本發(fā)明屬于功能化磁性納米材料技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種表面聚合離子液體修飾的磁性納米材料及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)糖基化是一種常見(jiàn)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，與多種生命活動(dòng)密切相關(guān)。目前針對(duì)糖蛋白的研究方法主要是先將糖蛋白酶切成肽段，再通過(guò)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(maldi-tofms)或液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(lc-ms/ms)進(jìn)行分析。由于復(fù)雜生物樣本中糖蛋白含量低，在質(zhì)譜分析中，同時(shí)存在高豐度的非糖基化肽段的信號(hào)抑制和干擾。因此，對(duì)糖肽進(jìn)行選擇性富集分離，是開(kāi)展糖蛋白研究的關(guān)鍵。

目前針對(duì)糖肽富集的方法主要有：凝集素親和色譜法、硼酸親和色譜法、酰肼化學(xué)法和親水相互作用色譜法。其中，凝集素親和色譜法特異性高，無(wú)法實(shí)現(xiàn)多種糖鏈結(jié)構(gòu)的糖肽富集；酰肼化學(xué)法富集過(guò)程會(huì)對(duì)糖鏈造成破壞，無(wú)法得到完成的糖鏈信息；硼酸與糖鏈的相互作用力較弱，對(duì)復(fù)雜樣品中糖肽富集效率有限。而親水相互作用色譜法由于其操作簡(jiǎn)單，并且能保留完整的糖鏈信息，在糖蛋白研究中具有巨大的應(yīng)用前景。然而，采用親水相互作用色譜法對(duì)糖肽進(jìn)行富集時(shí)所使用的親水材料通常為表面修飾親水基團(tuán)層的納米材料，存在選擇性有限，靈敏度低等問(wèn)題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種表面聚合離子液體修飾的磁性納米材料及其制備方法與應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種表面聚合離子液體修飾的磁性納米材料，它由磁性納米顆粒、包覆在所述磁性納米顆粒表面的二氧化硅層和通過(guò)在所述二氧化硅層的表面修飾末端帶有碳碳雙鍵的硅烷偶聯(lián)試劑以沉淀聚合的方式聚合在所述二氧化硅層表面的親水性離子液體層組成。

上述的材料中，所述末端帶有碳碳雙鍵的硅烷偶聯(lián)試劑可為3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯。

上述的材料中，所述親水性離子液體可為甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨。

上述的材料中，所述表面聚合離子液體修飾的磁性納米材料的結(jié)構(gòu)式可如下：

式ⅰ中，●表示外層包覆二氧化硅層的磁性納米顆粒；n為10～100之間的正整數(shù)。

上述的材料中，所述磁性納米顆粒的粒徑可為20～200nm，如150～200nm。

上述的材料中，所述磁性納米顆?？蔀閒e3o4磁性納米顆粒，如γ-fe3o4磁性納米顆粒。

上述的材料中，所述二氧化硅層的厚度無(wú)特殊要求。

本發(fā)明還提供了上述任一項(xiàng)所述的表面聚合離子液體修飾的磁性納米材料的制備方法，包括如下步驟：

(1)在磁性納米顆粒的表面包覆二氧化硅層，得到產(chǎn)物ⅰ；

(2)在所述產(chǎn)物ⅰ中二氧化硅層的表面修飾末端帶有碳碳雙鍵的硅烷偶聯(lián)試劑，得到表面修飾有碳碳雙鍵的產(chǎn)物ⅱ；

(3)在引發(fā)劑和交聯(lián)劑存在的條件下，所述表面修飾有碳碳雙鍵的產(chǎn)物ⅱ與離子液體進(jìn)行沉淀聚合，即可得到所述表面聚合離子液體修飾的磁性納米材料。

上述的制備方法中，步驟(1)中，所述磁性納米顆?？蔀閒e3o4磁性納米顆粒，如γ-fe3o4磁性納米顆粒。所述γ-fe3o4磁性納米顆?？砂凑粘Ｒ?guī)方法制備得到，如在六水合三氯化鐵的乙二醇溶液中加入無(wú)水乙酸鈉，得混合液；對(duì)所述混合液進(jìn)行加熱，冷卻后干燥即可得到所述γ-fe3o4磁性納米顆粒。

所述在六水合三氯化鐵的乙二醇溶液中，六水合三氯化鐵的質(zhì)量和乙二醇的體積比可為(0.6～3)g：(20～100)ml，具體可為0.675g：30ml；

所述六水合三氯化鐵與所述無(wú)水乙酸鈉的質(zhì)量比可為(0.6～3)：(1.5～7)，具體可為0.675：1.8；

所述加熱的溫度可為200℃，時(shí)間可為8～12小時(shí)，具體可為8小時(shí)。

上述的制備方法中，步驟(1)中，可采用常規(guī)的方法在所述磁性納米顆粒的表面包覆二氧化硅層。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，通過(guò)如下步驟在所述磁性納米顆粒的表面包覆二氧化硅層：將磁性納米顆粒分散在由乙醇、水和濃氨水組成的混合液中，經(jīng)攪拌后加入正硅酸乙酯，繼續(xù)攪拌反應(yīng)，即可得到產(chǎn)物ⅰ。

上述的制備方法中，步驟(2)中，可采用常規(guī)的方法在所述二氧化硅層的表面修飾末端帶有碳碳雙鍵的硅烷偶聯(lián)試劑。在本發(fā)明的具體實(shí)施例中，通過(guò)如下步驟在所述二氧化硅層的表面修飾末端帶有碳碳雙鍵的硅烷偶聯(lián)試劑：在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)條件下，以異丙醇為溶劑，所述產(chǎn)物ⅰ和所述末端帶有碳碳雙鍵的硅烷偶聯(lián)試劑進(jìn)行反應(yīng)，即可得到所述末端帶有碳碳雙鍵的產(chǎn)物ⅱ。

上述的制備方法中，步驟(3)中，所述表面修飾有碳碳雙鍵的產(chǎn)物ⅱ的質(zhì)量與所述離子液體的體積比可為(30～50)mg：(50～300)μl，具體可為40mg：(50～300)μl、(30～50)mg：200μl或40mg：200μl。

所述引發(fā)劑與所述離子液體的質(zhì)量比可為1：(10～1000)，具體可為1：40；所述引發(fā)劑可為偶氮二異丁腈。

所述交聯(lián)劑與所述離子液體的質(zhì)量比可為1：(1～5)，具體可為1：1；所述交聯(lián)劑可為n,n’-亞甲基雙丙烯酰胺。

所述沉淀聚合的溫度可為85～95℃，具體可為95℃；時(shí)間可為1.5～3小時(shí)，具體可為1.5小時(shí)。

所述沉淀聚合以無(wú)水乙腈為溶劑。

本發(fā)明也提供了上述任一項(xiàng)所述的表面聚合離子液體修飾的磁性納米材料在富集糖肽中的應(yīng)用。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了利用上述任一項(xiàng)所述的表面聚合離子液體修飾的磁性納米材料對(duì)糖進(jìn)行富集的方法，包括如下步驟：利用所述表面聚合離子液體修飾的磁性納米材料吸附糖肽樣品中的糖肽，用外加磁場(chǎng)分離吸附有糖肽的表面聚合離子液體修飾的磁性納米材料，即可實(shí)現(xiàn)對(duì)所述糖肽的富集。

上述的方法中，所述聚合離子液體修飾的磁性納米材料與所述糖肽樣品的質(zhì)量比可為(10～20)：1)，具體可為20：1。

所述糖肽樣品可以糖肽樣品溶液的形式存在；所述溶液的濃度可為1pmol/ml～1mmol/ml，具體可為10pmol/ml～1mmol/ml、10pmol/ml、50pmol/ml或1mmol/ml；

所述表面聚合離子液體修飾的磁性納米材料的質(zhì)量和所述糖肽樣品溶液的體積比可為20ug：(0.1～5)μl，具體可為20ug：1μl。

上述的方法中，所述吸附的步驟可如下：將糖肽樣品和所述表面聚合離子液體修飾的磁性納米材料置于富集緩沖溶液中進(jìn)行震蕩孵育。

所述表面聚合離子液體修飾的磁性納米材料的質(zhì)量和所述富集緩沖溶液的體積比可為20ug：(50～200)μl，具體可為20ug：50μl。

上述的方法中，所述富集緩沖溶液可為體積比為88：11.9：0.1的無(wú)水乙腈、水和三氟乙酸的混合液。

上述的方法中，所述震蕩孵育的頻率可為1000～1500rpm，具體可為1500rpm；時(shí)間可為10～30分鐘，具體可為10分鐘。

上述的方法中，所述方法在所述吸附之前還包括用富集緩沖液洗滌所述表面聚合離子液體修飾的磁性納米材料的步驟。所述富集緩沖溶液可為體積比為88：11.9：0.1的無(wú)水乙腈、水和三氟乙酸的混合液。

上述的方法中，所述方法在所述分離之后還包括用洗脫液洗滌吸附有糖肽的表面聚合離子液體修飾的磁性納米材料并收集洗脫液的步驟。所述洗脫液可為體積比為30：69.9：0.1的無(wú)水乙腈、水和三氟乙酸的混合液。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了一種糖肽的分析方法，它包括上述任一項(xiàng)所述的對(duì)糖肽進(jìn)行富集方法以及對(duì)富集得到的糖肽進(jìn)行maldi-tofms分析的步驟。

本發(fā)明具有如下有益效果：

(1)通過(guò)沉淀聚合的方法，在磁性納米顆粒表面聚合了離子液體；材料合成方法簡(jiǎn)單、清潔、快速。

(2)通過(guò)聚合的離子液體與糖肽的親水相互作用及靜電相互作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)糖肽高效地選擇性富集；糖肽富集效果好，可以實(shí)現(xiàn)低濃度人血清白蛋白(如igg)中糖肽的富集檢測(cè)。

附圖說(shuō)明

圖1為表面聚合離子液體修飾的磁性納米材料的合成路線示意圖。

圖2為實(shí)施例1中合成過(guò)程中各產(chǎn)物的透射電鏡照片和掃描電鏡照片，其中，圖2(a)為fe3o4納米顆粒的透射電鏡圖，圖2(d)為fe3o4納米顆粒的掃描電鏡圖；圖2(b)為fe3o4@mps的透射電鏡圖，圖2(e)為fe3o4@mps的掃描電鏡圖；圖2(c)為fe3o4@mps@pmac的透射電鏡圖，圖2(f)為fe3o4@mps@pmac的掃描電鏡圖。

圖3為將表面聚合離子液體修飾的磁性納米材料應(yīng)用于糖肽的高效富集流程圖。

圖4為實(shí)例1中表面聚合離子液體修飾的磁性納米材料富集人免疫球蛋白酶解液前后的maldi-tof質(zhì)譜圖，其中，圖4(a)為富集前的人免疫球蛋白酶解液(1pmol)；圖4(b)表面聚合離子液體的磁性納米材料富集后的人免疫球蛋白酶解液(1pmol)。

圖5為實(shí)施例2中表面聚合離子液體修飾的磁性納米材料富集不同濃度的人免疫球蛋白酶解液后的maldi-tof質(zhì)譜圖，其中，圖5(a)為50fmol，圖5(b)為10fmol。

圖6為實(shí)施例3中表面聚合離子液體修飾的磁性納米材料富集人免疫球蛋白酶解液與牛血清白蛋白酶解液混合液前后的maldi-tof質(zhì)譜圖，其中，圖6(a)為人免疫球蛋白酶解液與牛血清白蛋白酶解液混合液(1μg)；圖6(b)為表面聚合離子液體的磁性納米材料富集后的人免疫球蛋白酶解液與牛血清白蛋白酶解液混合液(1μg)。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

下述實(shí)施例中所用的磁性納米顆粒(γ-fe3o4)通過(guò)如下步驟制備得到：稱取0.675g六水合三氯化鐵溶解于30ml乙二醇中，超聲5min,得到的黃色透明液體，加入1.8g無(wú)水乙酸鈉，室溫下機(jī)械攪拌30min，所得溶液轉(zhuǎn)移至teflon內(nèi)襯不銹鋼高壓反應(yīng)釜，加熱至200℃，反應(yīng)8h后，取出反應(yīng)釜，冷卻后，將所得顆粒用無(wú)水乙醇和水清洗3次，50℃干燥過(guò)夜得fe3o4磁性納米顆粒。所得fe3o4磁性納米顆粒的透射電鏡圖和掃描電鏡圖如圖2所示，粒徑約為150～200nm。

人免疫球蛋白及牛血清白蛋白酶解液的配制過(guò)程如下：稱取1mg人免疫球蛋白或牛血清白蛋白，溶解于1ml50mm碳酸氫銨溶液中，加入20μl1moll-¹二硫蘇糖醇，37℃變性4h。加入7.2mg碘代乙酰胺，遮光烷基化反應(yīng)1h后，按照酶與蛋白質(zhì)質(zhì)量比1:50加入胰蛋白酶，37℃下酶切12h。酶切結(jié)束后，c18spe柱脫鹽，凍干，-20℃保存。

人免疫球蛋白酶解液和牛血清白蛋白酶解液混合液的配制過(guò)程如下：將酶切所得的人免疫球蛋白酶解液和牛血清白蛋白酶解液分別用富集緩沖液(無(wú)水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)溶解成濃度為1μg/μl的溶液，按體積比1：100配置成人免疫球蛋白酶解液和牛血清白蛋白酶解液混合液(igg:bsa1:100,w/w,1μg/μl)。

實(shí)施例1、制備表面聚合離子液體修飾的磁性納米材料并對(duì)糖肽進(jìn)行富集和檢測(cè)

一、制備表面聚合離子液體的磁性納米材料

按照?qǐng)D1所示合成路線示意圖制備表面聚合離子液體修飾的磁性納米材料，具體步驟如下：

步驟1：制備二氧化硅包覆的磁性納米顆粒

將200mg磁性納米顆粒(γ-fe3o4,粒徑150～200nm)超聲分散在200ml乙醇、50ml水和1.5ml濃氨水(28wt％)的混合液中，室溫下機(jī)械攪拌30min，逐滴加入0.5ml正硅酸乙酯(teos)，繼續(xù)攪拌反應(yīng)12h。所得產(chǎn)物(fe3o4@sio2)分別用乙醇和水清洗3次。

步驟2：采用mps在二氧化硅包覆的磁性納米顆粒表面修飾碳碳雙鍵

將步驟1所得產(chǎn)物用異丙醇清洗3次后，超聲分散于50ml異丙醇中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)條件下，逐滴加入1ml3-(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯(mps)，室溫下機(jī)械攪拌過(guò)夜，所得顆粒(fe3o4@mps)用乙醇清洗3次。所得顆粒(fe3o4@mps)的透射電鏡圖和掃描電鏡圖如圖2所示。

步驟3：在修飾有碳碳雙鍵的二氧化硅包覆的磁性納米顆粒的表面聚合離子液體

取60mg步驟2所得顆粒用無(wú)水乙腈清洗3次，超聲分散于50ml無(wú)水乙腈中，加入200μl親水性離子液體(甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨)，200mgn,n’-亞甲基雙丙烯酰胺和5mg偶氮二異丁腈，超聲混勻后置于95℃油浴鍋，30min內(nèi)加熱至沸騰狀態(tài)，反應(yīng)持續(xù)1.5h后終止，所得產(chǎn)物(fe3o4@mps@pmac)依次用乙醇和水清洗3次。所得產(chǎn)物(fe3o4@mps@pmac)的透射電鏡圖和掃描電鏡圖如圖2所示。

上述制備得到的表面聚合離子液體的磁性納米材料的結(jié)構(gòu)式如下：

式ⅰ中，●表示外層包覆二氧化硅層的磁性納米顆粒；n為10～100之間的正整數(shù)。

二、采用上述表面聚合離子液體的磁性納米材料對(duì)糖肽進(jìn)行富集和檢測(cè)

(1)表面聚合離子液體的磁性納米材料對(duì)糖肽富集

按照?qǐng)D3所示流程圖對(duì)糖肽進(jìn)行富集和檢測(cè)，具體步驟如下：

步驟1：稱取表面聚合離子液體修飾的磁性納米材料1mg，超聲分散于1ml富集緩沖液(無(wú)水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)中，然后吸取20μl上述懸濁液，通過(guò)外加磁場(chǎng)分離磁性納米顆粒，并用富集緩沖液(無(wú)水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)清洗3次。

步驟2：將上述磁性納米顆粒(20μg)重懸于50μl富集緩沖液(無(wú)水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)中，向其中加入1μl(1mmol/ml)人免疫球蛋白酶解液，室溫下震蕩混合30min，然后在外加磁場(chǎng)作用下，分離磁性納米顆粒，并用200μl富集緩沖液(無(wú)水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)充分洗滌3次，將所得磁性納米顆粒分散于20μl洗脫液(無(wú)水乙腈/水/三氟乙酸,30:69.9:0.1,v/v/v)中，室溫下震蕩孵育(1500rpm)10min，通過(guò)外加磁場(chǎng)分離磁性納米顆粒，取適量(1μl)收集的洗脫液滴加于maldi靶盤(pán)上，待其充分揮發(fā)后，滴加適量dhb基質(zhì)(2,5-二羥基苯甲酸，含1％磷酸，溶于80％乙腈中)，揮發(fā)結(jié)晶后，進(jìn)行maldi-tofms分析。

通過(guò)對(duì)比富集前人免疫球蛋白酶解液與富集后洗脫液的ms結(jié)果，表明該材料對(duì)人免疫球蛋白酶解液中糖基化肽段有特異性的富集效果。未富集時(shí)，在人免疫球蛋白酶解液的maldi質(zhì)譜圖上，僅能鑒定到4條糖基化肽段，并且在分子量范圍1000～2000內(nèi)有大量的高豐度非糖基化肽段信號(hào)，而經(jīng)過(guò)材料富集人免疫球蛋白酶解液的maldi質(zhì)譜圖中，可以鑒定出27條糖基化肽段，同時(shí)1000～2000分子量范圍內(nèi)的非糖基化肽段被去除。此結(jié)果表明所制備的磁性納米顆粒對(duì)于糖基化肽段有著良好的富集作用(圖4)。

實(shí)施例2、表面聚合離子液體的磁性納米材料對(duì)糖肽富集靈敏度檢測(cè)

稱取表面聚合離子液體的磁性納米材料1mg，超聲分散于1ml富集緩沖液(無(wú)水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)中，然后吸取20μl上述懸濁液，通過(guò)外加磁場(chǎng)分離磁性納米顆粒，并用富集緩沖液(無(wú)水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)清洗3次。

將上述磁性納米顆粒(20μg)重懸于50μl富集緩沖液(無(wú)水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)中，向其中加入1μl(50pmol/ml或10pmol/ml)人免疫球蛋白酶解液，室溫下震蕩混合30min，然后在外加磁場(chǎng)作用下，分離磁性納米顆粒，并用200μl富集緩沖液(無(wú)水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)充分洗滌3次，將所得磁性納米顆粒分散于20μl洗脫液(無(wú)水乙腈/水/三氟乙酸,30:69.9:0.1,v/v/v)中，室溫下震蕩孵育10min，通過(guò)外加磁場(chǎng)分離磁性納米顆粒，取適量(1μl)收集的洗脫液滴加于maldi靶盤(pán)上，待其充分揮發(fā)后，滴加適量dhb基質(zhì)(2,5-二羥基苯甲酸，含1％磷酸，溶于80％乙腈中)，揮發(fā)結(jié)晶后，進(jìn)行maldi-tofms分析。

通過(guò)對(duì)低豐度人免疫球蛋白酶解液進(jìn)行富集，結(jié)果表明該材料對(duì)人免疫球蛋白酶解液中糖基化肽段有高靈敏度的富集效果。經(jīng)過(guò)材料富集后，50fmol人免疫球蛋白酶解液的maldi質(zhì)譜圖中可以鑒定出20條糖基化肽段，當(dāng)人免疫球蛋白酶解液濃度進(jìn)一步降低至10fmol時(shí)，仍可以從其maldi質(zhì)譜圖中鑒定到8條糖基化肽段。結(jié)果如圖5所示，表明所制備的磁性納米顆?？梢詫?duì)于糖基化肽段實(shí)現(xiàn)高靈敏度富集。

實(shí)施例3、表面聚合離子液體的磁性納米材料對(duì)糖肽富集選擇性檢測(cè)

稱取表面聚合離子液體的磁性納米材料1mg，超聲分散于1ml富集緩沖液(無(wú)水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)中，然后吸取20μl上述懸濁液，通過(guò)外加磁場(chǎng)分離磁性納米顆粒，并用富集緩沖液(無(wú)水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)清洗3次。

將上述磁性納米顆粒(20μg)重懸于50μl富集緩沖液(無(wú)水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)中，向其中加入1μl人免疫球蛋白酶解液和牛血清白蛋白酶解液混合液(igg:bsa1:100,w/w,1μg/μl)，室溫下震蕩混合30min，然后在外加磁場(chǎng)作用下，分離磁性納米顆粒，并用200μl富集緩沖液(無(wú)水乙腈/水/三氟乙酸,88:11.9:0.1,v/v/v)充分洗滌3次，將所得磁性納米顆粒分散于20μl洗脫液(無(wú)水乙腈/水/三氟乙酸,30:69.9:0.1,v/v/v)中，室溫下震蕩孵育10min，通過(guò)外加磁場(chǎng)分離磁性納米顆粒，取適量(1μl)收集的洗脫液滴加于maldi靶盤(pán)上，待其充分揮發(fā)后，滴加適量dhb基質(zhì)(2,5-二羥基苯甲酸，含1％磷酸，溶于80％乙腈中)，揮發(fā)結(jié)晶后，進(jìn)行maldi-tofms分析。

通過(guò)比對(duì)富集前后人免疫球蛋白酶解液與牛血清白蛋白酶解液混合液結(jié)果，表明該材料對(duì)糖基化肽段有高選擇性的富集效果。由于牛血清白蛋白中不含糖基化位點(diǎn)，未富集時(shí)，受高豐度的牛血清白蛋白酶解產(chǎn)物的信號(hào)干擾，在混合酶解液的maldi質(zhì)譜圖上，無(wú)法鑒定到糖基化肽段，并且在分子量范圍1000～2000內(nèi)有大量的高豐度非糖基化肽段信號(hào)，而經(jīng)過(guò)材料富集混合酶解液的maldi質(zhì)譜圖中，可以鑒定出10條糖基化肽段，同時(shí)1000～2000分子量范圍內(nèi)的非糖基化肽段被去除。此結(jié)果(圖6)表明所制備的磁性納米顆粒對(duì)于糖基化肽段有著高選擇性的富集效果。