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      苯硼酸修飾硅膠功能色譜填料、制備方法與應(yīng)用與流程

      文檔序號:11369990閱讀:1401來源:國知局
      苯硼酸修飾硅膠功能色譜填料、制備方法與應(yīng)用與流程

      本發(fā)明涉及色譜分離分析領(lǐng)域,具體地說,是一種苯硼酸修飾硅膠功能色譜填料的制備方法與應(yīng)用。



      背景技術(shù):

      苯硼酸及其衍生物基團(tuán)在堿性水溶液中可以與具有1,2-或1,3-二醇基團(tuán)的多羥基化合物形成可逆的五元或六元環(huán)酯,且這個(gè)過程是可逆的[springsteeng.etal,tetrahedron,2002,58,5291-5300]。自然界中有大量的多羥基化合物,例如多糖等物質(zhì),它們許多存在于生物體內(nèi),并且對于生物體的生命活動(dòng)有著重要影響。因此,苯硼酸及其衍生物修飾的功能材料對于生物體中這些化合物的檢測、分離與提純有著重要的研究意義[xud.etal,chem.ind.eng.prog.2006,25,1045-1048]。

      糖鏈的單糖部分通常具有順式鄰二醇結(jié)構(gòu),因而可以利用與苯硼酸基團(tuán)的可逆反應(yīng)來富集糖蛋白或糖肽。且無論是n-糖蛋白還是o-糖蛋白,只要糖鏈中具有順式鄰二醇結(jié)構(gòu),就可以被成功富集。因此,硼酸親和色譜法被廣泛應(yīng)用于糖蛋白及糖肽的選擇性富集,具有避免糖鏈結(jié)構(gòu)遭到破壞且富集產(chǎn)物與質(zhì)譜兼容的優(yōu)勢,使得苯硼酸修飾的親和色譜材料在糖蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域也受到了越來越多的關(guān)注與發(fā)展[xuy.etal,anal.chem.2008,81,503-508]。將苯硼酸及其衍生物作為硅膠修飾相引入色譜固定相及填料領(lǐng)域,不僅能作為性能優(yōu)越的糖肽富集材料,同時(shí)苯硼酸的引入,使得硅膠表面具有一定的疏水作用力,也適合于弱極性及中極性樣品的分離分析。

      作為無重金屬催化的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)之一,巰基-烯烴點(diǎn)擊反應(yīng)的官能團(tuán)簡單且底物種類豐富,具有高選擇性、高產(chǎn)率、反應(yīng)條件溫和等特征。相較于涉及復(fù)雜的反應(yīng)官能團(tuán)和較大的連接單元的點(diǎn)擊反應(yīng),如疊氮-活性炔烴環(huán)加成反應(yīng)等,巰基-烯烴點(diǎn)擊反應(yīng)被認(rèn)為是“點(diǎn)擊化學(xué)”很好的候選反應(yīng),近年來在小分子、聚合物和材料科學(xué)領(lǐng)域均得到了廣泛的應(yīng)用[hoylec.e.etal,chem.soc.rev.2010,39,1355-1387]。目前,基于巰基-烯烴點(diǎn)擊反應(yīng)的苯硼酸修飾硅膠功能色譜材料尚未見報(bào)道,這類色譜材料的成功制備將為開發(fā)新材料提供思路,進(jìn)一步拓展了以硅膠為基質(zhì)的功能色譜填料的范疇,同時(shí)也為糖蛋白質(zhì)組學(xué)中糖肽的選擇性富集提供更為豐富的技術(shù)手段。



      技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

      因此,本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是,提供一種新型混合模式的高效液相色譜填料。本發(fā)明要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是,提供該色譜填料的制備方法,以及該色譜填料的應(yīng)用。

      本發(fā)明的技術(shù)方案是:

      一種苯硼酸修飾硅膠功能色譜填料,以硅膠為基質(zhì),鍵合相末端為苯硼酸官能團(tuán),其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為:

      其中silicagel為球型硅膠,r1是苯硼酸衍生物,r2是乙烯基或巰基,r3為聯(lián)合修飾改性基團(tuán),n=0~4,m=0~3。

      該色譜填料為鍵合相末端為苯硼酸官能團(tuán)的功能色譜填料。

      優(yōu)選的是,所述球型硅膠粒徑1~20μm,孔徑

      本發(fā)明的苯硼酸修飾硅膠功能色譜填料是硅膠基礎(chǔ)上修飾后的材料,是一種新型的色譜填料。苯硼酸衍生物是指以苯硼酸基團(tuán)為核心的化合物。如3-乙烯基苯硼酸、4-巰基苯硼酸等。

      r3是指含有巰基的多肽或蛋白質(zhì)等,如半胱氨酸、谷胱甘肽等。聯(lián)合修飾改性基團(tuán)是指引入聯(lián)合修飾改性劑以后引入的基團(tuán),聯(lián)合改性劑選自半胱氨酸、谷胱甘肽、含有巰基的多肽或含有巰基的蛋白質(zhì)中的一種。

      本發(fā)明還提供了上述苯硼酸修飾硅膠功能色譜填料的制備方法,其具體步驟為:

      (1)硅膠預(yù)處理

      將每克球型硅膠加入2~100ml質(zhì)量濃度為1~40%的鹽酸或硝酸溶液中,加熱回流攪拌1~48小時(shí),過濾,水洗至中性,于100~160℃下干燥至恒重,得到活化硅膠;

      (2)硅膠表面修飾

      將步驟(1)所得的活化硅膠置于反應(yīng)容器中,在氮?dú)夥諊录尤胗袡C(jī)溶劑,每克活化硅膠使用2~100ml有機(jī)溶劑,攪拌均勻,滴加硅烷試劑,保持溫度為20~200℃條件下攪拌2~48小時(shí);待反應(yīng)體系冷卻至室溫,減壓過濾并依次用甲苯、丙酮、甲醇、水、甲醇洗滌,所得固體產(chǎn)品在60~100℃條件下干燥12~36小時(shí),得到硅膠表面修飾的產(chǎn)品;

      (3)巰基-烯烴點(diǎn)擊反應(yīng)

      將步驟(2)所得硅膠表面修飾的產(chǎn)品置于反應(yīng)容器中,在氮?dú)夥諊录尤胗袡C(jī)溶劑,攪拌均勻,加入苯硼酸衍生物,每克烯基或巰基硅膠使用0.01~100mmol的苯硼酸衍生物,攪拌均勻,再加入偶氮類引發(fā)劑,保持溫度為20~200℃條件下攪拌2~48小時(shí);待反應(yīng)體系冷卻至室溫,減壓過濾并依次用甲苯、丙酮、甲醇、水、甲醇洗滌,所得固體產(chǎn)品在60~100℃條件下干燥12~36小時(shí),得到苯硼酸修飾硅膠功能色譜填料。

      洗滌中選用參與反應(yīng)的兩種極性差異較大的的溶劑進(jìn)行洗滌,如醇和水交替洗滌,以確保把各種極性的殘留雜質(zhì)洗掉,最后再用醇洗是起到偏于烘干的作用。

      上述反應(yīng)容器優(yōu)選為玻璃或者聚四氟乙烯反應(yīng)容器。

      根據(jù)本發(fā)明的苯硼酸修飾硅膠功能色譜填料的制備方法,優(yōu)選的是,在所述的步驟(2)中,所述的有機(jī)溶劑包括苯系物或者烷烴中的一種。

      更優(yōu)選的是,有機(jī)溶劑選自甲苯、乙苯、二甲苯、正己烷、正庚烷、正戊烷、正辛烷、環(huán)己烷中的一種。

      根據(jù)本發(fā)明的苯硼酸修飾硅膠功能色譜填料的制備方法,優(yōu)選的是,所述步驟(2)中,硅烷試劑結(jié)構(gòu)式為:

      其中,x為-och3,-och2ch3或-cl,n=0~4,r2為烯基或巰基;所述硅烷試劑的使用量為每克活化硅膠使用0.5~5mmol。

      根據(jù)本發(fā)明的苯硼酸修飾硅膠功能色譜填料的制備方法,優(yōu)選的是,步驟(3)所述的苯硼酸衍生物為含有烯基或巰基的苯硼酸衍生物。

      進(jìn)一步地,步驟(3)所述的苯硼酸衍生物選自2-乙烯基苯硼酸、3-乙烯基苯硼酸、4-乙烯基苯硼酸、4-巰基苯硼酸中的一種或者一種以上;所述的苯硼酸衍生物的使用量為每克烯基或巰基硅膠使用0.01~100mmol。

      根據(jù)本發(fā)明的苯硼酸修飾硅膠功能色譜填料的制備方法,優(yōu)選的是,步驟(3)中,在所述引發(fā)劑加入前,加入聯(lián)合修飾改性劑,攪拌均勻;所述聯(lián)合修飾改性劑為半胱氨酸、谷胱甘肽、含有巰基的多肽或蛋白質(zhì)中的一種。

      進(jìn)一步地,所述的聯(lián)合修飾改性劑的使用量為每克烯基或巰基硅膠使用0.01~100mmol。

      根據(jù)本發(fā)明的苯硼酸修飾硅膠功能色譜填料的制備方法,優(yōu)選的是,步驟(3)所述的偶氮類引發(fā)劑選自包括偶氮二異丁腈、偶氮二異庚腈、偶氮二異丁酸二甲酯、偶氮二異丁脒鹽酸鹽中的一種。

      根據(jù)本發(fā)明的苯硼酸修飾硅膠功能色譜填料的制備方法,優(yōu)選的是,步驟(3)所述的引發(fā)劑的使用量為每克烯基或巰基硅膠使用0.01~1mmol。

      本發(fā)明還提供了上述的苯硼酸修飾硅膠功能色譜填料在非極性化合物、極性化合物的分離和修飾蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用。

      與現(xiàn)有技術(shù)相比,本發(fā)明的有益效果是:

      1.結(jié)構(gòu)新穎。該色譜填料為鍵合相末端為苯硼酸官能團(tuán),具有一定的親水性、疏水性以及電荷響應(yīng)性。

      2.制備過程簡單可靠。具有產(chǎn)率高、重復(fù)性好、反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)。技術(shù)適用范圍廣,可利用聯(lián)合修飾改性基團(tuán)進(jìn)一步進(jìn)行修飾改性,對以硅膠為基質(zhì)的功能色譜填料及固定相的發(fā)展具有較大的促進(jìn)作用。

      3.應(yīng)用范圍廣。本發(fā)明提供的苯硼酸修飾硅膠功能色譜填料是一種全新的混合模式色譜填料及固定相,對非極性化合物、極性化合物都具有很好的分離選擇性,對糖肽具有很好的富集選擇性,在色譜分離和修飾蛋白質(zhì)組都有很廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

      附圖說明

      圖1為使用實(shí)施例1中的色譜填料的制備過程圖;

      圖2為使用實(shí)施例2中的色譜填料的制備過程圖;

      圖3為使用實(shí)施例3中的色譜填料的制備過程圖;

      圖4為使用實(shí)施例1中的色譜填料在不同ph條件的磷酸二氫鉀緩沖液中的ζ-電勢圖;

      圖5為使用實(shí)施例1中的色譜固定相用于反相混合樣品的分離分析色譜圖;

      圖6為使用實(shí)施例1中的色譜固定相用于核苷堿基混合樣品的分離分析色譜圖;

      圖7為使用實(shí)施例1中的色譜固定相用于皂苷樣品的分離分析趨勢圖;

      圖8為使用實(shí)施例1中的色譜填料用于富集人血清免疫球蛋白g的質(zhì)譜圖;

      圖9為使用實(shí)施例2中的色譜填料在不同ph條件的磷酸二氫鉀緩沖液中的ζ-電勢圖;

      圖10為使用實(shí)施例3中的色譜填料在不同ph條件的磷酸二氫鉀緩沖液中的ζ-電勢圖。

      具體實(shí)施方式

      下面結(jié)合實(shí)例,對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實(shí)例僅限于說明本發(fā)明,而非對本發(fā)明的限定。

      實(shí)施例1

      稱取5g球型硅膠(粒徑5μm,孔徑比表面300m2/g),置于250ml三頸燒瓶中,加入80ml濃度為2mol/l的鹽酸溶液,加熱回流12小時(shí),冷卻至室溫,用4#砂芯漏斗進(jìn)行抽濾,水洗至中性,抽干于80℃烘箱中干燥過夜,得活化硅膠。在通入干燥的氮?dú)獾臈l件下,往活化硅膠中加入50ml干燥的甲苯,攪拌均勻,然后滴加5.9mlγ-三乙氧基丙基巰基硅烷,110℃條件下加熱回流24小時(shí),反應(yīng)結(jié)束用4#砂芯漏斗進(jìn)行抽濾,依次用甲苯、丙酮、水、甲醇清洗,抽干于80℃烘箱中干燥過夜,得巰基硅膠。在通入干燥的氮?dú)獾臈l件下,稱取5g巰基硅膠,加入50ml無水甲醇,攪拌均勻,加入溶解于10mln,n-二甲基甲酰胺的3-乙烯基苯硼酸0.5g,攪拌均勻,加入溶解于5ml無水甲醇的2,2-偶氮二異丁腈0.1g,攪拌均勻,升溫至65℃,加熱回流48小時(shí),反應(yīng)體系冷卻至室溫,4#砂芯漏斗進(jìn)行抽濾,依次用水、甲醇清洗,抽干于80℃烘箱中干燥過夜,得苯硼酸修飾填料ⅰ,元素分析結(jié)果:c10.03%,n0%,h1.08%,制備過程如圖1所示。

      實(shí)施例2

      稱取5g球型硅膠(粒徑5μm,孔徑比表面300m2/g),置于250ml三頸燒瓶中,加入80ml濃度為2mol/l的鹽酸溶液,加熱回流12小時(shí),冷卻至室溫,用4#砂芯漏斗進(jìn)行抽濾,水洗至中性,抽干于80℃烘箱中干燥過夜,得活化硅膠。在通入干燥的氮?dú)獾臈l件下,往活化硅膠中加入50ml干燥的甲苯,攪拌均勻,然后滴加2.6ml乙烯基三氯硅烷,50℃條件下加熱回流24小時(shí),反應(yīng)結(jié)束用4#砂芯漏斗進(jìn)行抽濾,依次用甲苯、丙酮、水、甲醇清洗,抽干于60℃烘箱中干燥過夜,得乙烯基硅膠。在通入干燥的氮?dú)獾臈l件下,稱取5g乙烯基硅膠,加入50ml無水甲醇,攪拌均勻,加入溶解于10ml無水甲醇的4-巰基苯硼酸0.5g,攪拌均勻,加入溶解于5ml無水甲醇的2,2-偶氮二異丁腈0.1g,攪拌均勻,升溫至65℃,加熱回流48小時(shí),反應(yīng)體系冷卻至室溫,4#砂芯漏斗進(jìn)行抽濾,依次用水、甲醇清洗,抽干于80℃烘箱中干燥過夜,得苯硼酸修飾填料ⅱ,元素分析結(jié)果:c4.89%,n0%,h1.24%,制備過程如圖2所示。

      實(shí)施例3

      稱取3g實(shí)施例2中的材料苯硼酸修飾填料ⅱ,置于250ml三頸燒瓶中,加入50ml無水甲醇,攪拌均勻,加入溶解于5ml去離子水的半胱氨酸3g,攪拌均勻,加入溶解于5ml無水甲醇的2,2-偶氮二異丁腈0.06g,攪拌均勻,升溫至65℃,加熱回流48小時(shí),反應(yīng)體系冷卻至室溫,4#砂芯漏斗進(jìn)行抽濾,依次用水、甲醇清洗,抽干于80℃烘箱中干燥過夜,得苯硼酸修飾填料ⅲ,元素分析結(jié)果:c5.96%,n0.77%,h1.38%,制備過程如圖3所示。

      實(shí)施例4

      測定實(shí)施例1中材料苯硼酸修飾填料ⅰ在不同ph值條件下的ζ-電勢的變化趨勢。具體方法為:稱取50mg的實(shí)施例1中的材料,加入30ml的水超聲分散。取1ml上述溶液加入2ml不同ph條件下的磷酸二氫鉀緩沖液和7ml水,振蕩均勻,轉(zhuǎn)移至malvernzetasizernano-zs90測試儀測定材料表面的電勢變化。實(shí)施例1中的材料ζ-電勢隨ph條件變化的趨勢圖如圖4所示。

      實(shí)施例5

      將所得的實(shí)施例1中的材料苯硼酸修飾填料ⅰ填裝于4.6mm*150mm,i.d.的不銹鋼hplc色譜柱中。制得的色譜柱固定相用于測試其在反相色譜模式下對化合物的保留和分離能力。如圖5所示:(1)尿嘧啶,(2)硝基苯,(3)芴,(4)萘,4種化合物得到了良好的分離和較好的峰型。色譜條件為:以40%乙腈/水溶液為流動(dòng)相,流速為1.0ml/min,柱溫為30℃,紫外檢測波長為256nm。

      實(shí)施例6

      將所得的實(shí)施例1中的材料苯硼酸修飾填料ⅰ填裝于4.6mm*150mm,i.d.的不銹鋼hplc色譜柱中。制得的色譜柱固定相測試其在親水模式下對核苷堿基樣品的保留和分離能力。如圖6所示:(1)尿嘧啶,(2)尿苷,(3)胞嘧啶,(4)鳥苷,(5)胞苷,5種不同的核苷堿基樣品得到了很好的分離。色譜條件為:以90%乙腈/10mm的甲酸銨溶液(ph為3)為流動(dòng)相,流速為1.0ml/min,柱溫為30℃,紫外檢測波長為256nm。

      實(shí)施例7

      將所得的實(shí)施例1中的材料苯硼酸修飾填料ⅰ填裝于4.6mm*150mm,i.d.的不銹鋼hplc色譜柱中。制得的色譜柱固定相測試其在各乙腈/水溶液比例條件下對皂苷樣品的保留和分離能力。如圖7所示:(1)為柴胡皂苷a,(2)為柴胡皂苷d,(3)為人參皂苷rb1,(4)為人參皂苷rg1,(5)為商陸皂苷甲,(6)為三七皂苷r1,6種不同的皂苷樣品表現(xiàn)出u型保留趨勢,說明既有親水保留能力又有反相保留能力。色譜條件為:以乙腈/水溶液為流動(dòng)相,體積比分別為90:10;80:20;70:30;60:40;50:50;40:60;30:70,流速1.0ml/min,柱溫為30℃,紫外檢測波長為210nm。

      實(shí)施例8

      使用實(shí)施例1所制備的材料苯硼酸修飾填料ⅰ富集人血清免疫球蛋白g,上樣條件為水/甲酸:99.9/0.1(v/v),洗脫條件為乙腈/水/甲酸:40/59.9/0.1(v/v/v)。如圖8所示:(a)為蛋白酶解液未經(jīng)富集的質(zhì)譜圖,(b)為蛋白酶解液經(jīng)苯硼酸修飾填料ⅰ富集后的質(zhì)譜圖,糖肽信號以五角星表示。從圖中可知,經(jīng)過富集,糖肽的選擇性和豐度有了很大的提高,表現(xiàn)出很好的富集選擇性。

      實(shí)施例9

      測定實(shí)施例2中材料苯硼酸修飾填料ⅱ在不同ph值條件下的ζ-電勢的變化趨勢。具體方法為:稱取50mg的實(shí)施例1中的材料,加入30ml的水超聲分散。取1ml上述溶液加入2ml不同ph條件下的磷酸二氫鉀緩沖液和7ml水,振蕩均勻,轉(zhuǎn)移至malvernzetasizernano-zs90測試儀測定材料表面的電勢變化。實(shí)施例2中的材料ζ-電勢隨ph條件變化的趨勢圖如圖9所示。

      實(shí)施例10

      測定實(shí)施例3中材料苯硼酸修飾填料ⅲ在不同ph值條件下的ζ-電勢的變化趨勢。具體方法為:稱取50mg的實(shí)施例1中的材料,加入30ml的水超聲分散。取1ml上述溶液加入2ml不同ph條件下的磷酸二氫鉀緩沖液和7ml水,振蕩均勻,轉(zhuǎn)移至malvernzetasizernano-zs90測試儀測定材料表面的電勢變化。實(shí)施例3中的材料ζ-電勢隨ph條件變化的趨勢圖如圖10所示。

      以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式,應(yīng)當(dāng)指出,對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員,在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下,還可以做出若干改進(jìn)和潤飾,這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。

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