本發(fā)明涉及核酸擴增檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種薄膜式核酸擴增微流控芯片及其制備方法。
背景技術(shù)：
：微流控芯片是以微機電加工技術(shù)為基礎(chǔ)，由微管路在芯片上形成網(wǎng)絡(luò)，以可控微流體貫穿整個系統(tǒng)并完成各種生物和化學(xué)過程的一種技術(shù)。在微流控芯片技術(shù)發(fā)展早期，蛋白免疫芯片是市場主流；近年來，隨著分子診斷市場的成熟，臨床醫(yī)院客戶和檢驗檢疫用戶均對核酸擴增微流控芯片提出了迫切需求。當(dāng)前的檢測用芯片有多種，如cn1996009b、cn101590389a、us6627159、us20050199500a1、us2004120856a1、us6919058b2、us20030166265a1、wo9533986a1。但這些芯片均不是專用核酸擴增微流控芯片，很難滿足臨床用戶需求。常見的核酸擴增方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)、鏈替代擴增（sda）、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（lcr）等，這些方法均涉及溫度循環(huán)或溫度控制，芯片需要能夠隨外部溫控模塊快速升降溫。如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)，其原理是先加熱使待測雙鏈dna解開螺旋得到模板dna，在退火溫度條件下，引物同模板dna進行雜交，在taqdna聚合酶、mg2+和合適的ph緩沖液等條件下延伸引物，重復(fù)“解螺旋→雜交→延伸→解螺旋”的循環(huán)過程，重復(fù)進行25-40個pcr循環(huán)，使待測樣品中的核酸拷貝數(shù)呈指數(shù)級擴大。其中，解螺旋、雜交、延伸階段均需要溫度控制，一個pcr循環(huán)就是一個溫度循環(huán)過程。這就要求了核酸擴增微流控芯片必須能夠快速地升降溫，完成pcr的溫度循環(huán)過程。為滿足臨床客戶對核酸擴增微流控芯片提出了溫控效率高的要求，需要盡量把芯片的厚度降低，方便外界的加熱裝置對芯片進行溫控。但是目前芯片的生產(chǎn)工藝主要利用注塑工藝，這種注塑工藝只能加工板式的、具備一定厚度的芯片，當(dāng)芯片的厚度降低到一定程度時，由于芯片具備通道、反應(yīng)池等復(fù)雜精細的結(jié)構(gòu)，注塑工藝無法對其進行精密加工。由于這種生產(chǎn)工藝的不足，始終無法生產(chǎn)大批量、生產(chǎn)成本低、具備精細結(jié)構(gòu)的薄膜式芯片。臨床上還對核酸擴增微流控芯片提出了以下要求：1、密封性好。在核酸擴增反應(yīng)期間（需承受100℃高溫）不能有變形或泄露，否則核酸試劑容易形成氣溶膠污染。2、生物兼容性好。核酸擴增使用的生物試劑通常包括引物、酶等成分，芯片材質(zhì)需要兼容這些成分，以確保擴增效率。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種薄膜式核酸擴增微流控芯片及其制備方法，提供一種溫控效率高、密封性好、生物兼容性好、生產(chǎn)工藝簡單高效的薄膜式核酸擴增微流控芯片。本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：一種薄膜式核酸擴增微流控芯片，包括依次貼合的底片、中間層和蓋片，所述中間層設(shè)有通道和反應(yīng)池，所述通道與反應(yīng)池連接，所述蓋片設(shè)有進口和出口，所述進口和出口均為通孔，所述進口、出口分別與所述通道連接，所述底片、中間層和蓋片均為薄膜，所述底片、中間層和蓋片均為高分子材料，所述高分子材料包括聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二酯、環(huán)烯烴類共聚物或熱塑性彈性體中的至少一種。采用這種薄膜式核酸擴增微流控芯片，由于其厚度小，因此可以通過外加的加熱裝置實現(xiàn)溫度的快速傳導(dǎo)，溫控效率高；由于其為三層薄膜的結(jié)構(gòu)，柔性好，在一定角度范圍內(nèi)可以能任意變形，因此可以被加工而不容易卷翹或斷裂，密封性好，使用時試劑不容易泄漏。核酸擴增反應(yīng)過程中使用的生物試劑通常包括引物、酶等成分，芯片材質(zhì)需要兼容這些成分，以確保擴增效率。采用上述技術(shù)方案，所述底片、中間層和蓋片可以是同一種高分子材料，也可以是不同的高分子材料，所述薄膜式核酸擴增微流控芯片為高分子材料，能使其與生物試劑兼容，生物兼容性良好。進一步的，所述中間層設(shè)有鏤空結(jié)構(gòu)，所述鏤空結(jié)構(gòu)包括所述通道和所述反應(yīng)池。由于鏤空結(jié)構(gòu)的上方和下方均為薄膜，薄膜的透明度高，在對底片、中間層和蓋片進行激光焊接時，薄膜較少吸收激光，因此通道和反應(yīng)池的內(nèi)表面在激光焊接后仍能保持光滑，保證后續(xù)核酸擴增反應(yīng)的進行。進一步的，所述中間層為熱塑性彈性體。對芯片進行激光焊接是一種簡單高效的生產(chǎn)工藝，但對于薄膜式的芯片，激光焊接的難點在于這三層薄膜貼合后，在薄膜之間很容易形成氣穴，氣穴不僅造成激光焊接強度不夠，而且容易形成不規(guī)則的燒痕，嚴(yán)重影響產(chǎn)品美觀。而采用熱塑性彈性體的中間層，由于具有彈性，薄膜之間在外界壓力下不會產(chǎn)生氣穴，避免了出現(xiàn)燒痕。氣穴是指由于貼合不緊密，在焊接后形成的塊狀缺陷，缺陷內(nèi)部包裹氣體。進一步的，所述底片和蓋片為環(huán)烯烴類共聚物。環(huán)烯烴類共聚物的一種高透明性的高分子材料，其光線透過率可達90%以上。由于鏤空結(jié)構(gòu)的上方和下方均為薄膜，薄膜的透明度高，而優(yōu)選為環(huán)烯烴類共聚物的透明度更高，在對底片、中間層和蓋片進行激光焊接時，薄膜極少吸收激光，因此通道和反應(yīng)池的內(nèi)表面在激光焊接后仍能保持光滑，保證后續(xù)核酸擴增反應(yīng)的進行。進一步的，所述中間層為黑色熱塑性彈性體，所述底片、蓋片均為透明環(huán)烯烴類共聚物。由于激光焊接要求芯片的某一層能夠吸收激光能量，一般采用兩種方式：第一種是采用摻雜炭黑的黑色材質(zhì)制成的中間層，或在中間層上涂覆吸光涂料。本發(fā)明采用黑色熱塑性彈性體是使用了第一種方式，優(yōu)點是不再需要涂覆工藝步驟；采用透明環(huán)烯烴類共聚物，其透明度更高，在激光焊接時候不容易吸收激光，減少了對激光對位精度的要求，提高了激光焊接效率效果。進一步的，所述底片的厚度為0.05~1mm，所述蓋片的厚度為0.05~1mm，所述中間層的厚度為0.2~2mm。采用此技術(shù)方案，所述薄膜式核酸擴增微流控芯片的溫控效率高，而且薄膜的底片和蓋片，中間層更加透明，不容易吸收激光，對生產(chǎn)工藝的要求難度低，材料易得。采用此技術(shù)方案，所述薄膜式核酸擴增微流控芯片的溫控效率高，滿足了大部分核酸擴增反應(yīng)檢測的需要。進一步的，所述通道或反應(yīng)池內(nèi)設(shè)有用于固態(tài)試劑，所述固態(tài)試劑包括干粉試劑和凝膠試劑。采用此技術(shù)方案，事先將反應(yīng)所需酶和引物加入到所述固態(tài)試劑中，使核酸擴增反應(yīng)的全過程不需要外加反應(yīng)物，保證了反應(yīng)的連續(xù)發(fā)生，提高檢測效率。本發(fā)明的另一個目的是提供一種薄膜式核酸擴增微流控芯片的制備方法，包括以下步驟：步驟s1，制備底片、蓋片和中間層，所述底片、蓋片和中間層均為薄膜；步驟s2，在所述中間層上切/削出通道和反應(yīng)池；步驟s3，在所述蓋片上加工出進口和出口；步驟s4，將所述底片、中間層和蓋片依次對位，使所述進口、出口分別與所述通道連接，使所述底片、中間層、蓋片貼合壓緊后進行封接；步驟s5，封接完成，獲得所述薄膜式核酸擴增微流控芯片?，F(xiàn)有技術(shù)中一般采用注塑工藝來生產(chǎn)芯片，當(dāng)使用注塑工藝加工精細結(jié)構(gòu)時，經(jīng)常出現(xiàn)低平面度、熔接痕、澆口斷裂等問題，很難達到設(shè)計要求；對于薄膜式芯片來說，其厚度很小，反應(yīng)池和通道的結(jié)構(gòu)非常精細，注塑工藝無法完成如此精細的結(jié)構(gòu)，使得薄膜式芯片的生產(chǎn)工藝成為一個難題。為避免注塑工藝產(chǎn)生的上述問題，本發(fā)明使用先切/削后封接的生產(chǎn)工藝：先在中間層切/削獲得切口平整、結(jié)構(gòu)精細的通道和反應(yīng)池；再將所述底片、中間層和蓋片封接貼合在一起。由于薄膜在一定角度范圍內(nèi)能任意變形，因此封接不容易卷翹或者斷裂，密封性好。采用上述先切/削后封接的技術(shù)方案，生產(chǎn)工藝簡單、高效，采用這種工藝生產(chǎn)的薄膜式核酸微流控芯片，厚度小，有利于提高溫控效率；切口平整；薄膜的柔性好，使得芯片邊緣被加工后不容易卷翹或者斷裂，密封性好。作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟s2中，所述切/削方式包括機器沖切、機加工、裁剪、激光切割的一種或多種方式；所述步驟s3中，所述加工方式包括沖切、機加工、裁剪、激光切割和注塑成型中的一種或多種方式；所述步驟s4中，所述封接方式包括激光焊接、熱壓封接、高強度化學(xué)膠粘接或超聲焊接中的一種或多種方式。采用此技術(shù)方案，可以根據(jù)工廠的設(shè)備情況，采用多種方式組合進行生產(chǎn)加工，如采用焊接的方式進行封接，可以提高封接效率。作為本發(fā)明的進一步改進，所述步驟s2中，所述切/削采用機器沖切方式；所述步驟s4中，先使所述底片、中間層、蓋片貼合壓緊，放入激光焊接設(shè)備中，再通過線激光掃描進行焊接，激光焊接時候不需掩膜。采用機器沖切的優(yōu)點是：沖切表面光滑、生產(chǎn)效率高、成本低。由于涉及核酸擴增反應(yīng)，通道或反應(yīng)池的側(cè)壁也盡量光滑，減少生物分子吸附，提高擴增效率。機器沖切使用沖床，切口光滑，符合需求。沖切工藝是機械加工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)工藝，工藝成熟度高，配套廠家多，批量生產(chǎn)成本很低，只需使用相應(yīng)的沖切模具，就能快速生產(chǎn)。采用激光焊接的方式，有利于提高焊接效率。采用熱塑性彈性體的中間層，其在激光焊接時的優(yōu)點是：激光焊接的難點在于薄膜對位后，在薄膜之間很容易形成氣穴，氣穴不僅造成激光焊接后強度不夠，而且形成不規(guī)則的燒痕，嚴(yán)重影響產(chǎn)品美觀。而采用彈性材料的中間層，由于具有彈性，薄膜之間在外界壓力下不會產(chǎn)生氣穴，避免了出現(xiàn)燒痕。采用環(huán)烯烴類共聚物的底片和蓋片，以及采用鏤空結(jié)構(gòu)的中間層，其在激光焊接時的優(yōu)點是：激光焊接時不再需要掩膜輔助。線掃描式激光焊接設(shè)備，通常需要金屬掩膜輔助，掩膜會保護通道或反應(yīng)池等流體區(qū)域，激光只焊接非保護區(qū)域。但是由于光學(xué)折射、機械定位等原因，掩膜的設(shè)計位置和芯片結(jié)構(gòu)位置很容易發(fā)生偏差，此時激光就會照射通道或反應(yīng)池等關(guān)鍵區(qū)域，造成反應(yīng)區(qū)域表面的粗糙化，極大影響了生物反應(yīng)效率。中間層設(shè)有鏤空結(jié)構(gòu)，由于鏤空結(jié)構(gòu)的上方和下方均為薄膜，薄膜的透明度高，而優(yōu)選為環(huán)烯烴類共聚物的透明度更高，因此在對底片、中間層和蓋片進行激光焊接時，薄膜極少吸收激光，使通道和反應(yīng)池的內(nèi)表面在激光焊接后仍能保持光滑，保證后續(xù)核酸擴增反應(yīng)的進行。本發(fā)明還提供了一種薄膜式核酸擴增微流控芯片的使用方法，包括當(dāng)單獨使用時，使用配套框架將所述薄膜式核酸擴增微流控芯片的兩側(cè)固定后使用；當(dāng)與提取芯片一起使用時，將所述薄膜式核酸擴增微流控芯片鑲嵌入提取芯片內(nèi)使用。核酸擴增檢測流程包含四大模塊：前處理-核酸提取-核酸擴增-檢測分析，因此如果將所述薄膜式核酸擴增微流控芯片與提取芯片結(jié)合使用，就能使核酸擴增檢測過程的芯片更加一體化、方便快速。盡管所述薄膜式核酸擴增微流控芯片是針對核酸應(yīng)用開發(fā)的，但也可用于免疫、細胞等應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，這種薄膜式核酸擴增微流控芯片及其制備方法的有益效果是：1、密封無泄漏，薄膜式的芯片結(jié)構(gòu)，并采用激光焊接的封接方式，封接面不卷翹或者斷裂，能確保核酸擴增反應(yīng)檢測過程中試劑無泄漏。2、溫控效率高，薄膜式核酸擴增微流控芯片，熱傳遞損耗小，升降溫速度快。3、生物兼容性，采用高分子材料，機器沖切加工后表面光滑，利于核酸擴增反應(yīng)的進行。4、生產(chǎn)工藝簡單高效，采用先機器沖切后激光焊接的加工方式，避免注塑工藝難點，無需精密加工設(shè)備，生產(chǎn)效率高；底片和中間層為環(huán)烯烴類共聚物，中間層為熱塑性彈性體，并采用鏤空結(jié)構(gòu)，這樣激光焊接無氣穴、無需掩膜輔助，生產(chǎn)合格率大大提高。5、適用性強，所述薄膜式核酸擴增微流控芯片既適合分子診斷應(yīng)用，也適合免疫檢測、細胞檢測等應(yīng)用。附圖說明圖1是一種薄膜式核酸擴增微流控芯片的俯視圖。圖2是一種薄膜式核酸擴增微流控芯片的正視圖。圖3是一種薄膜式核酸擴增微流控芯片的中間層的俯視圖。圖4是一種薄膜式核酸擴增微流控芯片的使用方法示意圖。圖5是一種薄膜式核酸擴增微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖。附圖說明：1-底片，2-中間層，21-通道，22-反應(yīng)池，3-蓋片，31-通孔。具體實施方式為了更清楚地說明本申請實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明進一步說明。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實施例中，芯片制作技術(shù)和使用方法均為微流控芯片領(lǐng)域和生物檢測領(lǐng)域的常規(guī)技術(shù)和方法。實施例1一種薄膜式核酸擴增微流控芯片，包括依次貼合的底片、中間層和蓋片，所述中間層設(shè)有通道和反應(yīng)池，所述通道與反應(yīng)池連接，所述蓋片設(shè)有進口和出口，所述進口和出口均為通孔，所述進口、出口分別與所述通道連接，所述底片、中間層和蓋片均為薄膜，所述底片、中間層和蓋片均為高分子材料，所述高分子材料包括聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚對苯二甲酸乙二酯、環(huán)烯烴類共聚物或熱塑性彈性體中的至少一種。進一步的，所述底片、中間層和蓋片可以是同一種高分子材料，也可以是不同的高分子材料。在實施例1中，薄膜的材質(zhì)也可以選自下述任意一種、任意幾種組成的復(fù)合體或任意幾種組成的混合體：金屬、玻璃、石英、硅、陶瓷、高分子化合物、橡膠和硅鋁酸鹽化合物。采用實施例1的薄膜式核酸擴增微流控芯片，其優(yōu)點是：1、溫控效率高，核酸擴增芯片由于涉及溫度循環(huán)，需要芯片盡量薄，降低芯片內(nèi)試劑與儀器溫控模塊的溫度差。薄膜芯片的底片、蓋片均能緊密貼合溫控模塊，溫控效率高，升降溫速度很快。2、密封性好，避免封接翹曲問題，常見的微流控芯片為板式，在封接時，封接之后的芯片經(jīng)常存在翹曲現(xiàn)象，翹曲會引發(fā)板式微流控芯片封接面斷裂，并導(dǎo)致試劑泄漏、流路中斷等問題。而采用薄膜式芯片，在一定角度范圍內(nèi)芯片能夠任意變形，封接牢固，不影響正常使用，這就大大降低了封接難度。3.生物兼容性好，核酸擴增反應(yīng)過程中使用的生物試劑通常包括引物、酶等成分，芯片材質(zhì)需要兼容這些成分，以確保擴增效率。上述的高分子材料能使該薄膜式核酸擴增微流控芯片與生物試劑兼容，生物兼容性良好。實施例2在實施例1的基礎(chǔ)上，進一步的，所述中間層設(shè)有鏤空結(jié)構(gòu)，所述鏤空結(jié)構(gòu)包括所述通道和所述反應(yīng)池。進一步的，所述底片和蓋片均為環(huán)烯烴類共聚物，優(yōu)選為透明環(huán)烯烴類共聚物。進一步的，所述中間層為熱塑性彈性體，優(yōu)選為黑色熱塑性彈性體。進一步的，所述底片的厚度為0.05~1mm，蓋片的厚度為0.05~1mm，中間層的厚度為0.2~2mm。實驗研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)灼蛏w片的厚度低于0.05mm時，材料不容易選擇，加工過程中也容易破損，厚度高于1mm時，在封接過程中較容易發(fā)生卷翹。當(dāng)中間層的厚度低于0.2mm時，中間層很難起到支撐作用；厚度高于2mm時，封接后的芯片過厚，溫控效率降低，也不利于使用和存放。經(jīng)過測試發(fā)現(xiàn)，在底片的厚度為0.05~1mm，蓋片的厚度為0.05~1mm，中間層的厚度為0.2~2mm時，此厚度的材料批量采購方便、適合批量加工，成品芯片厚度適中，不影響實際使用中的溫控效率，芯片保存也很方便。進一步的，所述通道或反應(yīng)池內(nèi)設(shè)有用于固態(tài)試劑，所述固態(tài)試劑在核酸擴增過程中參與反應(yīng)，所述固態(tài)試劑包括干粉試劑和凝膠試劑。采用此技術(shù)方案，事先將反應(yīng)所需酶和引物加入到所述固態(tài)試劑中，使核酸擴增反應(yīng)的全過程不需要外加反應(yīng)物，保證了反應(yīng)的連續(xù)發(fā)生，提高檢測效率。所述中間層采用鏤空結(jié)構(gòu)，所述底片和蓋片均為環(huán)烯烴類共聚物的優(yōu)點是：環(huán)烯烴類共聚物的一種高透明性的高分子材料，其光線透過率可達90%以上。中間層設(shè)有鏤空結(jié)構(gòu)，由于鏤空結(jié)構(gòu)的上方和下方均為薄膜，薄膜的透明度高，而優(yōu)選為環(huán)烯烴類共聚物的透明度更高，在對底片、中間層和蓋片進行激光焊接時，薄膜極少吸收激光，因此通道和反應(yīng)池的內(nèi)表面在激光焊接后仍能保持光滑，保證后續(xù)核酸擴增反應(yīng)的進行。所述中間層材質(zhì)優(yōu)選為熱塑性彈性體，其優(yōu)點為：1、形成通道、反應(yīng)池等主要結(jié)構(gòu)，完成擴增反應(yīng)。2、避免產(chǎn)生氣穴，對芯片進行激光焊接是一種簡單高效的生產(chǎn)工藝，但對于薄膜式的芯片，激光焊接的難點在于這三層薄膜貼合后，在薄膜之間很容易形成氣穴，氣穴不僅造成激光焊接強度不夠，而且容易形成不規(guī)則的燒痕，嚴(yán)重影響產(chǎn)品美觀。而采用熱塑性彈性體的中間層，由于具有彈性，薄膜之間在外界壓力下不會產(chǎn)生氣穴，避免了出現(xiàn)燒痕。進一步的，所述中間層為黑色熱塑性彈性體，所述底片、蓋片均為透明環(huán)烯烴類共聚物的優(yōu)點是：由于激光焊接要求芯片的某一層能夠吸收激光能量，一般采用兩種方式：第一種是采用摻雜炭黑的黑色材質(zhì)作為中間層，第二種是在中間層上涂覆吸光涂料。本發(fā)明采用黑色熱塑性彈性體是使用了第一種方式，優(yōu)點是不再需要涂覆工藝步驟；采用透明環(huán)烯烴類共聚物，其透明度更高，在激光焊接時候不容易吸收激光，減少了對激光對位精度的要求，提高了激光焊接效率效果。實施例3一種如實施例1或?qū)嵤├?所述的薄膜式核酸擴增微流控芯片的制備方法，包括以下步驟：步驟s1，制備底片、蓋片和中間層，所述底片、蓋片和中間層均為薄膜；步驟s2，在所述中間層上切/削出通道和反應(yīng)池；步驟s3，在所述蓋片上加工出進口和出口；步驟s4，將所述底片、中間層和蓋片依次對位，使所述進口、出口分別與所述通道連接，使所述底片、中間層、蓋片貼合壓緊后進行封接；步驟s5，封接完成，獲得所述薄膜式核酸擴增微流控芯片?，F(xiàn)有技術(shù)中一般采用注塑工藝來生產(chǎn)芯片，當(dāng)使用注塑工藝加工精細結(jié)構(gòu)時，經(jīng)常出現(xiàn)低平面度、熔接痕、澆口斷裂等問題，很難達到設(shè)計要求；對于薄膜式芯片來說，其厚度很小，反應(yīng)池和通道的結(jié)構(gòu)非常精細，注塑工藝無法完成如此精細的結(jié)構(gòu)，使得薄膜式芯片的生產(chǎn)工藝成為一個難題。為避免注塑工藝產(chǎn)生的上述問題，本發(fā)明使用先切/削后封接的生產(chǎn)工藝：先在中間層切/削獲得切口平整、結(jié)構(gòu)精細的通道和反應(yīng)池；再將所述底片、中間層和蓋片封接貼合在一起。由于薄膜在一定角度范圍內(nèi)能任意變形，因此封接不容易卷翹或者斷裂，密封性好。采用上述先切/削、后封接的技術(shù)方案，生產(chǎn)工藝簡單、高效，采用這種工藝生產(chǎn)的薄膜式核酸微流控芯片，厚度小，有利于提高溫控效率；切口平整；薄膜的柔性好，使得芯片邊緣被加工后不容易卷翹或者斷裂，密封性好。實施例4在實施例3的基礎(chǔ)上，進一步的，所述步驟s2中，所述切/削方式包括機器沖切、機加工、裁剪、激光切割的一種或多種方式；所述步驟s3中，所述加工方式包括沖切、機加工、裁剪、激光切割和注塑成型中的一種或多種方式；所述步驟s4中，所述封接方式包括激光焊接、熱壓封接、高強度化學(xué)膠粘接或超聲焊接中的一種或多種方式。采用此技術(shù)方案，可以根據(jù)工廠的設(shè)備情況，采用多種方式組合進行生產(chǎn)加工，如采用焊接的方式進行封接，可以提高封接效率。進一步的，所述步驟s2中，所述切/削采用機器沖切方式；所述步驟s4中，先使所述底片、中間層、蓋片貼合壓緊，放入激光焊接設(shè)備中，再通過線激光掃描進行焊接。采用機器沖切的優(yōu)點是：沖切表面光滑、生產(chǎn)效率高、成本低。由于涉及核酸擴增反應(yīng)，通道或反應(yīng)池的側(cè)壁也盡量光滑，減少生物分子吸附，提高擴增效率。機器沖切使用沖床，切口光滑，符合需求。沖切工藝是機械加工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)工藝，工藝成熟度高，配套廠家多，批量生產(chǎn)成本很低，只需使用相應(yīng)的沖切模具，就能快速生產(chǎn)。采用激光焊接的方式，有利于提高焊接效率。采用熱塑性彈性體的中間層進行激光焊接的優(yōu)點是：激光焊接的難點在于薄膜對位后，在薄膜之間很容易形成氣穴，氣穴不僅造成激光焊接后強度不夠，而且形成不規(guī)則的燒痕，嚴(yán)重影響產(chǎn)品美觀。而采用彈性材料的中間層，由于具有彈性，薄膜之間在外界壓力下不會產(chǎn)生氣穴，避免了出現(xiàn)燒痕。采用環(huán)烯烴類共聚物的底片和蓋片，以及采用鏤空結(jié)構(gòu)的中間層的基礎(chǔ)上進行激光焊接的優(yōu)點是：激光焊接時不再需要掩膜輔助。線掃描式激光焊接設(shè)備，通常需要金屬掩膜輔助，掩膜會保護通道或反應(yīng)池等流體區(qū)域，激光只焊接非保護區(qū)域。但是由于光學(xué)折射、機械定位等原因，掩膜的設(shè)計位置和芯片結(jié)構(gòu)位置很容易發(fā)生偏差，此時激光就會照射通道或反應(yīng)池等關(guān)鍵區(qū)域，造成反應(yīng)區(qū)域表面的粗糙化，極大影響了生物反應(yīng)效率。中間層設(shè)有鏤空結(jié)構(gòu)，由于鏤空結(jié)構(gòu)的上方和下方均為薄膜，薄膜的透明度高，而優(yōu)選為環(huán)烯烴類共聚物的透明度更高，因此在對底片、中間層和蓋片進行激光焊接時，薄膜極少吸收激光，使通道和反應(yīng)池的內(nèi)表面在激光焊接后仍能保持光滑，保證后續(xù)核酸擴增反應(yīng)的進行。實施例5、實施例6分別是兩個優(yōu)選的實施例，進一步對實施例1-4中的一種薄膜式核酸擴增微流控芯片及其制備方法進行說明。實施例5如圖1-4所示的一種薄膜式核酸擴增微流控芯片，包括依次貼合的底片1、中間層2和蓋片3，所述中間層2設(shè)有鏤空結(jié)構(gòu)，所述鏤空結(jié)構(gòu)包括一個通道21和一個反應(yīng)池22，所述通道21與反應(yīng)池22連接，所述蓋片3設(shè)有一個進口和一個出口，所述進口和出口均為通孔31，所述進口、出口分別與所述通道連接，所述底片1、中間層2和蓋片3均為薄膜高分子材料。進一步的，所述薄膜式核酸擴增微流控芯片的長為75mm，寬為25mm；所述通道寬2mm，反應(yīng)池寬5mm；所述進樣口和出樣口的直徑均為2mm。進一步的，所述底片為0.1mm，蓋片的厚度為0.05mm，所述底片和蓋片均為環(huán)烯烴類共聚物；所述中間層的厚度為0.5mm，材質(zhì)為黑色熱塑性彈性體。上述的薄膜式核酸擴增微流控芯片的制備方法為，包括以下步驟：步驟s1，制備底片、蓋片和中間層，所述底片、蓋片和中間層均為薄膜；步驟s2，在所述中間層上采用機器沖切的方式?jīng)_切出一個通道和一個反應(yīng)池；步驟s3，在所述蓋片上采用機器沖切的方式加工出一個進口和一個出口；步驟s4，將所述底片、中間層和蓋片依次對位，使所述進口、出口分別與所述通道連接，使所述底片、中間層、蓋片貼合壓緊后，放入激光焊接設(shè)備中，進行線激光掃描焊接，焊接時無需掩膜輔助；需正反兩次焊接；焊接時激光的功率為：300w，激光掃描速度為：80mm/s；步驟s5，封接完成，獲得所述薄膜式核酸擴增微流控芯片。上述實施例使用的機器型號如下：沖床型號為q35y系列聯(lián)合沖剪機，生產(chǎn)廠家為北京市巨星鍛壓機床廠。激光焊接設(shè)備型號為workstationatsystem，生產(chǎn)廠家為萊丹塑料焊接技術(shù)（上海）有限公司。實施例5所述的薄膜式核酸擴增微流控芯片的使用方法是：如圖4所示的配套框架的設(shè)有固定件（圖中未示出），所述薄膜式核酸擴增微流控芯片的兩側(cè)通過固定件與所述配套框架連接，然后放入配套檢測儀器中使用。采用實施例5的技術(shù)方案，得到一種用于簡單反應(yīng)檢測的微流控芯片，這種芯片的厚度小，溫控效率高，密封性好，生物兼容性好，生產(chǎn)工藝簡單高效。實施例6如圖5所示的另一種薄膜式核酸擴增微流控芯片，包括底片、中間層和蓋片三層，所述底片、中間層和蓋片依次貼合，所述中間層設(shè)有鏤空結(jié)構(gòu)，所述鏤空結(jié)構(gòu)包括一個通道21和十五個反應(yīng)池22，所述通道21與反應(yīng)池22連接，所述蓋片上設(shè)有一個進樣口和一個出樣口，所述進樣口、出樣口均為通孔31，所述進樣口、出樣口分別與所述通道21連接，所述底片、中間層和蓋片均為高分子材料。進一步的，所述薄膜式核酸擴增微流控芯片的長為75mm，寬為45mm；所述通道寬1mm，反應(yīng)池為圓形，直徑2.5mm；所述進樣口和出樣口的直徑均為2mm；進一步的，所述底片的厚度為0.5mm，蓋片的厚度為0.5mm，中間層的厚度為2mm；所述底片和蓋片均為透明環(huán)烯烴類共聚物；所述中間層為黑色環(huán)烯烴類共聚物。進一步的，所述反應(yīng)池內(nèi)有固態(tài)試劑，為固定劑包裹的taq酶和引物。固定劑在50-60℃時可以分解，釋放出酶和引物。其中，taq酶是從水生棲熱菌thermusaquaticus(taq)中分離出的具有熱穩(wěn)定性的dna聚合酶。上述薄膜式核酸擴增微流控芯片的制備方法為，包括以下步驟：步驟s1，制備底片、蓋片和中間層，所述底片、蓋片和中間層均為薄膜；步驟s2，先在中間層上用激光切割的方式切割出一個通道；再用機器沖切的方式?jīng)_切出十五個反應(yīng)池。這樣反應(yīng)池的側(cè)壁仍然為光滑，能減少生物吸附；步驟s3，在所述蓋片上采用激光切割的方式加工出一個進口和一個出口；步驟s4，將所述底片、中間層和蓋片依次對位，使所述進口、出口分別與所述通道連接，使所述底片、中間層、蓋片貼合壓緊后，放入激光焊接設(shè)備中，進行線激光掃描焊接，焊接時無需掩膜輔助；需正反兩次焊接。焊接時激光的功率為：300w，激光掃描速度為：50mm/s；步驟s5，封接完成，獲得所述薄膜式核酸擴增微流控芯片。上述實施例使用的機器型號如下：沖床型號為q35y系列聯(lián)合沖剪機，生產(chǎn)廠家為北京市巨星鍛壓機床廠；激光焊接設(shè)備型號為workstationatsystem，生產(chǎn)廠家為萊丹塑料焊接技術(shù)（上海）有限公司。激光切割機器型號為lf1390，生產(chǎn)廠家為濟南金威刻科技發(fā)展有限公司。實施例5所述的薄膜式核酸擴增微流控芯片的使用方法是，包括以下步驟：步驟a1，向所述薄膜式核酸擴增微流控芯片內(nèi)加入液態(tài)反應(yīng)試劑，封閉進口和出口。步驟a2，將所述薄膜式核酸擴增微流控芯片放入配套檢測儀器，底部貼近所述配套檢測儀器的溫控模塊。步驟a3，控制溫度為50℃，保持5分鐘，使得薄膜式核酸擴增微流控芯片內(nèi)的固態(tài)試劑與加入的液態(tài)反應(yīng)試劑混合均勻。步驟a4，進行溫度循環(huán)，擴增參數(shù)為：變性95℃50s，退火45℃30s，延伸74℃60s，進行45個循環(huán)。同時實時熒光檢測。步驟a5，反應(yīng)完畢，得到實時熒光擴增曲線，與軟件內(nèi)預(yù)置的標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線，對比得到各反應(yīng)池內(nèi)指標(biāo)的濃度、陰陽性信息。以下為檢測結(jié)果：表1菌種檢測結(jié)果序號菌種指標(biāo)陰陽性濃度cfu/ml1金黃色葡萄球菌陰性-2沙門氏菌陽性10003艱難梭菌陰性-4布魯氏菌陽性1005阪崎腸桿菌陽性1000-6大腸桿菌陰性-7單核細胞增生李斯特菌陰性-8副溶血弧菌陽性10009銅綠假單胞菌陰性-10空腸彎曲桿菌陽性1000011志賀氏菌陽性1000012霍亂弧菌陰性-13溶藻弧菌陰性-這里使用的配套檢測儀器指的是實時熒光pcr核酸擴增儀，實時熒光定量pcr（real-timequantitativepcr）技術(shù)是在pcr反應(yīng)體系中加熱特異性的熒光染料或探針，熒光信號的變化真實地反映了體系中模板的增加，通過檢測熒光信號達到定量的目的。采用實施例6的薄膜式核酸擴增微流控芯片，在檢測過程中，未發(fā)生泄漏，溫控效率高，采用常規(guī)技術(shù)的配套檢測儀器就可以實現(xiàn)精確的檢測。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁12