本實用新型涉及一種與神經(jīng)退行性疾病產(chǎn)生有關(guān)的蛋白質(zhì)例如β-淀粉樣蛋白、tau蛋白、a-突觸核蛋白等的捕獲中采用的裝置。

背景技術(shù)：

世界人口在不斷的老齡化，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，目前全球有3560萬癡呆患者，到2030年這一數(shù)字將增加一倍，2050年這一數(shù)字將增加至三倍以上。癡呆類型包括阿爾茨海默病、帕金森氏病、亨廷頓舞蹈病等神經(jīng)退行性疾病。普遍認為大量錯誤折疊的蛋白質(zhì)，如β-淀粉樣蛋白（amyloid beta）、tau蛋白、a-突觸核蛋白（α-synuclein）在細胞內(nèi)聚集是神經(jīng)退行性疾病產(chǎn)生的物質(zhì)基礎(chǔ)。因此在開發(fā)針對這些疾病的治療藥物的過程中，需要有一種簡單易用的方法捕獲這些蛋白，并實時監(jiān)控這些物質(zhì)對于蛋白質(zhì)聚集的影響。

水凝膠是由交聯(lián)的聚合物鏈形成的三維聚合物空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。它不溶于水但親水性使其能夠容納大量的水。此外，可以通過調(diào)節(jié)聚合物濃度和前體的分子量來改變孔徑。其內(nèi)部多孔結(jié)構(gòu)可以將藥物分子包裹在聚合物網(wǎng)絡(luò)內(nèi)。此外，這種結(jié)構(gòu)也可以作為細胞封裝的支架：其納米級孔徑可以允許后續(xù)向細胞供應(yīng)營養(yǎng)物，但同時防止較大物質(zhì)如抗體或酶的滲透。此外，水凝膠的生物相容性使其能更好地模擬蛋白質(zhì)折疊的自然環(huán)境。

水凝膠通常分為物理凝膠和化學凝膠兩種。其中物理凝膠包括熱可逆凝膠，其在常溫下呈穩(wěn)定的凝膠態(tài)，但加熱后可轉(zhuǎn)變?yōu)槿芤?。但是，其中溫度的改變可能影響蛋白質(zhì)反應(yīng)速度，破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)。而化學凝膠使用較多的包括含有甲基丙烯酸酯或丙烯酸酯基團的超支化聚丙三醇（hPG）和聚乙二醇（PEG）。通過將這些大分子單體與光引發(fā)劑一同暴露于紫外線下進行快速交聯(lián)，或利用加熱手段引發(fā)自由基進行聚合。綜上，無論是利用加熱或紫外線輻照的方法，均會影響蛋白質(zhì)反應(yīng)，從而使得檢測結(jié)果不準確。此外，現(xiàn)有常規(guī)的物理凝膠和化學凝膠捕獲方法捕獲的不僅有錯誤折疊程度高的蛋白質(zhì)寡聚物和纖維，也會捕獲錯誤折疊程度低的小分子蛋白質(zhì)和部分小尺寸單體，無法對錯誤折疊程度高的蛋白質(zhì)寡聚物和纖維進行針對性研究。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本實用新型所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種在蛋白質(zhì)捕獲過程中采用的微流控芯片，基于該芯片并按照合適的工藝可以實現(xiàn)對錯誤折疊程度高的蛋白質(zhì)寡聚物和纖維進行針對性捕獲，以及同時可以獲得更準確的分析結(jié)果。

為解決以上技術(shù)問題，本實用新型采取的技術(shù)方案如下：

一種用于蛋白質(zhì)捕獲的微流控芯片，包括芯片本體，微流控芯片還包括形成于芯片本體上且在一端部相交匯構(gòu)成第一聚焦區(qū)的第一微通道、第二微通道和第三微通道，形成于芯片本體上且在一端部相交匯構(gòu)成第二聚焦區(qū)的第四微通道、第五微通道和第六微通道，形成于芯片本體上的第七微通道，其中第四微通道的另一端與第一聚焦區(qū)連通，第七微通道的一端與第二聚焦區(qū)連通。

優(yōu)選地，在各微通道的進口端設(shè)置有過濾器。

優(yōu)選地，第一微通道、第二微通道和第三微通道分別用于通入超支化聚丙三醇水溶液、雙巰基聚乙二醇水溶液以及帶有標記的待捕獲蛋白肽溶液，第五微通道和第六微通道內(nèi)用于通入油相物質(zhì)。

優(yōu)選地，芯片本體由聚二甲基硅氧烷構(gòu)成。

優(yōu)選地，微流控芯片還包括用于將各微通道封閉的表面平整的基底。

優(yōu)選地，基底為顯微鏡用載玻片。

本實用新型微流控芯片可通過軟刻蝕法制作，具體步驟如下：

i)將設(shè)計好的第一微通道、第二微通道、第三微通道、第四微通道、第五微通道以及第六微通道印刷在醋酸膜上，并將醋酸膜放置于涂覆有光刻膠的硅晶片頂部，經(jīng)過紫外光照射，得到芯片模板；

ii)將聚二甲基硅氧烷預(yù)聚物和其交聯(lián)劑灌注在所述芯片模板上，進行固化，將固化的聚二甲基硅氧烷模具剝離芯片模板，并對各所述微通道的出入口進行壓力穿孔，之后運用表面平整的基底對各微通道進行密封；

iii)將表面疏水劑注入各微孔通道并靜置，使得微通道表面疏水即得所述微流控芯片。

利用本實用新型進行蛋白質(zhì)捕獲的一種方法如下：

（1）使超支化聚丙三醇水溶液、雙巰基聚乙二醇水溶液、帶有標記的待捕獲蛋白肽單體溶液分別注入微流控芯片的第一微通道、第二微通道和第三微通道中，三者在第一聚焦區(qū)混合得到混合液，所述混合液經(jīng)第四微通道流至第二聚焦區(qū)并被從第五和第六微通道注入的油相物質(zhì)包裹，獲得微液滴，所述微液滴內(nèi)，所述超支化聚丙三醇和雙巰基聚乙二醇發(fā)生巰基-烯的點擊化學反應(yīng)形成水凝膠，得到外層為油相內(nèi)層為含有蛋白肽溶液的微凝膠；

（2）對所述微凝膠進行培養(yǎng)使其中的蛋白肽單體發(fā)生折疊聚集，得到外層為油相內(nèi)層含有不同折疊程度的聚合蛋白的微凝膠；

（3）向經(jīng)過步驟（2）的體系中加入脫乳化劑以破壞所述油相外層并進行清洗以除去所述微凝膠內(nèi)小于所述微凝膠孔道的聚合蛋白或未聚合蛋白，即得捕獲了蛋白的水凝膠微籠，所述捕獲了蛋白的水凝膠微籠可用于后續(xù)的檢測分析。

根據(jù)本實用新型所述蛋白肽單體為人β淀粉樣蛋白1-40，人β淀粉樣蛋白1-42，tau蛋白或a-突觸核蛋白。

根據(jù)本實用新型所述油相物質(zhì)優(yōu)選為選自氟化液、礦物類油、植物油及脂肪酸中的一種或多種的組合。

根據(jù)本實用新型的一個具體且優(yōu)選方面，所述脫乳化劑為全氟辛醇油，所述清洗采用pH 7-8的磷酸緩沖溶液，在離心旋杯柱中進行清洗。

根據(jù)本實用新型，聚乙二醇雙胺、超支化聚丙三醇的分子量可根據(jù)需要的微籠孔徑來設(shè)計。優(yōu)選地，所述聚乙二醇雙胺的分子量為1-5 kDa，超支化聚丙三醇的分子量為10-30 kDa。更優(yōu)選地，所述聚乙二醇雙胺的分子量為2-3 kDa，超支化聚丙三醇的分子量為15-25 kDa。

根據(jù)本實用新型，所述微凝膠的大小約為30-80微米，優(yōu)選為40-60為微米，更優(yōu)選為45-55微米。

由于以上技術(shù)方案的實施，本實用新型與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點：

本實用新型創(chuàng)新提出的微流控芯片，可以為采用巰基-烯點擊反應(yīng)結(jié)合微流控技術(shù)捕獲蛋白質(zhì)提供必要的裝置，其可獲得單分散性的水凝膠蛋白質(zhì)捕獲微籠。

附圖說明

圖1為微流控芯片的結(jié)構(gòu)示意圖，其中，1、芯片本體；2、第一微通道；3、第二微通道；4、第三微通道；5、第四微通道；6、第五微通道；7、第六微通道；8、過濾器；A、第一聚焦區(qū)；B、第二聚焦區(qū)；

圖2顯示了利用微流控芯片制備外層為油相內(nèi)層為含有蛋白肽溶液的微凝膠的示意圖；

圖3為實施例制備的微液滴和微籠的光學顯微鏡圖；

圖4為實施例制備的微液滴和微籠經(jīng)光學顯微鏡圖觀察并繪制的粒徑分布圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施例對本實用新型做進一步詳細的說明，但本實用新型并不限于以下實施例。實施例中未注明的條件為常規(guī)實驗條件。

實施例1 微流控芯片的設(shè)計和制作

微流控芯片設(shè)計為如圖2所示，其包括芯片本體1，形成于芯片本體1上且在一端部相交匯構(gòu)成第一聚焦區(qū)A的第一微通道2、第二微通道3和第三微通道4，形成于芯片本體1上且在一端部相交匯構(gòu)成第二聚焦區(qū)B的第四微通道5、第五微通道6和第六微通道7，以及形成于芯片本體1上的第七微通道9，其中第四微通道5的另一端與第一聚焦區(qū)A連通，第七微通道9的一端與第二聚焦區(qū)B連通。在第一至第六微通道7的進口端分別設(shè)置有過濾器8。本例中，過濾器8的過濾精度為1微米。

以軟刻蝕法制作微流控芯片，具體步驟如下：

i)將設(shè)計好的各微通道印刷在醋酸膜上，并將醋酸膜放置于涂覆有光刻膠的硅晶片頂部，經(jīng)過紫外光照射，即得芯片模板；

ii)將聚二甲基硅氧烷預(yù)聚物和其交聯(lián)劑灌注在芯片模板上，進行固化；將固化的聚二甲基硅氧烷模具剝離芯片模板，并對各所述微通道的出入口進行壓力穿孔，之后運用表面平整的基底（例如顯微鏡用載玻片）對各微通道進行密封；

iii)將表面疏水劑（如玻璃鍍膜劑Aquapel）注入微孔道并靜置5分鐘，使得通道表面疏水，最后加裝過濾器即得微流控芯片。

實施例2 微流控芯片應(yīng)用于捕獲人β淀粉樣蛋白1-42蛋白

（1）制備外層為油相內(nèi)層為含有蛋白肽溶液的微凝膠

將2-亞氨基硫烷鹽酸鹽、聚乙二醇雙胺（2 kDa）以及超支化聚丙三醇（20 kDa）分別溶解在pH 7.4的Napi緩沖溶液中，獲得濃度分別為21g/L、300g/L和1000g/L的2-亞氨基硫烷鹽酸鹽、聚乙二醇雙胺以及超支化聚丙三醇的水溶液。

將2-亞氨基硫烷鹽酸鹽水溶液與聚乙二醇雙胺水溶液以體積比0.75:1混合，室溫下攪拌30分鐘，使二者反應(yīng)轉(zhuǎn)化成雙巰基聚乙二醇，得到雙巰基聚乙二醇水溶液。

將超支化聚丙三醇水溶液及雙巰基聚乙二醇水溶液分別注入200微升固定針氣密注射器中。

用HiLyte Fluor? 488對人β淀粉樣蛋白1-42肽單體側(cè)鏈的N-末端進行熒光標記，并溶解于1wt%的氨水中做為預(yù)備蛋白肽單體溶液。將預(yù)備蛋白肽單體溶液以pH 7.4的磷酸緩沖溶液稀釋成所需濃度（如5微米），得到HiLyte Fluor? 488修飾的人β淀粉樣蛋白1-42的水溶液（以下簡稱蛋白肽溶液），注入注射器，并置于冰浴中。

參見圖2，取超支化聚丙三醇水溶液、雙巰基聚乙二醇水溶液、蛋白肽溶液分別以流速200微升/小時注入微流控芯片的第一微通道、第二微通道和第三微通道，三者在芯片的第一聚焦區(qū)混合得到混合液?；旌弦鹤缘谒奈⑼ǖ懒魅氲诙劢箙^(qū)，并在第二聚焦區(qū)被以流速2000微升/小時注入的氟化液HFE-7500包裹形成單分散微液滴(微液滴的光學顯微鏡圖參見圖3A，粒徑分布圖參見圖4A，微液滴大小為約48微米，且呈現(xiàn)非常好的單分散性)，微液滴從第七微通道流出收集。微液滴在芯片上的生成過程通過安裝在IX71倒置顯微鏡的單色幻影V7.2相機進行成像。然后利用LabVIEW 8.2計算液滴的生成頻率，約為1.2千赫茲。在這過程中， 超支化聚丙三醇和雙巰基聚乙二醇在微液滴中發(fā)生巰基-烯的點擊化學反應(yīng)，并快速形成水凝膠。

（2）培養(yǎng)

將步驟（1）制備得到的外層為油相內(nèi)層為含有蛋白肽溶液的微凝膠置于37℃下培養(yǎng)一定時間，使蛋白肽折疊聚集。當培養(yǎng)結(jié)束，冰浴冷卻60秒淬滅反應(yīng)。

（3）破壞微凝膠的油相外層并進行清洗

向經(jīng)過步驟（2）的體系中加入全氟辛醇油，打開微液滴的油相外層，并用pH 7.4的磷酸緩沖溶液于離心旋杯柱（0.45微米孔徑）中清洗3次，并保存在pH7.4的磷酸緩沖溶液中，得到內(nèi)含高程度聚合蛋白的水凝膠微籠，(水凝膠微籠的光學顯微鏡圖參見圖3B，對應(yīng)的粒徑分布圖參見圖4B，微籠大小為約47微米，且呈現(xiàn)非常好的單分散性)。

上述實施例只為說明本實用新型的技術(shù)構(gòu)思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術(shù)的人士能夠了解本實用新型的內(nèi)容并據(jù)以實施，并不能以此限制本實用新型的保護范圍。凡根據(jù)本實用新型精神實質(zhì)所作的等效變化或修飾，都應(yīng)涵蓋在本實用新型的保護范圍之內(nèi)。