本發(fā)明涉及血液取樣、分離領(lǐng)域，尤其涉及一種富血小板血漿一體化制備工藝及其產(chǎn)品的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、富血小板血漿(?platelet-rich?plasma，prp)是外周血通過分離后得到的富含高濃度血小板的血漿。prp含有多種生長因子和其他生物活性物質(zhì)，這些物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的生長至關(guān)重要，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和分化。近年來，prp在促進(jìn)組織再生與修復(fù)方面已被廣泛應(yīng)用于骨缺損治療、皮膚創(chuàng)面修復(fù)、整形美容以及運(yùn)動(dòng)損傷治療等領(lǐng)域，并取得了良好的效果。

2、目前，制備prp主要有二次離心和一次離心兩種工藝。

3、二次離心工藝是將全血在第一次離心（低速離心）后，去除部分紅細(xì)胞和白細(xì)胞，再將第一次離心后的上清液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心容器中，再次離心（高速離心），去除殘留紅細(xì)胞和白細(xì)胞，此時(shí)得到的上清液即為富血小板血漿（即prp）。這種工藝操作較為復(fù)雜，且因?yàn)閮纱坞x心的離心力大小及離心時(shí)間不同，所以難以準(zhǔn)確控制，得到的prp中血小板的回收率較低，且易混入較多紅細(xì)胞。此外，二次離心需要更換容器，無法避免與外界環(huán)境多次接觸，從而增加了prp污染的風(fēng)險(xiǎn)。

4、一次離心工藝是將全血經(jīng)一次離心，實(shí)現(xiàn)紅細(xì)胞、貧血小板血漿ppp和富血小板血漿prp的分層，但離心后的分離注射依然需要借助其它裝置，操作繁瑣且分離注射過程中也存在染菌風(fēng)險(xiǎn)。并且，這種工藝通常需要配備專有的離心機(jī)和裝置，制備成本較高。同時(shí)，由于不同分層的血液濃度和血液黏稠度等指標(biāo)個(gè)體差異大，離心后上下層的分界線不清晰，對(duì)操作者要求較高，得到的prp中血小板的回收率不穩(wěn)定且偏低。

5、另有一些現(xiàn)有prp制備工藝采用分離膠加一次離心工藝，采血離心和分離注射兩套裝置分步操作，較為煩瑣且具有一定的染菌風(fēng)險(xiǎn)，并且，雖然血清分離膠可以在血清和血塊之間形成隔離層從而把血清和血塊分開，但是由于現(xiàn)有的分離膠具有一定的粘附性，使得血小板與白細(xì)胞緊密粘附在分離膠表面，僅通過晃動(dòng)離心管難以使分離膠表面的血小板與白細(xì)胞重新懸浮于血清，因此，血小板的回收率低；需借助注射器吹打分離膠表面使血小板與白細(xì)胞的重新懸浮于血清，但這樣做不僅會(huì)增加操作的難度，使操作復(fù)雜化，而且，吹打步驟也增加了染菌風(fēng)險(xiǎn)；另外，吹打力度、角度等操作條件的差異會(huì)導(dǎo)致血小板回收率存在較大差異，因此，血小板回收率的穩(wěn)定性不佳。

6、有授權(quán)公告號(hào)為cn?105820574?b的中國專利公布了一種有機(jī)硅血清分離膠及其制備方法，其通過多種有機(jī)硅材料的協(xié)同使用來提高分離膠的觸變性（觸變性是指物體受到剪切時(shí)，稠度變小，停止剪切時(shí)，稠度又增加的性質(zhì)），從而達(dá)到同時(shí)解決分離效果不穩(wěn)定以及分離膠貯存穩(wěn)定性不佳的問題。但該專利并未提及分離膠的疏水性（疏水性是指物質(zhì)與水之間的排斥力，即物質(zhì)不容易被水浸潤、吸收或溶于水的性質(zhì)）。

7、因此，現(xiàn)有的prp制備工藝存在著無法同時(shí)兼顧操作簡(jiǎn)單化、染菌風(fēng)險(xiǎn)低，以及穩(wěn)定獲得較高的血小板回收率的問題。并且，離心管裝置體積有限，裝血量適配范圍較小，不同裝血量需采用不同規(guī)格的離心裝置，或者采用同一規(guī)格的離心裝置重復(fù)制備，較為繁瑣。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明的目的一在于提供一種富血小板血漿一體化制備工藝，該工藝基于一體化的富血小板血漿制備裝置進(jìn)行，并采用特有的分離膠配方，從而能夠同時(shí)兼顧操作簡(jiǎn)單化、染菌風(fēng)險(xiǎn)低、離心樣品適配范圍寬，以及穩(wěn)定獲得較高的血小板回收率。

2、富血小板血漿一體化制備工藝，其是基于一體化的富血小板血漿制備裝置進(jìn)行的，所述一體化的富血小板血漿制備裝置包括離心套管和血液收集管，所述血液收集管同軸可拆卸裝于所述離心套管內(nèi)，且所述血液收集管為針筒；所述富血小板血漿一體化制備工藝包括以下步驟：

3、s1：將分離膠與血液樣本混合于所述血液收集管內(nèi)，再將血液收集管裝于所述離心套管內(nèi)進(jìn)行離心；其中所述的分離膠的配方中各組分的重量份組成為：

4、丙烯酸酯90～110份、

5、過氧化苯甲酰1～4份、

6、二氧化硅1～4份、

7、硅烷偶聯(lián)劑0.01～0.15份、

8、有機(jī)溶劑80～100份、

9、以及疏水劑，所述疏水劑為納米聚硅氧烷、納米氟化聚乙烯、納米全氟乙烯丙烯共聚物、納米氟硅烷中的任一種以上，且所述疏水劑的添加量以所述分離膠的水接觸角達(dá)到130～180度來確定；

10、s2：經(jīng)離心后所述血液收集管內(nèi)從上到下依次形成貧血小板層（即ppp層）、血小板與白細(xì)胞層、分離膠層和紅細(xì)胞層共四層，血小板和白細(xì)胞層附著在所述分離膠層的表面；將分層得到的ppp層中位于上方的液體體積為70%～80%的ppp轉(zhuǎn)移，再輕輕搖動(dòng)血液收集管用以懸浮血小板和白細(xì)胞于剩下的ppp內(nèi)，剩下的ppp與血小板、白細(xì)胞一起形成的懸浮液為所述富血小板血漿，即prp。

11、本發(fā)明人從降低分離膠對(duì)血小板的吸收作用出發(fā)，通過在分離膠中添加疏水劑，來增加分離膠的疏水性，并通過對(duì)疏水劑的種類和添加量進(jìn)行限定，使得分離膠的水接觸角達(dá)到130度以上，獲得超疏水性的分離膠，使離心后各層的分界線變得清晰的同時(shí)，降低分離膠對(duì)血小板與白細(xì)胞層的吸收作用，使得輕輕搖動(dòng)血液收集管即可實(shí)現(xiàn)血小板和白細(xì)胞脫離分離膠而懸浮于ppp內(nèi)，無需借助注射器吹打分離膠表面使血小板和白細(xì)胞脫離分離膠，簡(jiǎn)化操作且操作更簡(jiǎn)單，利于提高操作的穩(wěn)定性，也避免了吹打帶來的染菌風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)，血小板和白細(xì)胞懸浮于剩下的ppp內(nèi)，提高了prp的血小板回收率，能夠穩(wěn)定獲得高回收率和高富集度的prp。與此同時(shí)，由于本發(fā)明的所述血液收集管為針筒，即采用針筒式采血裝置，在離心后取出所述針筒并向上推動(dòng)芯桿，即可將針筒內(nèi)的prp進(jìn)行注射靜脈或進(jìn)行噴涂，使用非常方便；并且，本發(fā)明的特有的富血小板血漿制備裝置結(jié)構(gòu)，使得采血、離心以及分離注射均通過同一根血液收集管就可完成，操作簡(jiǎn)單，無需轉(zhuǎn)移料液，為臨床醫(yī)務(wù)工作者應(yīng)用prp提供了便利的同時(shí)，也避免轉(zhuǎn)移料液過程中帶來污染和料液損失，從而進(jìn)一步降低染菌風(fēng)險(xiǎn)和提高有效成分如血小板的回收率。

12、所述的硅烷偶聯(lián)劑為六甲基二硅氮烷、乙烯基三甲氧基硅烷、乙烯基三乙氧基硅烷中的任一種以上。

13、所述的有機(jī)溶劑為二甲基戊烷、3-甲基已烷、甲基環(huán)已烷、正庚烷、乙酸乙酯中的任一種以上。

14、所述的丙烯酸酯為甲基丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丁酯中的任一種以上。

15、所述的二氧化硅為未經(jīng)疏水預(yù)處理的二氧化硅,其比表面積100-380m2/g,堆積密度為60-100kg/m,碳原子質(zhì)量百分比為2.5-5.0%,水分含量在0.1-0.3wt%。

16、為了實(shí)現(xiàn)所述分離膠的水接觸角達(dá)到130～180度，所述疏水劑的添加量通常在1～3份。

17、進(jìn)一步的，在上述步驟s1中所述血液樣本與所述分離膠之間的體積比控制在3：1～20：1之間，離心時(shí)的離心力為1000～3000?×g之間，離心時(shí)間為3～15?min，分層得到的富血小板血漿中血小板濃度高,同時(shí)，血小板回收率高（80%以上）。

18、進(jìn)一步的，所述針筒的活塞和芯桿之間為可拆卸連接。所述針筒的活塞與芯桿之間可拆卸連接的設(shè)計(jì)，能夠避免芯桿抽出時(shí)其占用空間的增大，使得所述富血小板血漿制備裝置可適用于常規(guī)離心機(jī)，成本較低；同時(shí)，離心樣品適配范圍寬（用于50ml管的離心機(jī)，對(duì)應(yīng)的離心樣品體積范圍可以在2～30?ml）。

19、進(jìn)一步的，在離心時(shí)所述針筒的頭端朝上置于所述離心套管內(nèi)。離心完成后所述針筒內(nèi)部從頭端到尾端依次分為四層，ppp層、血小板與白細(xì)胞層、分離膠層以及rbc層（紅細(xì)胞層）。

20、進(jìn)一步的，所述針筒的前端連接有針頭組件；所述針頭組件為靜脈穿刺針組件，所述針筒的外壁上設(shè)有用于收納所述靜脈穿刺針組件的針頭的針頭收納倉，針頭收納倉實(shí)現(xiàn)了對(duì)所述靜脈穿刺針組件的針頭的收納，使得采血后無需馬上拔掉所述靜脈穿刺針組件，減少血液與外界接觸，降低污染風(fēng)險(xiǎn)。

21、進(jìn)一步的，所述活塞尾端固定連接有一活塞連接軸，所述活塞連接軸上開設(shè)有旋接槽，所述芯桿的前端外周壁上設(shè)有外螺紋，所述芯桿的外螺紋與所述旋接槽的內(nèi)壁螺紋配合實(shí)現(xiàn)連接。針筒裝入離心套管后，取下所述芯桿進(jìn)行離心；針筒取出時(shí)，再將所述芯桿裝回。

22、本發(fā)明的目的二在于根據(jù)本發(fā)明的目的一所述富血小板血漿一體化制備工藝制得的prp在皮膚創(chuàng)面修復(fù)方面的應(yīng)用。

23、進(jìn)一步的，上述步驟s2中分層得到的ppp層中位于上方的液體體積為70%～80%的ppp轉(zhuǎn)移并收集得到ppp；所述ppp與所述prp按比例混合后獲得血小板濃度分別為1～5%的prp稀釋血清，并將所述prp稀釋血清用于皮膚創(chuàng)面修復(fù)。本發(fā)明人通過cck-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血小板濃度分別為1%、3%?、5%的prp稀釋血清所對(duì)應(yīng)的3t3細(xì)胞增殖率，相對(duì)于空白組均有所提升。特別是：當(dāng)血小板濃度分別為3%時(shí)，cck-8檢測(cè)結(jié)果顯示3t3細(xì)胞增殖率最高，為206.13%。與此同時(shí)，當(dāng)血小板濃度分別為3%時(shí)，細(xì)胞遷移結(jié)果顯示作用時(shí)間48小時(shí)后3t3細(xì)胞遷移率最優(yōu)，達(dá)到99.81%。

24、優(yōu)選的，先將所述prp、所述ppp或所述prp稀釋血清中任一項(xiàng)進(jìn)行活化后再用于皮膚創(chuàng)面修復(fù)。更進(jìn)一步的，所述活化工藝采用激活劑進(jìn)行活化或采用反復(fù)凍融的方式進(jìn)行活化，采用激活劑進(jìn)行活化時(shí)所述激活劑為終濃度為0.1～3%的cacl2溶液、終濃度為50～3000u的凝血酶中的任一種以上；采用反復(fù)凍融的方式進(jìn)行活化時(shí)所述反復(fù)凍融的條件為：-80～45℃，1～5次循環(huán)。