本發(fā)明涉及毛細管及其制備方法和應(yīng)用，尤其涉及帶有用于攔截作為相互作用相的生物材料的柱篩的毛細管色譜柱、其制備方法以及毛細管色譜柱通過高效毛細管電泳(highperformancecapillaryelectrophoresis，hpce)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域例如在研究生物大分子與活性配體或化合物相互作用以及藥物篩選等方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

大多數(shù)生物分子都是通過與其目標分子發(fā)生特異性相互作用而發(fā)揮其生理功能，例如酶和底物、抗原和抗體、受體和激素、凝集素和多糖蛋白等。這些特異性相互作用是化學(xué)與生物化學(xué)體系中廣泛存在的現(xiàn)象，更是產(chǎn)生生命現(xiàn)象的基礎(chǔ)。對生物分子及其功能配體相互作用的表征已成為生物化學(xué)研究的重點之一，這有助于深入認識生物大分子間各種功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)及作用機制，有助于新藥的發(fā)現(xiàn)。因此，開發(fā)研究生物分子間或生物大分子與其他配體間相互作用的方法變得尤為重要。

研究生物分子間或生物大分子與其他配體間相互作用的方法主要可以分為兩大類：一類是直接測定法，包括uv吸收法、拉曼光譜法、熒光強度法、電位法、熱分析法、核磁共振法(nmr)、傅里葉變換紅外光譜法(ftir)、質(zhì)譜法(ms)、表面等離子共振法(spr)等；另一類是分離分析法，包括濾膜分析法、超濾法、超速離心法、色譜法(薄層色譜法和液相色譜法)、電泳法(平板電泳法和hpce)。后者的優(yōu)點是：能同時提供相互作用的兩種分子以及復(fù)合物的信息，避免了共存物質(zhì)的干擾。分離分析法所包括的濾膜分析法、超濾法、超速離心法、色譜法和平板電泳法常常用于研究配體-受體之間的相互作用，但它們存在結(jié)合分子從膜上滲漏、體積改變、donnan效應(yīng)、非特異性吸附、分析時間長、樣品消耗大等缺點；近年來，以hpce為基礎(chǔ)的技術(shù)成為研究生物分子間或生物大分子與其他配體間相互作用的主要方法。

hpce用于研究生物分子間或生物大分子與其他配體間相互作用，具有以下優(yōu)點：分離效率高，可達10⁵-10⁶板/米；分析時間短，幾十秒至十幾分鐘即可完成分析；樣品消耗少，進樣所需體積可小至1μl，消耗體積在1-50nl之間；能夠在生理條件或接近生理條件的緩沖液中進行，可得到較為真實的生物分子之間相互作用的信息；可以同時研究多種分子對一種分子的結(jié)合行為；運用靈活，可以選擇不同的模式來適用不同的分離對象；經(jīng)濟；潔凈；自動化程度較高。其中，hpce用于研究相互作用的形式有預(yù)平衡區(qū)帶電泳、動力學(xué)平衡區(qū)帶電泳和固定化親和電泳。近幾年又陸續(xù)出現(xiàn)固定化細胞毛細管電泳法(icce)、細胞膜色譜法(cellmembranechromatography,cmc)，使得無法分離的受體能夠直接通過hpce或cmc進行配體篩選。將細胞固定于色譜柱內(nèi)進行受體配體相互作用研究并應(yīng)用于藥物篩選是近年來發(fā)展的新技術(shù)，該技術(shù)突出的優(yōu)勢在于對不可分離的細胞膜受體進行固定化，從而克服傳統(tǒng)生物學(xué)方法存在的準確率低、毒性大、成本高等問題。細胞固定化技術(shù)利用物理或化學(xué)方法將細胞固定在合適的載體上，使其發(fā)揮生物活性，比酶固定化法更簡便、快捷、經(jīng)濟。但該方法仍具有操作復(fù)雜，制備難，周期長，使用壽命短，只能對高表達受體細胞進行篩選等缺點。

因此，在icce基礎(chǔ)上，對方法進行創(chuàng)新，建立可以對生物大分子超表達(比如glut1)的細胞、細胞、線粒體、離體組織、腫瘤組織、載帶生物靶固體物質(zhì)等各種生物材料表面受體直接篩選的方法變得尤為重要。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種生物材料作為相互作用相的毛細管、毛細管電泳系統(tǒng)(即非固定化生物材料毛細管電泳，nibce)及其制備和用途。

本發(fā)明首次提供了一種新型的毛細管、制備具有孔徑可控的柱篩，并注入經(jīng)過固定的生物材料作為相互作用相，而該相互作用相表面的受體保持天然構(gòu)象和生物活性，并且研究了將這種新型的毛細管通過hpce在生物技術(shù)領(lǐng)域比如研究生物大分子與活性配體或化合物相互作用以及藥物篩選等方面的用途。

本發(fā)明一方面提供了一種毛細管，其帶有柱篩和相互作用相，其中所述柱篩的孔徑可控，可用于攔截作為相互作用相的生物材料。

所述柱篩可設(shè)置在所述毛細管的中間部位或端部，或者所述柱篩連接于所述毛細管的端部。

所述生物材料包括細胞、線粒體、離體生物組織、腫瘤組織、載帶生物靶固體物質(zhì)等。其中所述細胞為生物大分子超表達的細胞或腫瘤細胞，細胞表面的大分子受體高表達，且保持天然構(gòu)象和生物活性。

該毛細管中或毛細管間設(shè)有孔徑可控的柱篩，將生物材料經(jīng)過固定后注入毛細管內(nèi)作為相互作用相，使該相互作用相表面的受體保持天然構(gòu)象和生物活性。其中所述柱篩的材料為無機材料，有機材料、復(fù)合材料、生物材料或其它任何適用的材料。本發(fā)明另一方面提供了一種制備所述毛細管的方法，其包括：

對毛細管進行前處理；

對柱篩材料進行預(yù)處理并形成柱篩，使所述柱篩設(shè)置在所述毛細管的中間部位或端部，或者使所述柱篩連接于所述毛細管的端部，從而形成帶有柱篩的毛細管；若所述柱篩被設(shè)置在所述毛細管的端部或連接于毛細管的端部，則需將毛細管的端部與具有檢測窗口的毛細管的端部通過連接器進行連接；

對作為相互作用相的生物材料進行培養(yǎng)或處理并進行固定；以及將固定后的所述生物材料注入所述帶有柱篩的毛細管中，使得所述生物材料被攔截于柱篩后端作為相互作用相。

另外，本發(fā)明還涉及一種hpce系統(tǒng)，其包括：本發(fā)明所述帶有孔徑可控柱篩的毛細管；用于將生物材料及樣品導(dǎo)入毛細管的裝置；對導(dǎo)入所述毛細管的所述樣品進行電泳操作的裝置；以及對所述樣品進行檢測的裝置。

同時，本發(fā)明還提供了一種hpce方法，其包括提供帶有孔徑可控柱篩的毛細管，并將細胞、線粒體、離體組織、腫瘤組織等生物材料固定后注入毛細管作為相互作用相；提供電泳裝置；將生物材料或樣品導(dǎo)入所述毛細管；對所述樣品進行hpce分析；以及對所述樣品進行檢測分析。

所述hpce方法適用于，例如用于研究分子間相互作用的毛細管電泳，包括陣列毛細管電泳、芯片毛細管電泳、陣列芯片毛細管電泳、毛細管液相色譜等。

進一步，本發(fā)明還提供了上述毛細管或者毛細管色譜柱在生物技術(shù)領(lǐng)域的用途。所述生物技術(shù)領(lǐng)域包括，例如藥物篩選、生物大分子與活性配體相互作用或與化合物相互作用、藥物成分分析、藥物活性成分純化及鑒定等方面。

本發(fā)明所建立的柱篩攔截固定后的生物材料(細胞、線粒體、離體組織、腫瘤組織等)作為相互作用相，用于研究分子間相互作用和藥物篩選的方法，能夠用于對化合物與受體相互作用進行定性定量研究。與icce以及其他毛細管內(nèi)細胞固定化方法相比，本發(fā)明所提供方法的優(yōu)點在于：(1)當(dāng)細胞等作為相互作用相時，注入毛細管的細胞具有動態(tài)和穩(wěn)態(tài)兩種狀態(tài)，其中動態(tài)情況可用于模擬生理環(huán)境中的藥物與腫瘤細胞的相互作用；(2)相互作用相可以通過反打出毛細管，隨時更新，避免活性位點被飽和而帶來的假陰性結(jié)果，毛細管柱可以重復(fù)使用，循環(huán)利用度高；(3)生物材料被攔截而不能到達檢測器，從而消除其對檢測器的干擾，特別有利于采用hpce-ms快速從混合物中發(fā)現(xiàn)有結(jié)合的物質(zhì)，并通過結(jié)合常數(shù)的計算選擇結(jié)合活性最強的物質(zhì)；(4)樣品用量少、靈敏度高、重現(xiàn)性好，色譜峰形理想，可利用nlc技術(shù)對受體配體相互作用進行定量分析，給出動力學(xué)參數(shù)k，k’，ka，kd；(5)制備方法非常簡單、快速，成本低，實驗周期短；(6)本方法拓寬了應(yīng)用范圍，將不同的生物材料引入毛細管作為相互作用相，用于研究分子間的相互作用，更具有實際應(yīng)用價值。

本發(fā)明通過柱篩攔截注入毛細管內(nèi)的生物材料(細胞、線粒體、離體組織、腫瘤組織等)而實現(xiàn)了對難以分離純化的高分子受體蛋白的固定化，進一步實現(xiàn)了對高分子受體蛋白質(zhì)的親和色譜ace研究。其次，此方法因具有hpce所具備的快速、高效、經(jīng)濟、靈敏、樣品用量少等優(yōu)點，可以進行混合物或單一化合物與生物材料相互作用研究而區(qū)別于其他藥物篩選方法。一些目前常用的藥物篩選技術(shù)僅能提供ic50值，而本發(fā)明的方法能提供結(jié)合常數(shù)等動力學(xué)參數(shù)。

本發(fā)明所述毛細管及相關(guān)方法也適用于其他領(lǐng)域并具有明顯的技術(shù)優(yōu)勢，例如：陣列毛細管電泳高通量藥物篩選法，篩選組合化學(xué)庫或傳統(tǒng)中藥中的前體藥物。

附圖說明

圖1顯示根據(jù)本發(fā)明的一種實施方式的毛細管柱篩的制備(以硅膠作為柱篩材料為例)及篩選方法建立的相關(guān)圖。其中：a為毛細管柱篩的電鏡掃描圖(sem,jsm-5600lv,jeol,japan)；b為通過共聚焦顯微鏡采集的glut1-egfp轉(zhuǎn)染hek293細胞36h后的圖像(glut1-egfp定位于細胞膜，顯示為綠色熒光，glut1-egfp的hek293細胞的核染色為藍色熒光)；c為通過共聚焦顯微鏡采集的固定化細胞色譜柱的圖像；d光學(xué)顯微鏡采集的毛細管內(nèi)的細胞狀態(tài)圖像(左為“動態(tài)”細胞，右為“穩(wěn)態(tài)”細胞)；e為在不同glut1-hek293細胞密度下egcg的hpce圖；f為在動態(tài)和靜態(tài)glut1-hek293細胞狀態(tài)下，dmso、egcg的hpce圖；g為根據(jù)本發(fā)明建立非固定化生物材料毛細管電泳(non-immobilizedbiomaterialcapillaryelectrophoresis，nibce)，dmso和egcg在不同毛細管色譜柱上(柱篩毛細管、普通hek293細胞作為相互作用相、超表達glut1的hek293細胞作為相互作用相)的電泳圖。

圖2為根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式egcg通過nicce和icce兩種方法測定的動力學(xué)參數(shù)比較表。

圖3為根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式所篩選的黃芩總黃酮提取物(a)和部分被篩選化合物(b)的hpce圖，以及所篩選出的部分活性化合物的葡萄糖競爭實驗電泳圖(c)。

圖4列舉了根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式所篩選的22個化合物的結(jié)構(gòu)。

圖5為圖4所述22個化合物的篩選結(jié)果以及nicce和icce結(jié)果對照表。

圖6為根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式a549腫瘤細胞作為相互作用相時部分化合物的hpce圖。

圖7為根據(jù)本發(fā)明的具體實施方式離體肺組織和腫瘤組織作為相互作用相時部分化合物的hpce圖。

圖8為egcg，fsb-1、fsb-2、fsb-3、sl-3、sl-4的mtt細胞水平抗腫瘤活性實驗結(jié)果。

圖9為動物水平抗腫瘤活性實驗結(jié)果。其中：a、b為給藥后第27天動物處死時，生理鹽水組(ns組)、egcg組(80mg/kg)、fsb-1組(80mg/kg)和fsb-2組(80mg/kg)的動物腫瘤生長情況；c為給藥后各組動物體重變化情況；d為給藥后各組動物腫瘤體積變化情況；e為給藥后第27天動物處死時，各組腫瘤的重量。*代表與ns組相比具有顯著性差異(*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001)。

具體實施方式

在下文中結(jié)合一些具體的實施方式對本發(fā)明作進一步的、示例性的描述，包括在毛細管中或毛細管間制備柱篩，細胞的培養(yǎng)與固定，線粒體的提取，離體組織和腫瘤組織的固定，將所述細胞、線粒體、離體組織、腫瘤組織等生物材料注入毛細管內(nèi)作為相互作用相的方法，以及這種新型的毛細管通過hpce在生物技術(shù)領(lǐng)域比如在研究生物大分子與活性配體或化合物相互作用以及藥物篩選等方面的用途。

在本發(fā)明所包括的一種實施方式中，將一種材料粉末，例如一定粒徑的硅膠粉末，用溶液充分處理后，裝填入毛細管中部或端部，加熱處理一定時間后，制備出ph耐受范圍廣、重現(xiàn)性良好、孔徑可控的柱篩毛細管。

在一個實施方式中，將生物材料，例如細胞、線粒體、離體組織、腫瘤組織等生物材料注入帶有柱篩的毛細管色譜柱內(nèi)，從而獲得具有生物材料作為相互作用相的毛細管色譜柱。

在一個實施方式中，將一種細胞，例如普通細胞、生物大分子超表達的細胞、腫瘤細胞，經(jīng)過固定后注入毛細管內(nèi)，從而獲得具有細胞作為相互作用相的毛細管。

在一種實施方式中，將經(jīng)過適當(dāng)培養(yǎng)(例如含有10-20％fbs的rpmi1640培養(yǎng)基，在37℃，5％co2孵箱內(nèi)培養(yǎng)，其培養(yǎng)時間可為例如10–48h)的細胞，經(jīng)電轉(zhuǎn)后的細胞置于pbs中懸浮細胞至密度例如為1.0×10⁴-1.0×10⁷個/ml，隨后對活細胞層采用例如4％的多聚甲醛進行處理，其處理時間可為例如5-25min。

在一種實施方式中，將離體組織、腫瘤組織，采用4％的多聚甲醛進行處理，處理時間可為例如12h-48h，處理后儲存于75％乙醇中備用。

在提供上述新型毛細管制備方法的同時，本發(fā)明的實施方式還包括將所述毛細管色譜柱用于生物技術(shù)例如包括藥物篩選的操作方法。在本發(fā)明的一種實施方式中，根據(jù)特定的操作條件，以egcg為陽性對照、二甲基亞砜(dmso)為陰性對照進行了方法驗證。結(jié)果表明，egcg與dmso分別在超表達glut1的hek293細胞作為相互作用相的毛細管色譜柱內(nèi)的色譜行為完全不同，據(jù)此可以定性判斷化合物與受體之間是否存在相互作用。

本發(fā)明所提供的一種實施方式還包括將所述毛細管用于hpce系統(tǒng)及其方法。所述hpce方法包括：提供本發(fā)明所述的毛細管，其中間部位或端部設(shè)置有柱篩，并攔截作為相互作用相的生物材料；提供電泳裝置；將生物材料或樣品導(dǎo)入所述毛細管；對所述樣品進行電泳分析；以及對所述樣品進行檢測分析。

在本發(fā)明的另一些實施方式中，為了真實、可靠并且快速地反映受體和配體的相互作用，本發(fā)明建立將超表達glut1受體的hek293細胞固定后攔截于柱篩后端作為相互作用相研究分子間相互作用的方法。并針對黃芩總黃酮提取物、黃芩中黃酮單體化合物、鏈霉菌屬代謝產(chǎn)物、芽孢桿菌屬代謝產(chǎn)物進行了結(jié)合活性篩選。在此基礎(chǔ)上，為了進一步驗證所篩選出的活性物質(zhì)與實際腫瘤細胞與腫瘤組織的相互作用，本發(fā)明首次建立了將a549腫瘤細胞、離體肺組織、a549細胞移植性腫瘤組織固定后作為相互作用相的方法，用于研究結(jié)合活性化合物與它們的相互作用。

在本發(fā)明的另一些實施方式中，為了判斷陽性化合物與葡萄糖之間是否存在競爭性結(jié)合，本發(fā)明以glut1為靶點進行陽性化合物與葡萄糖競爭性結(jié)合實驗，例如在pb緩沖液中分別添加不同質(zhì)量的葡萄糖配制成含0-10mm的葡萄糖緩沖液，觀察陽性化合物在這些緩沖液中的hpce行為變化，從而判斷它們與glut1結(jié)合時是否占據(jù)葡萄糖的結(jié)合位點。

另外，采用非線性色譜理論(non-linearchromatography,nlc)對篩選出的活性化合物進行了結(jié)合常數(shù)、結(jié)合速率常數(shù)、解離速率常數(shù)以及容量因子的定量計算，同時對這些化合物進行了mtt實驗進行細胞水平抗腫瘤活性研究，并進一步對活性強的化合物(包括與葡萄糖不存在競爭性結(jié)合和存在競爭性結(jié)合的化合物)進行動物水平抗腫瘤活性研究。結(jié)果表明，通過該方法篩選出的活性化合物能夠不同程度地抑制腫瘤細胞的生長，為抗腫瘤藥物篩選及腫瘤治療奠定基礎(chǔ)并提供了科學(xué)依據(jù)及新思路，也表明本發(fā)明最新建立的方法用于分子水平篩選化合物的生物活性，與前期發(fā)明建立的icce法用于分子水平篩選化合物結(jié)果基本一致、且有效。

實施例

下面結(jié)合具體實施例，進一步闡明本發(fā)明。應(yīng)該理解，這些描述不是用來限制本申請要求保護的范圍。

實施例1、生物材料作為相互作用相的hpce新方法，即非固定化生物材料毛細管電泳(nibce)的建立(以glut1超表達hek293細胞作為相互作用相為例)

毛細管柱篩的制備及性能驗證：長30.2cm，200μmi.d.的熔融石英毛細管依次用甲醇、超純水、0.1mhcl、超純水、0.1mnaoh、超純水沖洗，吹干后將一定量的硅膠、se-30或ods粉末通過加溫在毛細管中制備鍵合柱篩，獲得帶有柱篩的毛細管，室溫保存，備用。硅膠作為原料制備的毛細管柱篩的電鏡掃描圖見圖1(a)。

毛細管柱篩的性能驗證：在本實施例中，所用hpce為beckmanp/acetmmdq系統(tǒng)(beckman-coulter,fullerton,ca,usa)，配有一個二級陣列檢測器以及32karatsoftware工作站(version5.0,beckman)，外層為聚酰亞胺涂層的帶有柱篩的熔融石英毛細管色譜柱。本實驗對柱篩的ph耐受范圍、柱篩重現(xiàn)性進行了驗證。本實驗配制不同ph的naoh或hcl溶液，在相同條件下進樣陰性化合物dmso，在兩次進樣中間分別用堿或酸反沖5-10min，觀察dmso出峰情況的變化，以判斷柱篩的ph耐受范圍。每組重復(fù)兩次，結(jié)果重現(xiàn)性較好。結(jié)果證明，實驗所制備的毛細管柱篩所能耐受的ph范圍為1-14。另外，相同條件下制備三根毛細管柱篩，在連續(xù)五天內(nèi)進樣dmso，分別對其進行重現(xiàn)性考察。其中，保留時間的日內(nèi)、日間和批間精密度的rsd分別為4.90％、6.56％、9.04％，峰面積的日內(nèi)、日間和批間的rsd分別為2.50％、4.13％、6.77％，表明所制備的柱篩毛細管的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性良好。

glut1超表達hek293細胞的培養(yǎng)：hek293細胞培養(yǎng)在含有10％胎牛血清(fbs，canadagibco)的rpmi1640培養(yǎng)基中，其中含有青霉素(100u/ml)和鏈霉素(100μg/ml)。將400μlhek293細胞(4×10⁶)通過電脈沖發(fā)生器(electrosquareporatorecm830,btx,sandiego,ca)，在電壓123v，脈沖時間20ms條件下，瞬時轉(zhuǎn)glut1-egfp/pcdna-dest47質(zhì)粒10-20μg。36-48h后利用熒光顯微鏡觀察hek293細胞膜上綠色熒光的分布，具體情況可見圖1(b)，證明大多數(shù)細胞表面都表達了glut1。

glut1-he293k細胞固定后作為相互作用相的毛細管色譜柱的制備：將電轉(zhuǎn)后(t-36-48h)的glut1-hek293細胞從培養(yǎng)皿中消化離心后，細胞計數(shù)，用4％多聚甲醛避光固定15-25min后，根據(jù)計數(shù)結(jié)果用pbs將細胞密度調(diào)整至1.0×10⁴-1.0×10⁷個/ml。保存在4℃冰箱待用。實驗時，將上述固定后的細胞注入毛細管，由于柱篩的存在，這些glut1超表達細胞注入毛細管內(nèi)有兩種存在形式：“動態(tài)”和“穩(wěn)態(tài)”，即細胞剛注入毛細管內(nèi)的一段時間內(nèi)細胞還未到達篩板后端的運動狀態(tài)，和細胞全部運動至篩板后端的穩(wěn)定狀態(tài)，見圖1(d)。此方法中的細胞經(jīng)4％多聚甲醛固定后，4℃于pbs中保存30天仍保持著藥物篩選活性，細胞可以使用時再注入毛細管中，使用后反打出毛細管，操作簡單方便，隨時更新，避免活性位點被飽和而帶來的假陰性結(jié)果，重復(fù)循環(huán)利用度高。

不同數(shù)量、不同狀態(tài)的細胞以及活細胞對結(jié)合作用的影響：本發(fā)明考察了不同數(shù)量細胞，不同狀態(tài)細胞和活細胞對結(jié)合作用的影響。如圖1(e)可以發(fā)現(xiàn)，egcg在不同密度細胞的毛細管色譜柱中峰形有所變化。當(dāng)細胞密度為10⁴和10⁵個/ml時，egcg的峰高只表現(xiàn)出一定的降低，展寬不明顯；而隨著細胞密度增至10⁶個/ml，egcg的峰形表現(xiàn)出顯著的拖尾展寬；當(dāng)增至10⁷個/ml，峰形表現(xiàn)為貼附在基線上的一個寬的平伏峰形。結(jié)果表明，對于有結(jié)合作用的化合物，當(dāng)細胞數(shù)目達到一定密度時，結(jié)果較真實可信。以glut1為靶點，對比dmso和egcg在不同細胞狀態(tài)下的電泳行為，判斷細胞狀態(tài)是否對結(jié)合常數(shù)有影響。圖1(f)可見，nicce的方法對于細胞動態(tài)和穩(wěn)態(tài)都適用，強陽性化合物更適合在細胞動態(tài)時進行實驗。需要特別指出的是，細胞動態(tài)情況下更能模擬藥物在血液中的環(huán)境，所得的結(jié)合常數(shù)更接近于生理條件。在后續(xù)實驗中，未有特殊說明，都采用細胞動態(tài)下進行實驗。

此外，本發(fā)明還考察了在該方法下活細胞是否可以不固定，直接進行分子間相互作用的研究。結(jié)果顯示，在活細胞作為相互作用相時，基線不穩(wěn)、峰形不規(guī)則。因此，本方法不適用于活細胞(即不經(jīng)過4％多聚甲醛固定的細胞)研究分子間的相互作用。

超表達glut1的hek293細胞作為相互作用相的毛細管色譜柱用于化合物篩選方法的驗證：glut1的轉(zhuǎn)運底物有葡萄糖、半乳糖和甘露糖，但三者的靈敏度低，因此，在本實驗中將egcg作為陽性化合物，dmso為陰性化合物，分別研究了其在柱篩毛細管、正常hek293細胞作為相互作用相的毛細管、glut1超表達hek293細胞作為相互作用相的毛細管中的色譜行為，實驗結(jié)果如圖1(g)所示。比較dmso在不同色譜柱上的電泳圖發(fā)現(xiàn)，其峰高峰形沒有顯著區(qū)別。而100μm的egcg在柱篩毛細管上的響應(yīng)值幾乎達到25mau，但同濃度進樣到注入了普通細胞的毛細管中時，峰的響應(yīng)值表現(xiàn)出顯著的降低拖尾展寬，這表明egcg與普通細胞之間存在非特異性相互作用；在超表達glut1細胞作為相互作用相的毛細管中，100μmegcg表現(xiàn)為貼附在基線上的一個寬的平伏峰形，存在較強的特異性相互作用。同樣，我們采用前期已經(jīng)建立的成熟的icce法進行了對比研究，icce法使用的毛細管色譜柱見圖1(c)，dmso和egcg分別在兩種方法中的不同毛細管柱上的電泳行為基本一致，進一步證明了本發(fā)明所述方法的可行性。

親和色譜中的色譜峰形的變化是化合物與固定相之間的特異性和非特性相互作用的結(jié)果。通常，由于化合物與固定相的解離速率高于結(jié)合速率，使得色譜峰表現(xiàn)為展寬，拖尾的非高斯峰形。在色譜容量一定的情況下，化合物峰形偏離高斯峰的程度與化合物的濃度相關(guān)。而nlc理論正好解釋了濃度與峰形變化的關(guān)系以及各種動力學(xué)參數(shù)的計算方法。本發(fā)明用glut1超表達的hek293細胞作為相互作用相的毛細管色譜柱對egcg進行電泳分析。所得的不對稱峰形可用非線性色譜模型進行解釋，并用軟件擬合峰形，計算結(jié)合常數(shù)(k)、結(jié)合速率常數(shù)(ka)、解離速率常數(shù)(kd)以及容量因子(k’)。將本方法所得結(jié)果與icce法所得結(jié)果分別進行計算并比較，具體見圖2，由此可見，本方法測定的egcg與glut1的結(jié)合動力學(xué)參數(shù)結(jié)果與icce法基本一致。

實施例2、glut1超表達的hek293細胞作為相互作用相的毛細管色譜柱在化合物篩選中的應(yīng)用

本發(fā)明所建立的篩選藥物新方法首先被用于篩選黃芩總黃酮提取物，結(jié)果見圖3(a)?？傸S酮提取物的色譜行為結(jié)果顯示，當(dāng)glut1超表達的hek293細胞作為相互作用相時，總黃酮提取物中的主要組分保留時間延遲，峰高降低，且某些組分的峰形嚴重拖尾，為進一步發(fā)現(xiàn)何種物質(zhì)與glut1發(fā)生特異相互作用提供了科學(xué)依據(jù)。

在此基礎(chǔ)上，新方法被用于篩選如圖4所示的22個化合物，主要為黃芩中的黃酮提取物、鏈霉菌屬代謝產(chǎn)物和芽孢桿菌屬代謝產(chǎn)物，分別研究了這些化合物在柱篩毛細管色譜柱、正常hek293細胞作為相互作用相的毛細管色譜柱、glut1超表達hek293細胞作為相互作用相的毛細管色譜柱中的色譜行為。觀察到fsb-4、fsb-6、fsb-7、fsb-8、sl-1、sl-2、sl-5、sl-6、sl-7、str-1～7在三種毛細管色譜柱中的色譜峰形基本保持不變，和dmso的峰形變化一致，屬于陰性化合物，如圖3(b)中顯示了其中的代表性fsb-4在三種毛細管中的對比峰形；相反，fsb-1、fsb-2、fsb-3、fsb-5、sl-3、sl-4在三種毛細管色譜柱中的峰形變化與egcg類似，如圖3(b)中顯示了其中代表性fsb-1在三種毛細管中的對比峰形，可見化合物在超表達glut1細胞作為相互作用相的毛細管中，保留時間延遲且峰高降低、拖尾嚴重，判斷它們與glut1存在特異性結(jié)合，屬于陽性化合物。我們對22個化合物進行了篩選，并通過nlc理論對篩選出的活性化合物的動力學(xué)參數(shù)進行了計算。對此我們同樣采用icce法進行了對比研究，結(jié)果顯示(圖5)，兩種方法所得22個化合物的毛細管電泳行為一致，即與glut1是否存在相互作用的篩選結(jié)果一致，且所得陽性化合物的動力學(xué)參數(shù)一致性良好。

葡萄糖競爭性結(jié)合實驗：為了驗證具有結(jié)合活性的化合物與glut1結(jié)合時是否占據(jù)的是葡萄糖分子與glut1結(jié)合的活性位點。本實驗設(shè)計了egcg、結(jié)合活性化合物fsb-1、fsb-2、fsb-3、fsb-5、sl-3、sl-4靶向glut1的葡萄糖競爭性結(jié)合實驗，使用超表達glut1的hek293細胞作為相互作用相的毛細管進行葡萄糖競爭性hpce實驗。以glut1為靶點，在緩沖液中分別添加不同質(zhì)量的葡萄糖，配制成含0mm、1mm、5mm和10mm葡萄糖的40mmpb緩沖溶液，四種緩沖液條件下分別進樣相同濃度的陽性化合物。對比陽性化合物在不同濃度葡萄糖緩沖液中的電泳行為，判斷它們與葡萄糖之間是否存在競爭性結(jié)合，從而判斷它們與glut1結(jié)合時是否占據(jù)葡萄糖的結(jié)合位點。其中代表egcg與葡萄糖競爭實驗的結(jié)果見圖3(c)，表明隨著緩沖液中加入葡萄糖濃度的增加，egcg逐漸釋放，峰高升高，峰形由有結(jié)合特點的拖尾展寬峰形變?yōu)闊o結(jié)合特點的窄而銳的峰形。這充分說明egcg與葡萄糖競爭性結(jié)合glut1上的活性位點，即egcg與glut1結(jié)合時占據(jù)的是葡萄糖結(jié)合位點。與其類似，fsb-1和fsb-3也展現(xiàn)出隨緩沖液中加入葡萄糖濃度增加而出現(xiàn)峰高升高，化合物釋放的現(xiàn)象。與此相反，隨著緩沖液中加入葡萄糖濃度增加，fsb-2和fsb-5、sl-3、sl-4的峰高、峰形沒有明顯變化，表明與葡萄糖結(jié)合glut1的位點不同，其中代表性化合物fsb-5的結(jié)果見圖3(c)。對此我們同樣通過icce法進行了競爭結(jié)合實驗對比研究，顯示兩種方法所得活性化合物與glut1結(jié)合時是否占據(jù)葡萄糖的位點一致。

實施例3、腫瘤細胞作為相互作用相的毛細管色譜柱對部分結(jié)合活性化合物的篩選

a549腫瘤細胞作為相互作用相的毛細管色譜柱的制備方法與glut1超表達的hek293細胞作為相互作用相的毛細管色譜柱的制備方法相同。本專利通過a549腫瘤細胞作為相互作用相的毛細管色譜柱，驗證了dmso、egcg、fsb-1和fsb-2與a549腫瘤細胞是否存在相互作用。如圖6可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)a549腫瘤細胞作為相互作用相時，dmso峰高峰形沒有顯著區(qū)別，電泳表現(xiàn)出典型的陰性化合物特點。而egcg、fsb-1和fsb-2表現(xiàn)為陽性化合物的特點，保留時間延遲且峰高降低、峰形明顯降低拖尾，與glut1超表達的hek293細胞作為相互作用相的結(jié)果一致，同時說明a549細胞表面的glut1受體高表達。

實施例4、離體肺組織或腫瘤組織等其他生物材料作為相互作用相的毛細管色譜柱的制備及對部分活性化合物的篩選

本發(fā)明所建立的藥物篩選新方法，相互作用相不僅可以是細胞(包括超表達glut1的細胞、腫瘤細胞等)，還可以是離體組織或腫瘤組織等其他生物材料。將小鼠正常肺組織、人源a549肺癌細胞建立的異種移植性腫瘤的腫瘤組織剝離后，用4％多聚甲醛避光固定12-48h后，置于75％乙醇中，保存在4℃冰箱待用。實驗時，將上述固定后的離體組織或者腫瘤組織注入柱篩毛細管中，長度為0.5-5mm，用40mmph7.4的磷酸鹽緩沖液沖洗平衡后備用。

圖7為離體肺組織(b)和腫瘤組織(c)作為相互作用相時的hpce圖。結(jié)果表明dmso在柱篩毛細管、離體肺組織作為相互作用相、腫瘤組織作為相互作用相的毛細管色譜柱上，由于離體肺組織和腫瘤組織采用穩(wěn)態(tài)形式，在一定程度上增加了系統(tǒng)的壓力，所以出峰時間出現(xiàn)延遲。但其他電泳行為基本一致，峰高峰形沒有顯著區(qū)別，展現(xiàn)出典型的陰性化合物特點。而通過對egcg、fsb-1、fsb-2在三種毛細管色譜柱中的峰形對比，可見這些化合物在離體肺組織作為相互作用相的毛細管色譜柱上峰形表現(xiàn)出一定的展寬，存在一定的非特異性相互作用；而在腫瘤組織作為相互作用相的毛細管上與離體肺組織相比，保留時間延遲且峰高降低更加明顯，拖尾嚴重，判斷它們與腫瘤組織之間存在特異性相互作用，進一步說明glut1在腫瘤組織中的高表達。由于icce法無法對化合物與離體組織的結(jié)合作用進行測定，本部分未通過icce法進行驗證，更加說明了本方法拓寬了應(yīng)用范圍，將不同的生物材料引入毛細管柱作為相互作用相用于研究分子間的相互作用，更具有實際應(yīng)用價值，可以通過研究人源腫瘤組織與靶向藥物的相互作用，提供結(jié)合動力學(xué)參數(shù)最優(yōu)的治療靶向藥物，為臨床治療腫瘤優(yōu)選治療靶向藥物奠定基礎(chǔ)，提供全新方法和科學(xué)依據(jù)。

實施例5、細胞水平和動物水平抗腫瘤活性實驗

針對hpce初步篩選得到的強陽性化合物，本實驗對egcg、fsb-1、fsb-2、fsb-3、sl-3、sl-4分別選取6個濃度點0μm、20μm、40μm、60μm、80μm、100μm，采用mtt法研究化合物對a549腫瘤細胞生長的作用。在酶聯(lián)免疫檢測儀od490nm處測量各孔的吸光值，對不同濃度的藥物組與不加藥組進行t-檢驗，具有顯著性差異的則說明在對應(yīng)濃度下該藥物對a549細胞具有抑制作用。同時，計算每個濃度下的平均抑制率，繪制抑制率-藥物濃度曲線，見圖8。本實驗結(jié)果是根據(jù)平行操作三次以上實驗情況統(tǒng)計得到。結(jié)果表明100μmegcg與不加藥組具有顯著差異，其他濃度組則沒有顯著性差異；20μm、40μm、60μm、80μm、100μm的fsb-1和sl-4與不加藥組都具有顯著差異；80μm、100μm的fsb-2、fsb-3與不加藥組都具有顯著差異，其他濃度則沒有顯著差異；各濃度的sl-3與不加藥組都不具有顯著差異。用excel擬合線性方程，計算出化合物的ic50值，見圖5。化合物的ic50值越小，表明藥物的抑制作用越強。由此可見，化合物的分子水平篩選結(jié)果與細胞水平抗腫瘤活性實驗結(jié)果基本一致。

針對hpce初步篩選得到的強陽性化合物以及體外抗腫瘤活性實驗結(jié)果，研究化合物egcg、fsb-1和fsb-2對小鼠體內(nèi)人非小細胞肺癌細胞(a549)腫瘤生長的作用。選用處于對數(shù)生長期的a549和6～8周齡的balb/nu-nu小鼠構(gòu)建裸鼠荷瘤模型，包括生理鹽水組作為空白對照組，給藥egcg(80mg/kg)作為陽性對照組，研究了fsb-1組(80mg/kg)和fsb-2組(80mg/kg)對于腫瘤模型進行藥效學(xué)評價。于實驗第1天稱重裸鼠并且于裸鼠右側(cè)腋下注射a549細胞(5×10⁶個/只)，注入細胞10d后(腫瘤達到約35mm³)，將裸鼠按照每組6只隨機分成4組，開始給藥。每三天給藥一次，每次給藥前對裸鼠進行體重稱重和瘤體積測量。共給藥9次，給藥后第27天對小鼠進行處死，剝離腫瘤、稱瘤重。計算每組瘤重的平均值及腫瘤抑制率，腫瘤抑制率＝(空白組平均瘤重-實驗組平均瘤重)/空白組平均瘤重×100％。圖9(a～e)顯示，與生理鹽水組相比，egcg、fsb-1和fsb-2對腫瘤抑制情況均有顯著性差異(***p<0.001,**p<0.01,*p<0.05)，抑瘤率分別為：71.51％,64.69％and61.73％。fsb-1和fsb-2對小鼠體重影響無顯著性差異，說明fsb-1和fsb-2毒性較??；但egcg組對小鼠體重影響與生理鹽水組相比有顯著性差異，這提示egcg可能有一定的副作用。

本文對一些具體的實施例進行了詳細的描述，然而這只是作為對發(fā)明目的實例說明，而不限制下述權(quán)利要求書的范圍。應(yīng)當(dāng)理解，對本文所述具體方案的不同取代、改變和修飾都不偏離本發(fā)明權(quán)利要求所定義的內(nèi)涵和外延，從而應(yīng)當(dāng)屬于本申請所要求保護的發(fā)明范圍。