本發(fā)明公開一種pqq-da印跡磁性納米粒子的制備方法及其應(yīng)用，屬于生物分析技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

多巴胺（da）為腦內(nèi)一種重要的神經(jīng)傳遞質(zhì)，是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，參與許多生命過程，在控制認(rèn)知功能和行為功能中具有重要作用。腦內(nèi)da含量的改變與多種疾病的發(fā)生有關(guān)，如孤獨(dú)癥、帕金森病及精神分裂癥等。

吡咯并喹呤醌（pqq）是一種氧化還原酶輔基，主要分布于原核生物以及部分植物和哺乳動物之中。pqq在神經(jīng)系統(tǒng)方面具有極其重要的功能，在腦中能夠促進(jìn)神經(jīng)因子的產(chǎn)生對神經(jīng)細(xì)胞具有神經(jīng)保護(hù)作用，采用pqq缺損建立的大鼠模型顯示免疫功能及認(rèn)知功能下降，已有報道pqq對帕金森氏病具有防治作用。pqq在神經(jīng)系統(tǒng)方面的重要功能與其特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)，能夠與多種活性基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)。

pqq是否對多巴胺具有調(diào)節(jié)作用，至今無相關(guān)報道。我們發(fā)現(xiàn)pqq與da反應(yīng)生成化合物pqq-da，其對神經(jīng)系統(tǒng)是否具有保護(hù)作用，至今無相關(guān)研究。研究腦內(nèi)pqq-da的含量對pqq與多巴胺神經(jīng)遞質(zhì)的作用機(jī)制具有重要意義。腦內(nèi)pqq-da含量屬于痕量級，一般的分析方法難以檢測。常規(guī)固相萃取吸附劑特異選擇性不足，容易將其他干擾物與目標(biāo)物共同萃取下來。

pqq-da分子具有特殊結(jié)構(gòu)，多羥基和酰胺基帶電粒子。因此本發(fā)明以磁性fe304為內(nèi)核，四甲氧基硅烷、3-（異丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷對磁性納米粒子表面進(jìn)行包裹和修飾，將可聚合雙鍵引入硅膠微粒表面，在引發(fā)劑作用下，使甲基丙烯酸在硅膠表面實(shí)現(xiàn)接枝聚合，形成接枝微粒，增強(qiáng)了硅膠表面的活性，形成可以進(jìn)一步被多種有機(jī)官能團(tuán)修飾的分子印跡聚合層。在堿性條件下，交聯(lián)劑上的環(huán)氧與甲基丙烯酸大分子中的羧基發(fā)生開環(huán)反應(yīng)，甲基丙烯酸大分子被交聯(lián)，pqq-da分子被包裹在交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)中。洗去模板分子后，在硅膠表面的聚合物薄層中留下了大量可匹配的空穴。而且由于pqq-da上的酰氨基與接枝微粒表面的功能大分子之間存在著靜電相互作用與吸附作用，因而可以優(yōu)先吸附與洗脫。形成了pqq-da表面具有高識別性、高選擇性的磁性分子納米印跡材料。這種特異性的磁性納米粒子進(jìn)行分子印跡修飾后，對目標(biāo)物同時具有磁性及特異選擇性。對復(fù)雜基質(zhì)的腦組織中低濃度化合物的分離、凈化和富集具有很大的優(yōu)勢。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種pqq-da印跡磁性納米粒子的制備方法及其用于uplc-ms測定生物體內(nèi)pqq-da痕量分析。

建立了基于分子印跡固相萃取的uplc-ms，能檢測到小鼠腦內(nèi)痕量pqq-da的含量，檢測限達(dá)到0.2×10^-11mg/ml。對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和機(jī)理研究具有重要指導(dǎo)意義。

本發(fā)明的技術(shù)方案：

pqq-da分子結(jié)構(gòu)為：

一種pqq-da印跡磁性納米粒子的制備方法，步驟為：

（1）fe3o4磁性納米粒子的制備：

100ml1.25mmfeso4·7h2o在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下以800rpm的速度機(jī)械攪拌，用6mnaoh溶液調(diào)ph至10.0，1h后磁性沉淀物分離，用磁鐵吸附黑色fe3o4納米粒子，倒去上層液體，用二次蒸餾水及乙醇分別洗滌三次，再分散懸浮于乙醇溶液中得到5.0mg/ml的納米fe3o4溶液；

（2）磁性fe3o4包裹sio2的制備：

將50ml制備得到的fe3o4懸浮液中加入5ml氨水，5ml二次蒸餾水，10ml含1mm四甲氧基硅烷，60℃800rpm速率機(jī)械攪拌10h；加入200μl3-（異丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷分散于50ml10%的醋酸水溶液中，繼續(xù)攪拌5h，用二次蒸餾水洗滌，得到磁性fe3o4/sio2納米粒子；

（3）pqq-da印跡磁性納米粒子的制備：

取0.46gpqq-da加入30ml含0.2m甲基丙烯酸乙二醇酯溶液，超聲混合30min，n2保護(hù)下滴加5.0g乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.02g偶氮二異丁腈，加入0.25g磁性fe3o4/sio2納米粒子，超聲30min；將此混合液60℃下反應(yīng)24h，得pqq-da印跡磁性納米粒子。

非印跡磁性納米粒子的制備除了不加模板分子pqq-da外，其他步驟和印跡磁性納米粒子相同。

用（v/v為5/1）乙醇-甲酸混合液洗滌三次，再用二次蒸餾水洗滌三次，用外部磁場分離出磁性納米粒子，真空干燥，分別得到磁性印跡聚合物及磁性非印跡聚合物。

（4）采用掃描電鏡觀察分子印跡聚合物表面，用紅外光譜對分子印跡聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

圖1磁性納米粒子掃描電子顯微鏡顯示，顆粒大小分布均勻，大致呈圓形，粒徑約10nm，基本滿足超順磁性顆粒的要求。圖2為接枝pqq-da印跡層后的電子掃描顯微鏡圖，粒徑約130nm。顆粒表面呈現(xiàn)粗糙多孔的特性，適合與目標(biāo)分子的釋放與結(jié)合，孔隙結(jié)構(gòu)的厚度小于50nm，適用于模板分子轉(zhuǎn)移，能夠在很短的時間內(nèi)達(dá)到萃取平衡。

圖3（a-c）為非印跡磁性納米粒子、印跡磁性納米粒子洗脫前后紅外光譜圖。與曲線a相比較，曲線b中3444cm^-1處的-oh伸縮振動峰的紅外強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，pqq-da中含豐富的-oh，1690cm-1和1650cm^-1出現(xiàn)酰胺特征峰，2935、2855cm^-1酰胺基在無機(jī)雜化涂層出現(xiàn)位移。合成的印跡磁性納米粒子中含pqq-da特征峰。曲線a和曲線c的峰形和強(qiáng)度基本一致,說明pqq-da能夠從印跡磁性納米粒子吸附中較好地洗脫出來，留下可以進(jìn)行分子識別的空穴。

（5）吸附實(shí)驗(yàn)

吸附熱力學(xué)特性：移取5ml濃度分別為0.02、0.2、0.8、1.0、2.0、及4.0mg／ml的pqq-da溶液，分別置于錐形瓶中；分別稱取15mg的磁性印跡聚合物和磁性非印跡聚合物，分散于不同濃度的pqq-da溶液中，15℃水浴恒溫振蕩10h后用磁鐵將粒子吸在底部，uplc-ms測定上清液中的pqq-da量；以印跡磁性納米粒子的吸附容量對pqq-da的初始濃度作圖，繪制等溫吸附線。

吸附容量(q)為每單位質(zhì)量(g)納米粒子吸附目標(biāo)分子的質(zhì)量，吸附容量由其在振蕩吸附前后pqq-da的濃度差值得到，公式為q=（c0-ci）v／m。c0為pqq-da的初始濃度（mg／ml），ci是震蕩后上清液中pqq-da的濃度（mg／ml），v是溶液的體積（ml），m是粒子的質(zhì)量（mg）。由吸附等溫線上可見，低濃度時印跡粒子的吸附容量隨pqq-da濃度的增大而增加，在2mg／ml時達(dá)到飽和吸附，飽和吸附容量為113.8mg／g。而在相同條件下非印跡粒子的飽和吸附量僅為50.2mg／g，印跡粒子飽和吸附量是非印跡粒子的2.3倍。

（6）印跡磁性納米粒子用量對回收率的影響

吸附劑用量對目標(biāo)物的回收率具有重要影響，粒子用量不夠，不能完全吸附目標(biāo)物；粒子用量過多，雖可確保目標(biāo)物被充分吸附，但會影響洗脫，導(dǎo)致提取效率降低；我們研究了不同磁性納米分子印跡粒子用量（2.5、5、10、15、20、25mg）對pqq-da回收效率的影響，結(jié)果如圖5。當(dāng)使用10mg印跡磁性納米粒子時，回收率可達(dá)到93.5％，繼續(xù)增大印跡磁性納米粒子用量，回收率反而下降。

（7）脫附時間的影響

脫附時間對回收率有著很大的影響，為了獲得最佳脫附時間，我們將吸附飽和的印跡磁性納米粒子分散于2ml乙醇／甲酸溶液中，置于搖床中振蕩洗脫，考察不同振蕩洗脫時間（5、10、15、20、30、40min）的回收率。如圖6所示，隨著洗脫時間的增大，回收率也逐漸增大，洗脫20min回收率達(dá)到93.6％，洗脫達(dá)到平衡，在實(shí)際樣品分析時選擇20min為最佳洗脫時間。

用所述方法制備的pqq-da印跡磁性納米粒子用于uplc-ms測定生物體內(nèi)pqq-da痕量分析的方法，即組織樣品測定，步驟為：

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

稱取pqq-da，用二次蒸餾水配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/ml溶液，分別取20mg印跡磁性納米粒子分散于250ml上述標(biāo)準(zhǔn)溶液中；15℃振蕩吸附1h后，磁鐵置于燒杯底部將印跡磁性納米粒子吸住，棄除上清液；印跡磁性納米粒子用去離子水洗滌后，重新分散在5ml乙醇-甲酸（v/v為6/1）混合溶液中。分散液超聲10min后，粒子用磁鐵吸至燒杯底部，取上清液稀釋，進(jìn)行uplc-ms分析。用積分面積對濃度作圖，得回歸方程為y=1205519606x+259487（r²=0.9966），x為濃度c（mg/ml），y為積分面積，檢測限達(dá)到0.2×10^-11mg/ml。

（2）腦組織處理

腦組織稱重，加組織裂解液（腦組織重量/裂解液=1g/1.5ml）勻漿，4℃14000rpm離心15min，上清液取出再離心15min，取出上清液，加入等體積的蛋白沉淀劑，4℃冰浴放置10min后，4℃14000rpm離心15min，得含目標(biāo)物的上清液備用。

（3）磁性納米分子印跡處理

取20mg印跡磁性納米粒子分散于250ml步驟（2）處理過的組織樣品處理液中。15℃振蕩吸附1h后，磁鐵置于燒杯底部將印跡磁性納米粒子吸住，棄除上清液；印跡磁性納米粒子用去離子水洗滌后，重新分散在5ml乙醇-甲酸（v/v為6/1）混合溶液中。分散液超聲10min后，粒子用磁鐵吸至燒杯底部，取上清液，氮?dú)獯蹈?，待用?/p>

（4）腦組織pqq-da的含量測定

uplc-ms條件：柱子1.7μm2.1×100mm，檢測器sqdetctor，梯度洗脫0～10min95/5水/甲醇～30/70水/甲醇。

ms圖譜確認(rèn)466m+為pqq-da分子離子峰。色譜峰積分面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出pqq-da含量c（mg/ml）。腦組織pqq-da含量=c(mg/ml)×v(進(jìn)樣體積)/m(腦組織重量)。計(jì)算得到正常小鼠腦組織中pqq-da含量為0.25±0.006ng/mg，pqq缺損模型鼠中未檢測到pqq-da，連續(xù)口服pqq1mg/ml6周后小鼠腦組織pqq-da含量為1.09±0.012ng/mg。

（5）腦組織樣本中pqq-da異構(gòu)體分離

采用本法制備的具有特定識別性能的分子印跡聚合物pqq-da-fe3o4/sio2，用作uplc固定相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)466分子離子峰的異構(gòu)體得到較好的分離。推測pqq的鄰位羧基發(fā)生了反應(yīng)，為進(jìn)一步研究提供了極有價值的信息。

本發(fā)明的有益效果：建立了基于分子印跡固相萃取的uplc-ms，能檢測到小鼠腦內(nèi)痕量pqq-da的含量，檢測限達(dá)到0.2×10^-11mg/ml。對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生和機(jī)理研究具有重要指導(dǎo)意義。

附圖說明

圖1fe3o4/sio2磁性納米粒子掃描電子顯微鏡圖。

圖2pqq-da-fe3o4/sio2印跡磁性納米粒子掃描電子顯微鏡圖。

圖3為非印跡磁性納米粒子、印跡磁性納米粒子洗脫前后紅外光譜圖。

a、非印跡磁性納米粒子紅外光譜圖，b、印跡磁性納米粒子洗脫前紅外光譜圖，c、印跡磁性納米粒子洗脫后紅外光譜圖。

圖4pqq在磁性印跡聚合物和磁性非印跡聚合物上的吸附等溫線。

圖5pqq-da在不同劑量磁性印跡聚合物上的回收率。

圖6脫附時間對pqq-da回收率的影響。

圖7pqq-da標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖8pqq-da質(zhì)譜圖。

圖9對照品pqq-da色譜圖。

圖10腦組織樣本中pqq-da異構(gòu)體在分子印跡聚合物pqq-da-fe3o4/sio2印跡固定相上的分離色譜圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1制備pqq-da印跡磁性納米粒子，步驟為：

（1）fe3o4磁性納米粒子的制備：

100ml1.25mmfeso4·7h2o在氮?dú)獾谋Ｗo(hù)下以800rpm的速度機(jī)械攪拌，用6mnaoh溶液調(diào)ph至10.0，1h后磁性沉淀物分離，用磁鐵吸附黑色fe3o4納米粒子，倒去上層液體，用二次蒸餾水及乙醇分別洗滌三次，再分散懸浮于乙醇溶液中得到5.0g/l的納米fe3o4溶液。

（2）磁性fe3o4包裹sio2的制備

將50ml制備得到的fe3o4懸浮液中加入5ml氨水，5ml二次蒸餾水，10ml含1mm四甲氧基硅烷，60℃800rpm速率機(jī)械攪拌10h；加入200μl3-（異丁烯酰氧）丙基三甲氧基硅烷分散于50ml10%的醋酸水溶液中，繼續(xù)攪拌5h，用二次蒸餾水洗滌，得到磁性fe3o4/sio2納米粒子。

（3）pqq-da印跡磁性納米粒子的制備：

取0.46gpqq-da加入30ml含0.2m甲基丙烯酸乙二醇酯溶液，超聲混合30min，n2保護(hù)下滴加5.0g乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.02g偶氮二異丁腈,加入0.25g磁性fe3o4/sio2納米粒子，超聲30min。將此混合液60℃下反應(yīng)24h。非印跡聚合物的制備除了不加模板分子pqq-da外，其他步驟和印跡聚合物相同。

用（v/v為,5/1）乙醇-甲酸混合液洗滌三次，再用二次蒸餾水洗滌三次，用外部磁場分離出聚合物，真空干燥，得到印跡聚合物和非印跡聚合物。

（4）采用掃描電鏡觀察分子印跡聚合物表面，用紅外光譜對分子印跡聚合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

圖1磁性納米粒子掃描電子顯微鏡顯示，顆粒大小分布均勻，大致呈圓形，粒徑約10nm，基本滿足超順磁性顆粒的要求。圖2為接枝pqq-da印跡層后的電子掃描顯微鏡圖，粒徑約130nm。顆粒表面呈現(xiàn)粗糙多孔的特性，適合與目標(biāo)分子的釋放與結(jié)合，孔隙結(jié)構(gòu)的厚度小于50nm，適用于模板分子轉(zhuǎn)移，能夠在很短的時間內(nèi)達(dá)到萃取平衡。

圖3（a～c）為非印跡磁性納米粒子、印跡磁性納米粒子洗脫前后紅外光譜圖。與曲線a相比較，曲線b中3444cm^-1處的-oh伸縮振動峰的紅外強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，pqq-da中含豐富的-oh，1690cm^-1和1650cm^-1出現(xiàn)酰胺特征峰,2935、2855cm^-1酰胺基在無機(jī)雜化涂層出現(xiàn)位移。合成的印跡磁性納米粒子中含pqq-da特征峰。曲線a和曲線c的峰形和強(qiáng)度基本一致,說明pqq-da能夠從印跡磁性納米粒子吸附中較好地洗脫出來，留下可以進(jìn)行分子識別的空穴。

（5）吸附實(shí)驗(yàn)

吸附熱力學(xué)特性：移取5ml濃度分別為0.02、0.2、0.8、1.0、2.0、及4.0mg／ml的pqq-da溶液，分別置于錐形瓶中。分別稱取15mg的磁性印跡聚合物和磁性非印跡聚合物，分散于不同濃度的pqq-da溶液中。15℃水浴恒溫振蕩10h后用磁鐵將粒子吸在底部，uplc-ms測定上清液中的pqq-da量；以納米粒子的吸附容量對pqq-da的初始濃度作圖，繪制等溫吸附線，如圖4。

吸附容量（q）為每單位質(zhì)量（g）納米粒子吸附目標(biāo)分子的質(zhì)量，吸附容量由其在振蕩吸附前后pqq-da的濃度差值得到，公式為q=（c0-ci）v／m。c0為pqq-da的初始濃度(mg／ml)，ci是震蕩后上清液中pqq-da的濃度(mg／ml)，v是溶液的體積（ml），m是粒子的質(zhì)量（mg）。由吸附等溫線上可見，低濃度時印跡粒子的吸附容量隨pqq-da濃度的增大而增加，在2mg／ml時達(dá)到飽和吸附，飽和吸附容量為113.8mg／g。而在相同條件下非印跡粒子的飽和吸附量僅為50.2mg／g，印跡粒子飽和吸附量是非印跡粒子的2.3倍。

（6）印跡磁性納米粒子用量對回收率的影響

吸附劑用量對目標(biāo)物的回收率具有重要影響，粒子用量不夠，不能完全吸附目標(biāo)物；粒子用量過多，雖可確保目標(biāo)物被充分吸附，但會影響洗脫，導(dǎo)致提取效率降低。我們研究了不同磁性納米分子印跡粒子用量（2.5、5、10、15、20、25mg）對pqq-da回收效率的影響，結(jié)果如圖5。當(dāng)使用10mg磁性納米分子印跡粒子時，回收率可達(dá)到93.5％，繼續(xù)增大磁性納米分子印跡粒子用量，回收率反而下降。

（7）脫附時間的影響

脫附時間對回收率有著很大的影響，為了獲得最佳脫附時間，我們將吸附飽和的印跡磁性納米粒子分散于2ml乙醇／甲酸溶液中，置于搖床中振蕩洗脫，考察不同振蕩洗脫時間（5、10、15、20、30、40min）的回收率。如圖6所示，隨著洗脫時間的增大，回收率也逐漸增大，洗脫20min回收率達(dá)到93.6％，洗脫達(dá)到平衡，在實(shí)際樣品分析時選擇20min為最佳洗脫時間。

實(shí)施例2組織樣品中pqq-da測定

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

稱取pqq-da，用二次蒸餾水配制成0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mg/ml溶液，分別取20mg印跡磁性納米粒子分散于250ml上述標(biāo)準(zhǔn)溶液中。15℃振蕩吸附1h后，磁鐵置于燒杯底部將印跡磁性納米粒子吸住，棄除上清液。印跡磁性納米粒子用去離子水洗滌后，重新分散在5ml乙醇-甲酸（v/v為6/1）混合溶液中。分散液超聲10min后，粒子用磁鐵吸至燒杯底部，取上清液稀釋，進(jìn)行uplc-ms分析。用積分面積對濃度作圖，得回歸方程為y=1205519606x+259487（r²=0.9966），x為濃度c（mg/ml），y為積分面積。檢測限達(dá)到0.2×10^-11mg/ml。

（2）腦組織處理

腦組織稱重，加組織裂解液（腦組織重量/裂解液=1g/1.5ml）勻漿，4℃14000rpm離心15min，上清液取出再離心15min，取出上清液，加入等體積的蛋白沉淀劑，4℃冰浴放置10min后，4℃14000rpm離心15min，得含目標(biāo)物的上清液備用。

（3）磁性納米分子印跡處理

取20mg印跡磁性納米粒子分散于250ml上述處理過的組織樣品處理液中。15℃振蕩吸附1h后，磁鐵置于燒杯底部將磁性分子印跡粒子吸住，棄除上清液。印跡磁性納米粒子用去離子水洗滌后，重新分散在5ml乙醇-甲酸（v/v為6/1）混合溶液中。分散液超聲10min后，粒子用磁鐵吸至燒杯底部，取上清液，氮?dú)獯蹈?，待用?/p>

（4）腦組織pqq-da的含量測定

uplc-ms條件：柱子1.7μm2.1×100mm，檢測器sqdetctor，梯度洗脫0～10min95/5水/甲醇～30/70水/甲醇。

ms圖譜確認(rèn)466m+為pqq-da分子離子峰。色譜峰積分面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出pqq-da含量c（mg/ml）。腦組織pqq-da含量=c(mg/ml)×v（進(jìn)樣體積）/m（腦組織重量）。計(jì)算得到正常小鼠腦組織中pqq-da含量為0.25±0.006ng/mg，pqq缺損模型鼠中未檢測到pqq-da，連續(xù)口服pqq1mg/ml6周后小鼠腦組織pqq-da含量為1.09±0.012ng/mg。

（5）腦組織樣本中pqq-da異構(gòu)體分離

采用本法制備的具有特定識別性能的分子印跡聚合物pqq-da-fe3o4/sio2，用作uplc固定相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)466分子離子峰的異構(gòu)體得到較好的分離。推測pqq的鄰位羧基發(fā)生了反應(yīng)。為進(jìn)一步研究提供了極有價值的信息。