，發(fā)霉的飼料中也有發(fā)現(xiàn)含有較多的黃曲霉毒素。因此，黃曲霉毒素對(duì)人畜都帶來(lái)健康風(fēng)險(xiǎn)。

馬兜鈴酸是中藥材中的一種成分，中國(guó)藥典和國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)收載的已明確含馬兜鈴酸的藥材有關(guān)木通、廣防己、青木香、天仙藤、馬兜鈴、尋骨風(fēng)、朱砂蓮等。這些植物曾廣泛地被中醫(yī)經(jīng)經(jīng)炮制解毒作為原生藥材入藥，在國(guó)際上含馬兜鈴酸的植物也曾被廣泛入藥?，F(xiàn)在發(fā)現(xiàn)，馬兜鈴酸ⅰ及其代謝產(chǎn)物馬兜鈴內(nèi)酰胺具有腎毒性。馬兜鈴酸對(duì)腎臟的影響在世界范圍內(nèi)取得共識(shí)，國(guó)外甚至稱之為“中草藥腎病”，中國(guó)學(xué)者則稱之為“馬兜鈴酸腎病”。另外，對(duì)馬兜鈴酸代謝過(guò)程及代謝酶的研究證實(shí)，馬兜鈴酸還具有致突變和致癌毒性。其在代謝作用下，產(chǎn)生的中間產(chǎn)物馬兜鈴內(nèi)酰胺氮離子能與dna堿基環(huán)外氨基親電結(jié)合，生成相應(yīng)的加合產(chǎn)物，使ras基因和p53基因發(fā)生突變，進(jìn)而誘發(fā)腫瘤。

此外，在天然藥物中，香豆素類化合物也具有平面剛性結(jié)構(gòu)。盡管香豆素類多是作為具有有效生理活性的成分來(lái)報(bào)道，但由于這類物質(zhì)眾多，在天然藥物提取物中存在的衍生物種類難以計(jì)數(shù)，因此也會(huì)存在健康風(fēng)險(xiǎn)。

鑒于平面剛性分子在生活環(huán)境中大量存在，且對(duì)包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物造成健康風(fēng)險(xiǎn)，因此在使用或者食用之前，從樣品中移除這類分子顯得尤為重要。

由于這類分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，其往往會(huì)與dna雙螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生結(jié)合。本發(fā)明人也通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，包括苯并芘、黃曲霉毒素在內(nèi)的平面剛性分子可以與dna結(jié)合，從而能夠利用dna將這類分子移除。

在將dna應(yīng)用于大體積的含平面剛性分子的樣品時(shí)，除了要考慮有效性以外，還需要考慮操作的便捷性和經(jīng)濟(jì)成本。如果在將dna施用于樣品中以結(jié)合其中的平面剛性分子之后，能便捷地將dna-平面剛性分子復(fù)合物分離并容易地使平面剛性分子從dna分子脫除，從而使得可重復(fù)使用dna分子，這將會(huì)使得這種方法變得更加高效且成本更低。

將dna與固相結(jié)合將是實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的很好策略。將dna以共價(jià)結(jié)合或非共價(jià)結(jié)合的方式連接至固相是相當(dāng)成熟的技術(shù)。將dna連接至常規(guī)的固相材料如纖維素、膠粒或瓊脂糖已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用。當(dāng)dna以dna-固相材料的形式施用于樣品中之后，后續(xù)的分離變得相當(dāng)?shù)娜菀?，從而dna殘留于樣品中的可能也降至最小。可以將dna-固相材料作為洗脫柱的形式應(yīng)用，樣品從固相柱流過(guò)，其中的平面剛性分子被保留在固相上，使得樣品得以純化?；蛘呖梢詫na-固相材料與樣品的混合物離心和/或過(guò)濾，使dna-固相材料連同平面剛性分子與樣品分離。

除了常規(guī)的固相如纖維素、膠粒和瓊脂糖以外，另一種目前用于與dna偶聯(lián)的固相是磁珠，例如鏈霉親和素包被的磁珠，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物素化核酸。這種超順磁珠具有共價(jià)連接到表面的鏈霉親和素，可以高效地偶聯(lián)生物素化的dna分子。當(dāng)dna以dna-磁珠的形式應(yīng)用時(shí)，可以利用磁性輕易地將dna-磁珠連同平面剛性分子與樣品分離。

在回收dna后，可以通過(guò)升高溫度的方法使dna變性。當(dāng)dna變性時(shí)，雙鏈結(jié)構(gòu)打開(kāi)，dna的高級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，使dna分子與平面剛性分子的結(jié)合力減弱或者完全喪失，這樣可以輕易地將平面剛性分子從dna分子上移除。在移除平面剛性分子后，可以再降低溫度使dna分子復(fù)性，從而可循環(huán)用于下一次應(yīng)用。當(dāng)以dna-固相材料如dna-磁珠的形式應(yīng)用時(shí)，將有利于這種后續(xù)的dna循環(huán)利用操作。

將dna-固相材料應(yīng)用于移除平面剛性分子時(shí)，dna可能會(huì)遭遇到較為嚴(yán)苛的條件，例如升高的溫度、摩擦力、剪切應(yīng)力等。這種嚴(yán)苛的條件可能會(huì)使dna分子過(guò)早的變性，從而使得dna與平面剛性分子的結(jié)合力下降，從而移除效率下降。因此dna分子中較高的鳥嘌呤（g）和尿嘧啶（c）堿基含量較高是有利的。gc堿基對(duì)之間能夠形成3個(gè)氫鍵，使得較高gc堿基含量的dna分子抵抗嚴(yán)苛條件的能力增強(qiáng)。因此在本發(fā)明的實(shí)施例中，dna分子的堿基含量較高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是：提供一種從樣品中移除平面剛性結(jié)構(gòu)物質(zhì)的方法，通過(guò)本發(fā)明能夠有效地降低樣品中平面剛性結(jié)構(gòu)分子的含量，操作簡(jiǎn)單，成本低，效率高。

解決上述技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案是：一種從樣品中移除平面剛性結(jié)構(gòu)物質(zhì)的方法，包括以下步驟：

（1）將核酸-固相材料與待處理樣品充分混合以得到混合物；

（2）將核酸-固相材料從所述混合物中分離，以得到從樣品中移除平面剛性結(jié)構(gòu)分子的樣品。

所述待處理樣品為油性溶液或水性溶液。

所述待處理樣品是食用溶液、油料、污水或藥用提取物。

所述固相材料為纖維素、膠粒或瓊脂糖，并且其中所述分離包括離心和/或過(guò)濾和/或使所述待處理樣品經(jīng)過(guò)裝填有所述核酸-固相材料的柱子。

所述固相材料為磁珠，并且其中所述分離包括用磁性裝置將所述核酸-固相材料吸出。

所述核酸為雙鏈dna；所述dna的序列富含gc，即dna中g(shù)c含量為30%-100%。

所述的混合方式是攪拌混合20分鐘-5小時(shí)，或是待處理樣品經(jīng)過(guò)裝填有所述核酸-固相材料的柱子。

所述核酸-固相材料與所述待處理樣品的體積比為1:1–1:500。

該方法還包括回收所述核酸-固相材料以供循環(huán)利用的步驟；回收所述核酸-固相材料的具體步驟為：

（1）升高溫度，使吸附有所述平面剛性結(jié)構(gòu)分子的所述核酸-固相材料中的核酸變性；

（2）用溶劑洗脫或提取所述平面剛性結(jié)構(gòu)分子；

（3）將溫度降低，使所述核酸-固相材料中的核酸復(fù)性。

回收所述核酸-固相材料的具體步驟為：

（1）使吸附有平面剛性結(jié)構(gòu)分子的核酸-固相材料溫度升高至80～100攝氏度，并緩慢攪拌20～100分鐘，使吸附有平面剛性結(jié)構(gòu)分子的核酸-固相材料中的核酸變性；

（2）用溶劑洗脫或提取核酸-固相材料中的平面剛性結(jié)構(gòu)分子；所述的溶劑是溫度為50～80攝氏度的熱水或是有機(jī)溶劑；

（3）將核酸-固相材料的溫度降低至室溫，使所述核酸-固相材料中的核酸復(fù)性，得到脫除平面剛性結(jié)構(gòu)分子的核酸-固相材料。

本發(fā)明在常溫下將與固相偶聯(lián)的dna與待處理樣品混合，使樣品中的平面剛性結(jié)構(gòu)分子跟dna發(fā)生結(jié)合。通過(guò)離心過(guò)濾（或者如果固相是磁珠的話，采用磁力架）從該混合物中分離固相-dna-目標(biāo)物復(fù)合體，從而使得樣品脫除平面剛性結(jié)構(gòu)分子。將分離的固相-dna-目標(biāo)物復(fù)合體升溫至dna變性溫度，使dna變性，降低dna與平面剛性結(jié)構(gòu)分子的結(jié)合力，并用溶劑洗脫平面剛性分子。隨后降低溫度使固相-dna中的dna復(fù)性，從而得以實(shí)現(xiàn)固相-dna的循環(huán)利用，降低成本。本方法操作簡(jiǎn)單，未在樣品中引入新的污染物，并且可以循環(huán)利用，成本降低。

平面剛性結(jié)構(gòu)分子廣泛存在于生活環(huán)境中，例如食用油中的苯并芘、鮮牛奶和農(nóng)副產(chǎn)品中的黃曲霉毒素、實(shí)驗(yàn)室試劑溴乙錠、中藥材中的馬兜鈴酸等，都帶有平面剛性結(jié)構(gòu)。這一類物質(zhì)常常以微小的含量存在，但會(huì)給人和其他動(dòng)物帶來(lái)較大的健康風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的方法可用于處理含有這類物質(zhì)的樣品，從而使樣品中的平面剛性結(jié)構(gòu)分子含量降至最小。本方法具有效率高、使用方便、成本低等優(yōu)點(diǎn)，在食品、藥物、污水處理等領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明是在常溫下將核酸-固相材料與待處理樣品混合或充分接觸，使待處理樣品中的平面剛性結(jié)構(gòu)分子跟核酸發(fā)生結(jié)合，再分離出樣品，從而得到脫除平面剛性結(jié)構(gòu)分子的樣品，主要有兩種技術(shù)方案：

方案一：

（1）將核酸-固相材料與待處理樣品充分混合以得到混合物；所述混合是將核酸-固相材料與待處理樣品攪拌混合20分鐘-5小時(shí)，使待處理樣品中的平面剛性結(jié)構(gòu)分子跟核酸發(fā)生結(jié)合；核酸-固相材料與所述樣品的體積比為1:1–1:500；

（2）將核酸-固相材料從所述混合物中分離，以得到從樣品中移除平面剛性結(jié)構(gòu)分子的樣品；當(dāng)固相材料為纖維素、膠粒或瓊脂糖，所述分離是離心和/或過(guò)濾；當(dāng)固相材料為磁珠，分離是用磁性裝置將核酸-固相材料吸出。

方案二：

（1）將核酸-固相材料與待處理樣品充分混合以得到混合物；所述混合是待處理樣品經(jīng)過(guò)裝填有所述核酸-固相材料的柱子，使待處理樣品中的平面剛性結(jié)構(gòu)分子跟核酸發(fā)生結(jié)合；柱子的高度要求不小于40cm。

（2）將核酸-固相材料從所述混合物中分離，所述的分離也是將待處理樣品經(jīng)過(guò)裝填有所述核酸-固相材料的柱子的過(guò)程，以得到從樣品中移除平面剛性結(jié)構(gòu)分子的樣品。

實(shí)施例1：采用dna-磁珠從茶籽油中移除苯并芘。

1、稱取100g茶籽油粗品，經(jīng)檢測(cè)苯并芘含量為16.1μg/kg，將樣品置于250ml帶有密封蓋的玻璃容器中。

2、添加4-10ml商購(gòu)獲得的dna-磁珠，蓋上密封蓋。

3、在室溫下，用磁力攪拌器以50轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌速度緩慢攪拌1個(gè)小時(shí)。期間每隔大約10-20分鐘，用手拿起容器顛倒振搖數(shù)次，以促進(jìn)dna-磁珠與樣品充分接觸。

4、1小時(shí)后，靜置大約1分鐘，讓dna-磁珠完全沉降在容器底部。

5、打開(kāi)密封蓋，用磁力架放在容器開(kāi)口，容器中的大部分dna-磁珠吸附在磁力架上。保持5分鐘，讓dna-磁珠上殘留的油滴瀝干。

6.從容器開(kāi)口移走磁力架，并將磁力架上的dna-磁珠取下。再次將磁力架放在容器開(kāi)口上，容器中的dna-磁珠完全被吸走。

7.再次檢測(cè)經(jīng)處理的茶籽油樣品的苯并芘含量，檢測(cè)值為5.4μg/kg。

該實(shí)例中所選用的茶籽油的苯并芘含量為16.1μg/kg，采用常見(jiàn)的活性炭吸附法處理的油的苯并芘含量約為10μg/kg。但是會(huì)導(dǎo)致油脂損耗量為活性炭添加量的1-2倍，而且吸附苯并芘后的活性炭的處理很困難，解析或者煅燒都會(huì)導(dǎo)致苯并芘會(huì)再次泄露到空氣中。利用固定化dna脫除苯并芘的方法，在上述條件下進(jìn)行處理，脫除后含苯并芘量可降至5.4μg/kg，同時(shí)后續(xù)操作簡(jiǎn)單，不帶入任何殘留。

因此，可見(jiàn)本發(fā)明利用固定化dna脫除苯并芘，不僅脫除效果好，而且可以顯著地降低油脂損耗，操作簡(jiǎn)單，成本低。

當(dāng)然，顯而易見(jiàn)的是，可以本實(shí)施例中的dna-磁珠中的固相可以改成其他常用固相，同樣可以獲得類似良好的效果。

實(shí)施例2：利用dna-磁珠從水溶液中移除溴乙錠。

我國(guó)擁有各類高等院校大約2000余所，各類化學(xué)實(shí)驗(yàn)室有數(shù)10萬(wàn)個(gè)，每天都有大批師生做各種化學(xué)實(shí)驗(yàn)，產(chǎn)生大量廢液，其中危害最大的一種污染物是溴乙錠。在本實(shí)施例中，向一定體積的水中添加定量的溴乙錠作為受污染水體的樣品，利用本發(fā)明方法移除其中的溴乙錠，以展示本發(fā)明在污水處理方面的實(shí)用性。本實(shí)施例包括以下步驟：

1.向帶有密封蓋的玻璃容器中的500ml純凈水中添加溴乙錠（eb）以制備溴乙錠含量為50mg/l的廢水樣品。

2.添加4-10ml商購(gòu)獲得的dna-磁珠，蓋上密封蓋。

3、在室溫下，用磁力攪拌器以50轉(zhuǎn)/分鐘的攪拌速度緩慢攪拌約20分鐘。

4、20分鐘后，靜置大約1分鐘，讓dna-磁珠完全沉降在容器底部。

5、打開(kāi)密封蓋，用磁力架放在容器開(kāi)口，讓容器中的dna-磁珠全部吸附在磁力架上。保持5分鐘，讓dna-磁珠上殘留的水瀝干。

6.從容器開(kāi)口移走磁力架，并將磁力架上的dna-磁珠取下。

7.利用溴乙錠在480nm的特征吸收峰對(duì)經(jīng)處理的水中的溴乙錠含量進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)樣品中的溴乙錠含量不可檢出。

在本實(shí)施例中，由于溴乙錠與dna有極強(qiáng)的親和力，因此可以用相對(duì)較少的dna即可吸附樣品中的全部溴乙錠。另外，由于dna-磁珠被完全從樣品中移除，因此可以用于將受污染水性樣品中的溴乙錠完全移除。

當(dāng)然，顯而易見(jiàn)的是，本發(fā)明不僅可以用很好地處理受溴乙錠污染的水體，而且可以用于處理其他平面剛性分子物質(zhì)污染的水體。根據(jù)污染分子與dna的親和程度，可以相應(yīng)調(diào)整dna-磁珠的用量，同樣可以達(dá)到很好的效果。此外，本實(shí)施例所用的固相物質(zhì)不僅限于磁珠，其他常用于dna固定化的固相同樣適用于本發(fā)明。

本發(fā)明通過(guò)限定所述核酸-固相材料與所述樣品的體積比，能夠保證核酸-固相材料中的有效量足夠平面剛性結(jié)構(gòu)分子跟dna發(fā)生結(jié)合，所述有效量取決于所述核酸-固相材料中的核酸序列長(zhǎng)度和gc含量以及所述平面剛性結(jié)構(gòu)分子的性質(zhì)。一般要求核酸-固相材料與所述樣品的體積比(v/v)為1:1–1:500，可以是1:1、1:5、1:10、1:20、1:30、1:40、1:50、1:100、1:150、1:200、1:250、1:300、1:350、1:400或1:500。

實(shí)施例3：利用dna-葡聚糖微珠柱移除溶液中的黃曲霉毒素b1。

由于農(nóng)作物常常會(huì)感染黃曲霉，因此農(nóng)副產(chǎn)品中有可能含有黃曲霉毒素b1，這是一種毒性很強(qiáng)的污染物。本實(shí)施例展示本發(fā)明方法從樣品中移除黃曲霉毒素b1的方法。本實(shí)施例包括以下步驟：

1.將商購(gòu)獲得的黃曲霉毒素b1甲醇標(biāo)準(zhǔn)品在30ml甲醇/水（4/1，v/v）溶液中配制成5μg/ml的樣品。

2.將商購(gòu)的dna-葡聚糖微珠裝柱，柱高是50cm，在室溫下平衡30分鐘。

3.用去離子水洗滌純化柱2次，每次10毫升，使液體以1-5滴/秒的流速流出。

4.將樣品加入純化柱中，調(diào)節(jié)流量至1-6滴/秒，直至樣品全部流出純化柱，得到脫除平面剛性結(jié)構(gòu)分子的樣品。

5.用蒸餾水洗滌純化柱3次，每次2-10毫升。

6.加入20ml甲醇，收集洗脫產(chǎn)物。

7.檢測(cè)洗脫產(chǎn)物中黃曲霉毒素b1的含量。

經(jīng)測(cè)定，該純化柱吸附了樣品中65.6%的黃曲霉毒素b1。盡管黃曲霉移除效率還有待提高，但鑒于本發(fā)明方法操作簡(jiǎn)單，dna-固相材料可以在純化回收后可循環(huán)使用，將經(jīng)過(guò)該柱純化的樣品再次上樣，重復(fù)以上步驟4至步驟7。經(jīng)測(cè)定，樣品中的黃曲霉毒素含量進(jìn)一步降低至21.1%。因此通過(guò)使含黃曲霉毒素的樣品多次用本發(fā)明方法處理，可以大大減少毒素含量。

當(dāng)然，顯而易見(jiàn)的是，可以本實(shí)施例中的dna-葡聚糖微珠中的固相可以改成其他常用固相，例如磁珠，同樣可以獲得類似良好的效果。

本發(fā)明各實(shí)施例中dna是雙鏈dna；所述dna的序列富含gc，可以是30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、99%，或甚至100%的gc含量，即dna中g(shù)c含量為30%-100%。

實(shí)施例4：吸附有平面剛性分子材料的dna-磁珠的回收利用

本發(fā)明中的dna-固相材料可循環(huán)利用，以降低成本是本發(fā)明的一個(gè)特點(diǎn)。下面的實(shí)施例將展示本發(fā)明的回收利用方法。具體步驟如下：

1.收集2ml來(lái)自實(shí)施例2中的吸附有溴乙錠（eb）的dna-磁珠（eb含量為6.3mg），置于500ml玻璃燒瓶中的純凈水中。

2.用水浴將該玻璃燒瓶中的溫度升高至90攝氏度，緩慢攪拌30分鐘。

3.用磁力架從玻璃燒瓶中吸出dna-磁珠，迅速用熱水沖洗30秒。

4.從磁力架取下dna-磁珠，將dna-磁珠在室溫下保存約30分鐘，然后檢測(cè)其中的溴乙錠含量。

檢測(cè)結(jié)果顯示，dna-磁珠中的溴乙錠無(wú)法檢出，從而表明，通過(guò)在dna的變性溫度下用洗脫劑洗脫溴乙錠，溴乙錠可以完全從dna-磁珠移除，從而dna-磁珠可以得以循環(huán)利用。

本發(fā)明實(shí)施例4步驟3中，除了采用熱水洗脫平面剛性分子外，還可以采用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等有機(jī)溶劑。