本發(fā)明涉及層析介質(zhì)領(lǐng)域，特別涉及一種新型層析介質(zhì)改性方法。

背景技術(shù)：

1、層析是一種分離混合物中各種成分的技術(shù)，層析介質(zhì)則在層析中起到關(guān)鍵作用，具有能與混合物中的各種成分發(fā)生各種互作的特性。具體而言，當(dāng)含有多種成分的混合物通過層析介質(zhì)時(shí)，由于各成分與介質(zhì)相互作用（如親和力、吸附能力等）的差異，使得各種成分在介質(zhì)中的移動(dòng)速度不同，從而實(shí)現(xiàn)分離。

2、常見的層析介質(zhì)包括瓊脂糖、葡聚糖、纖維素等天然高分子材料以及一些合成的聚合物等，可以根據(jù)不同的需求對(duì)其進(jìn)行修飾和改性，以達(dá)到不同的分離目的，例如分離蛋白質(zhì)、核酸或小分子化合物等。層析介質(zhì)的性質(zhì)如孔徑大小、表面積、化學(xué)穩(wěn)定性等對(duì)層析分離的效果和效率具有重要影響。

3、瓊脂糖層析常用于生物材料如細(xì)胞器、蛋白質(zhì)或核酸等的分離。為了在某些情況下獲得更好的分離效果，可以對(duì)瓊脂糖介質(zhì)進(jìn)行改性。傳統(tǒng)的瓊脂糖層析介質(zhì)改性方法通常是以瓊脂糖微球?yàn)榛|(zhì)，在瓊脂糖孔道表面引入一種高活性基團(tuán)，并基于活性基團(tuán)偶聯(lián)所需的配基，從而提高親和力，優(yōu)化分離效果。然而隨著科學(xué)研究和工業(yè)應(yīng)用的不斷發(fā)展，對(duì)瓊脂糖介質(zhì)的性能如載量也提出了更高的要求。因此，提供一種優(yōu)化介質(zhì)載量的改性方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、有鑒于此，本發(fā)明提供了一種新型層析介質(zhì)改性方法，能提高層析介質(zhì)的功能基團(tuán)含量進(jìn)而有利于提高蛋白載量、陰離子離子容量、陽離子離子容量等。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供以下技術(shù)方案：

3、本發(fā)明提供了表面以多糖修飾的微球，所述多糖包括瓊脂糖，所述微球包括磁性瓊脂糖微球、6ff瓊脂糖微球或4ff瓊脂糖微球，其通過活化后所述多糖的羥基與雙功能單體1反應(yīng)，再與雙功能單體2反應(yīng)獲得；

4、所述活化包括引入環(huán)氧基團(tuán)；

5、所述雙功能單體1的其中一個(gè)活性基團(tuán)r1為巰基、氨基、胺基或羥基，另一個(gè)活性基團(tuán)r2為羧基、胺基、氨基、季銨基團(tuán)或磺酸基；

6、所述雙功能單體2的其中一個(gè)活性基團(tuán)r3為鹵代基，另一個(gè)活性基團(tuán)r4為羧基、胺基、氨基、季銨基團(tuán)或磺酸基。

7、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述微球經(jīng)過以下步驟改性：

8、步驟（a1）：采用環(huán)氧氯丙烷法活化所述微球，獲得活化微球；

9、步驟（a2）：清洗所述活化微球，并與所述雙功能單體1混合，攪拌，清洗，獲得一次改性微球；

10、步驟（a3）：將所述一次改性微球與所述雙功能單體2混合，震蕩，清洗，獲得二次改性微球，完成改性。

11、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述微球包括磁性瓊脂糖微球、6ff瓊脂糖微球或4ff瓊脂糖微球。

12、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述微球的所述活性基團(tuán)r1為巰基，所述活性基團(tuán)r2為羧基。

13、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述微球的所述活性基團(tuán)r1為氨基，所述活性基團(tuán)r2為羧基。

14、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述微球的所述活性基團(tuán)r1為亞氨基，所述活性基團(tuán)r2為羧基。

15、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述微球的所述活性基團(tuán)r1為胺基，所述活性基團(tuán)r2為胺基。

16、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述微球的所述活性基團(tuán)r1為氨基，所述活性基團(tuán)r2為胺基。

17、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述微球的所述活性基團(tuán)r1為巰基，所述活性基團(tuán)r2為磺酸基。

18、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述微球的所述活性基團(tuán)r1為氨基，所述活性基團(tuán)r2為磺酸基。

19、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述微球的所述活性基團(tuán)r3為氯原子，所述活性基團(tuán)r4為羧基。

20、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述微球的所述活性基團(tuán)r3為溴原子，所述活性基團(tuán)r4為羧基。

21、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述微球的所述活性基團(tuán)r3為氯原子，所述活性基團(tuán)r4為磺酸基。

22、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述微球的所述活性基團(tuán)r3為氯原子，所述活性基團(tuán)r4為季銨基團(tuán)。

23、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述微球的所述活性基團(tuán)r3為氯原子，所述活性基團(tuán)r4為胺基。

24、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述微球的所述雙功能單體1為巰基丙酸、氨基苯甲酸、亞氨基二乙酸、聚乙烯亞胺、n,n-二乙基乙二胺、3-巰基-1-丙磺酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸鈉、3-氨基丙磺酸鈉或2-巰基乙烷磺酸鈉。

25、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述微球的所述雙功能單體2為3-氯丙酸、溴代巴豆酸、2-氯乙基磺酸鈉、3-氯-2-羥丙基三甲基氯化銨或氯乙酰胺。

26、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述微球通過以下步驟改性：

27、步驟（c1）：采用naoh分散微球，并與還原劑混合，反應(yīng)，再與環(huán)氧氯丙烷混合，反應(yīng)，獲得活化微球；

28、步驟（c2）：清洗所述活化微球，改用碳酸鈉分散，并與所述巰基丙酸混合，攪拌，清洗，改用水分散，獲得一次改性微球；

29、步驟（c3）：將所述一次改性微球與所述3-氯丙酸混合，震蕩，與催化劑混合，反應(yīng)，清洗，獲得二次改性微球，完成改性。

30、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述微球通過以下步驟改性：

31、步驟（d1）：采用naoh分散微球，并與還原劑混合，反應(yīng)，再與環(huán)氧氯丙烷混合，反應(yīng)，獲得活化微球；

32、步驟（d2）：清洗所述活化微球，改用碳酸鈉分散，并與所述氨基苯甲酸混合，攪拌，清洗，改用水分散，獲得一次改性微球；

33、步驟（d3）：將所述一次改性微球與所述溴代巴豆酸混合，震蕩，與催化劑混合，反應(yīng)，清洗，獲得二次改性微球，完成改性。

34、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述微球通過以下步驟改性：

35、步驟（e1）：采用naoh分散微球，并與還原劑混合，反應(yīng)，再與環(huán)氧氯丙烷混合，反應(yīng)，獲得活化微球；

36、步驟（e2）：清洗所述活化微球，改用碳酸鈉分散，并與所述3-巰基-1-丙磺酸鈉混合，攪拌，清洗，改用水分散，獲得一次改性微球；

37、步驟（e3）：將所述一次改性微球與所述2-氯乙基磺酸鈉混合，震蕩，與催化劑混合，反應(yīng)，清洗，獲得二次改性微球，完成改性。

38、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述微球通過以下步驟改性：

39、步驟（f1）：采用naoh分散微球，并與還原劑混合，反應(yīng)，再與環(huán)氧氯丙烷混合，反應(yīng)，獲得活化微球；

40、步驟（f2）：清洗所述活化微球，改用碳酸鈉分散，并與所述3-氨基丙磺酸鈉混合，攪拌，清洗，改用水分散，獲得一次改性微球；

41、步驟（f3）：將所述一次改性微球與所述2-氯乙基磺酸鈉混合，震蕩，與催化劑混合，反應(yīng)，清洗，獲得二次改性微球，完成改性。

42、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述微球通過以下步驟改性：

43、步驟（g1）：采用naoh分散微球，并與還原劑混合，反應(yīng)，再與環(huán)氧氯丙烷混合，反應(yīng)，獲得活化微球；

44、步驟（g2）：清洗所述活化微球，改用碳酸鈉分散，并與所述聚乙烯亞胺混合，攪拌，清洗，改用水分散，獲得一次改性微球；

45、步驟（g3）：將所述一次改性微球與所述3-氯-2-羥丙基三甲基氯化銨混合，震蕩，與催化劑混合，反應(yīng)，清洗，獲得二次改性微球，完成改性。

46、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述微球通過以下步驟改性：

47、步驟（h1）：采用naoh分散微球，并與還原劑混合，反應(yīng)，再與環(huán)氧氯丙烷混合，反應(yīng)，獲得活化微球；

48、步驟（h2）：清洗所述活化微球，改用碳酸鈉分散，并與所述n,n-二乙基乙二胺混合，攪拌，清洗，改用水分散，獲得一次改性微球；

49、步驟（h3）：將所述一次改性微球與所述氯乙酰胺混合，震蕩，與催化劑混合，反應(yīng)，清洗，獲得二次改性微球，完成改性。

50、本發(fā)明還提供了層析介質(zhì)，包括上述微球。

51、本發(fā)明還提供了表面以多糖修飾的微球的改性方法，所述多糖包括瓊脂糖，所述微球包括磁性瓊脂糖微球、6ff瓊脂糖微球或4ff瓊脂糖微球，包括：活化所述多糖的羥基后與雙功能單體1反應(yīng)，再與雙功能單體2反應(yīng)，完成改性；

52、所述活化包括引入環(huán)氧基團(tuán)；

53、所述雙功能單體1的其中一個(gè)活性基團(tuán)r1為巰基、氨基、胺基或羥基，另一個(gè)活性基團(tuán)r2為羧基、胺基、氨基、季銨基團(tuán)或磺酸基；

54、所述雙功能單體2的其中一個(gè)活性基團(tuán)為r3鹵代基，另一個(gè)活性基團(tuán)r4為羧基、胺基、氨基、季銨基團(tuán)或磺酸基。

55、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述改性方法包括以下步驟：

56、步驟（b1）：采用環(huán)氧氯丙烷法活化所述微球，獲得活化微球；

57、步驟（b2）：清洗所述活化微球，并與所述雙功能單體1混合，攪拌，清洗，獲得一次改性微球；

58、步驟（b3）：將所述一次改性微球與所述雙功能單體2混合，震蕩，清洗，獲得二次改性微球，完成改性。

59、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述改性方法所述的微球包括磁性瓊脂糖微球、6ff瓊脂糖微球或4ff瓊脂糖微球。

60、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述改性方法的所述活性基團(tuán)r1為巰基，所述活性基團(tuán)r2為羧基。

61、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述改性方法的所述活性基團(tuán)r1為氨基，所述活性基團(tuán)r2為羧基。

62、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述改性方法的所述活性基團(tuán)r1為亞氨基，所述活性基團(tuán)r2為羧基。

63、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述改性方法的所述活性基團(tuán)r1為胺基，所述活性基團(tuán)r2為胺基。

64、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述改性方法的所述活性基團(tuán)r1為氨基，所述活性基團(tuán)r2為胺基。

65、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述改性方法的所述活性基團(tuán)r1為巰基，所述活性基團(tuán)r2為磺酸基。

66、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述改性方法的所述活性基團(tuán)r1為氨基，所述活性基團(tuán)r2為磺酸基。

67、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述改性方法的所述活性基團(tuán)r3為氯原子，所述活性基團(tuán)r4為羧基。

68、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述改性方法的所述活性基團(tuán)r3為溴原子，所述活性基團(tuán)r4為羧基。

69、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述改性方法的所述活性基團(tuán)r3為氯原子，所述活性基團(tuán)r4為磺酸基。

70、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述改性方法的所述活性基團(tuán)r3為氯原子，所述活性基團(tuán)r4為季銨基團(tuán)。

71、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述改性方法的所述活性基團(tuán)r3為氯原子，所述活性基團(tuán)r4為胺基。

72、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述改性方法所述的雙功能單體1為巰基丙酸、氨基苯甲酸、亞氨基二乙酸、聚乙烯亞胺、n,n-二乙基乙二胺、3-巰基-1-丙磺酸鈉、對(duì)氨基苯磺酸鈉、3-氨基丙磺酸鈉或2-巰基乙烷磺酸鈉。

73、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述改性方法所述的雙功能單體2為3-氯丙酸、溴代巴豆酸、2-氯乙基磺酸鈉、3-氯-2-羥丙基三甲基氯化銨或氯乙酰胺。

74、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述改性方法的步驟為：

75、步驟（i1）：采用naoh分散微球，并與還原劑混合，反應(yīng)，再與環(huán)氧氯丙烷混合，反應(yīng)，獲得活化微球；

76、步驟（i2）：清洗所述活化微球，改用碳酸鈉分散，并與所述巰基丙酸混合，攪拌，清洗，改用水分散，獲得一次改性微球；

77、步驟（i3）：將所述一次改性微球與所述3-氯丙酸混合，震蕩，與催化劑混合，反應(yīng)，清洗，獲得二次改性微球，完成改性。

78、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述改性方法的步驟為：

79、步驟（j1）：采用naoh分散微球，并與還原劑混合，反應(yīng)，再與環(huán)氧氯丙烷混合，反應(yīng)，獲得活化微球；

80、步驟（j2）：清洗所述活化微球，改用碳酸鈉分散，并與所述氨基苯甲酸混合，攪拌，清洗，改用水分散，獲得一次改性微球；

81、步驟（j3）：將所述一次改性微球與所述溴代巴豆酸混合，震蕩，與催化劑混合，反應(yīng)，清洗，獲得二次改性微球，完成改性。

82、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述改性方法的步驟為：

83、步驟（k1）：采用naoh分散微球，并與還原劑混合，反應(yīng)，再與環(huán)氧氯丙烷混合，反應(yīng)，獲得活化微球；

84、步驟（k2）：清洗所述活化微球，改用碳酸鈉分散，并與所述3-巰基-1-丙磺酸鈉混合，攪拌，清洗，改用水分散，獲得一次改性微球；

85、步驟（k3）：將所述一次改性微球與所述2-氯乙基磺酸鈉混合，震蕩，與催化劑混合，反應(yīng)，清洗，獲得二次改性微球，完成改性。

86、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述改性方法的步驟為：

87、步驟（l1）：采用naoh分散微球，并與還原劑混合，反應(yīng)，再與環(huán)氧氯丙烷混合，反應(yīng)，獲得活化微球；

88、步驟（l2）：清洗所述活化微球，改用碳酸鈉分散，并與所述3-氨基丙磺酸鈉混合，攪拌，清洗，改用水分散，獲得一次改性微球；

89、步驟（l3）：將所述一次改性微球與所述2-氯乙基磺酸鈉混合，震蕩，與催化劑混合，反應(yīng)，清洗，獲得二次改性微球，完成改性。

90、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述改性方法的步驟為：

91、步驟（m1）：采用naoh分散微球，并與還原劑混合，反應(yīng)，再與環(huán)氧氯丙烷混合，反應(yīng)，獲得活化微球；

92、步驟（m2）：清洗所述活化微球，改用碳酸鈉分散，并與所述聚乙烯亞胺混合，攪拌，清洗，改用水分散，獲得一次改性微球；

93、步驟（m3）：將所述一次改性微球與所述3-氯-2-羥丙基三甲基氯化銨混合，震蕩，與催化劑混合，反應(yīng)，清洗，獲得二次改性微球，完成改性。

94、在本發(fā)明的一些具體實(shí)施方案中，上述改性方法的步驟為：

95、步驟（n1）：采用naoh分散微球，并與還原劑混合，反應(yīng)，再與環(huán)氧氯丙烷混合，反應(yīng)，獲得活化微球；

96、步驟（n2）：清洗所述活化微球，改用碳酸鈉分散，并與所述n,n-二乙基乙二胺混合，攪拌，清洗，改用水分散，獲得一次改性微球；

97、步驟（n3）：將所述一次改性微球與所述氯乙酰胺混合，震蕩，與催化劑混合，反應(yīng)，清洗，獲得二次改性微球，完成改性。

98、本發(fā)明的層析介質(zhì)改性方法有如下效果：

99、根據(jù)如下實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

100、（1）采用巰基丙酸進(jìn)行一次改性獲得的磁性瓊脂糖微球蛋白載量為42.4?μg/mg，采用3-氯丙酸進(jìn)行二次改性后蛋白載量提高至61.2?μg/mg；

101、（2）采用氨基苯甲酸進(jìn)行一次改性獲得的磁性瓊脂糖微球蛋白載量為38.9?μg/mg，采用溴代巴豆酸進(jìn)行二次改性后蛋白載量提高至56.8?μg/mg；

102、（3）采用3-巰基-1-丙磺酸鈉進(jìn)行一次改性獲得的6ff瓊脂糖微球陽離子容量為125?μmol/ml，采用2-氯乙基磺酸鈉進(jìn)行二次改性后陽離子容量提高至205?μmol/ml；

103、（4）采用3-氨基丙磺酸鈉進(jìn)行一次改性獲得的4ff瓊脂糖微球陽離子容量為142?μmol/ml，采用2-氯乙基磺酸鈉進(jìn)行二次改性后陽離子容量提高至207?μmol/ml；

104、（5）采用聚乙烯亞胺進(jìn)行一次改性獲得的6ff瓊脂糖微球陰離子容量為145?μmol/ml，采用3-氯-2-羥丙基三甲基氯化銨進(jìn)行二次改性后陰離子容量提高至252?μmol/ml；

105、（6）采用n,n-二乙基乙二胺進(jìn)行一次改性獲得的6ff瓊脂糖微球陰離子容量為112μmol/ml，采用氯乙酰胺進(jìn)行二次改性后陰離子容量提高至214?μmol/ml；

106、綜上可知，本發(fā)明的層析介質(zhì)改性方法能提高層析介質(zhì)的功能基團(tuán)含量進(jìn)而有利于提高蛋白載量、陰離子離子容量、陽離子離子容量。