本技術(shù)屬于分析化學(xué)，具體涉及一種高覆蓋率定量檢測單細(xì)胞脂質(zhì)組的方法。

背景技術(shù)：

1、單細(xì)胞方法學(xué)的技術(shù)突破改變了科學(xué)家處理生物學(xué)問題的方式，從傳統(tǒng)的批量檢測到單細(xì)胞內(nèi)單個分子的定量。組學(xué)早期分支中的單細(xì)胞革命揭示了細(xì)胞異質(zhì)性在無數(shù)生物環(huán)境中的普遍性。由于疾病的發(fā)病機(jī)制通常歸因于細(xì)胞內(nèi)在和細(xì)胞外在的改變，基于整個組織的整體分析可能會混淆細(xì)微的細(xì)胞內(nèi)變化，而忽略細(xì)胞成分的變化。

2、單細(xì)胞脂質(zhì)組學(xué)提供了最接近實際表型的讀數(shù)，記錄了細(xì)胞內(nèi)發(fā)生的分子事件，重點是極性較小的疏水分子。然而，相對于早期的組學(xué)，單細(xì)胞脂質(zhì)組學(xué)有其獨特的技術(shù)挑戰(zhàn)。例如，與單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)中可以放大數(shù)百萬倍的信號相比，高靈敏度是單細(xì)胞脂質(zhì)組學(xué)的先決條件。脂質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)外發(fā)揮的不同結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)作用使細(xì)胞脂質(zhì)組具有動態(tài)性和多功能性，這需要在采樣和處理時格外小心和快速，以準(zhǔn)確反映細(xì)胞在其天然狀態(tài)下的變化。

3、在其發(fā)展的初級階段，迄今為止，單細(xì)胞脂質(zhì)組學(xué)方法主要致力于最大限度地進(jìn)行檢測。每個細(xì)胞的脂質(zhì)覆蓋率和可靠的結(jié)構(gòu)鑒定仍然是有限的(通常少于100個脂質(zhì))，迄今為止還缺乏對大隊列單細(xì)胞脂質(zhì)組學(xué)進(jìn)行定量和分析重現(xiàn)性驗證。

技術(shù)實現(xiàn)思路

1、本技術(shù)要解決的技術(shù)問題是：如何提高單細(xì)胞脂質(zhì)檢測的脂質(zhì)覆蓋率和檢測結(jié)果的可靠性。

2、為解決上述技術(shù)問題，本技術(shù)提供用于脂質(zhì)分析的組合物，所述組合物包括納升液相色譜的固定相，所述固定相包括正相色譜柱填料和反相色譜柱填料，所述正相色譜柱填料和反相色譜柱填料的質(zhì)量比例為1:4-2:3。

3、進(jìn)一步地，所述組合物還包括納升液相色譜的流動相，所述流動相由流動相a和流動相b混合而成，所述流動相a由氯仿、甲醇和氨水配制而成，所述流動相b由氯仿、甲醇、水、氨水和乙酸銨溶液配制而成。

4、進(jìn)一步地，所述的組合物中，所述流動相a由下述體積份的原料混合而成：890體積份氯仿、100體積份甲醇、10體積份氨水；所述流動相b由下述體積份的原料混合而成：270體積份氯仿、650體積份甲醇、70體積份水、10體積份氨水和2體積份乙酸銨溶液，所述乙酸銨溶液為乙酸銨的含量為1m的水溶液。

5、進(jìn)一步地，所述的組合物中，所述流動相選自下述任意一種、二種或三種：

6、a1)所述流動相為流動相2％b，所述流動相2％b是由98體積份的流動相a和2體積份的流動相b混合而成的液體；

7、a2)所述流動相為流動相55％b，所述流動相55％b是由45體積份的流動相a和55體積份的流動相b混合而成的液體；

8、a3)所述流動相為流動相100％b，所述流動相100％b是100體積份的流動相b。

9、本技術(shù)還提供一種脂質(zhì)分析的方法，所述方法采用納升液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析法進(jìn)行脂質(zhì)分析，所述分析法包括納升液相色譜，所述納升液相色譜采用的固定相包括正相色譜柱填料和反相色譜柱填料，所述正相色譜柱填料和反相色譜柱填料的質(zhì)量比例為1:4-2:3。

10、進(jìn)一步地，所述的方法中，所述納升液相色譜采用所述的流動相進(jìn)行梯度洗脫，所述流動相的流速為800nl/min，

11、所述梯度洗脫包括如下三步洗脫：

12、第一步洗脫：用流動相2％b進(jìn)行洗脫2分鐘，所述流動相2％b是由98體積份的流動相a和2體積份的流動相b混合而成的液體；

13、第二步洗脫：然后用流動相55％b進(jìn)行洗脫2分鐘，所述流動相55％b是由45體積份的流動相a和55體積份的流動相b混合而成的液體；

14、第三步洗脫：再用流動相100％b進(jìn)行洗脫7.5分鐘，所述流動相100％b是100體積份的流動相b；

15、所述流動相a由下述體積份的原料混合而成：890體積份氯仿、100體積份甲醇、10體積份氨水；所述流動相b由下述體積份的原料混合而成：270體積份氯仿、650體積份甲醇、70體積份水、10體積份氨水和2體積份乙酸銨溶液，所述乙酸銨溶液為乙酸銨的含量為1m的水溶液。

16、進(jìn)一步地，所述的方法中，所述脂質(zhì)分析的樣本來自單細(xì)胞。

17、本技術(shù)還提供所述的組合物在制備單細(xì)胞脂質(zhì)組學(xué)分析的產(chǎn)品中的應(yīng)用。

18、本技術(shù)還提供所述的組合物在單細(xì)胞脂質(zhì)組學(xué)分析中的應(yīng)用。

19、本技術(shù)還提供所述的方法在單細(xì)胞脂質(zhì)組學(xué)分析中的應(yīng)用。

20、在本技術(shù)的一些實施方式中，所述正相色譜填料為未鍵合的二氧化硅。

21、在本技術(shù)的一些實施方式中，所述反相色譜填料為十八烷基鍵合硅膠。

22、在本技術(shù)的一些實施方式中，所述正相色譜填料的型號為：phenomenex?lunasilica(2)，3μm，04a-4162。

23、在本技術(shù)的一些實施方式中，所述反相色譜填料的型號為：sunchrom?c18，3μmm，sp-120-3-ods-aq。

24、在本技術(shù)的一些實施方式中，所述氨水為氨的水溶液，其中氨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)比例為30％-33％。

25、所述1m乙酸銨為乙酸銨的含量為1mol/l的乙酸銨水溶液。

26、在本技術(shù)的一些實施方式中，所述采用納升液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜中的納升液相色譜包括洗脫和分離脂質(zhì)的步驟，所述洗脫和分離脂質(zhì)的步驟包括：

27、用包含正相色譜填料(phenomenex?luna?silica(2)，5μm，04a-4274)的填充材料通過分析柱(內(nèi)徑150μm，長度6.8cm)洗脫和分離脂質(zhì)。流動相a由氯仿：甲醇：氨水(890:100:10，v/v/v)組成，流動相b由氯仿：甲醇：水：氨水：1m乙酸銨(270:650:70:10:2，v/v/v/v)組成。流速為800nl/min，nano-lc方法的總持續(xù)時間為13分鐘。梯度從2％b開始持續(xù)2分鐘，在第3分鐘增加到55％b并保持1分鐘，然后在第5分鐘進(jìn)一步增加到100％b。梯度在100％b保持7.5分鐘，然后經(jīng)過0.4分鐘降回2％b，并在下一次進(jìn)樣前平衡0.1分鐘。

28、所述采用納升液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜中的質(zhì)譜源參數(shù)如下：curtain?gas＝30,collision?gas＝high,ion?spray?voltage＝2400v,ion?source?gas?1＝5?；诰_的保留時間(rts)和特征產(chǎn)物片段來鑒定脂質(zhì)，

29、在本技術(shù)的一些實施方式中，采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行測定，內(nèi)標(biāo)法所用內(nèi)標(biāo)混合物由d9-磷脂酰膽堿(2ng/ml，avanti?860352p)，d7-磷脂酰乙醇胺(1ng/ml,avanti?791638c)，d7-磷脂酰甘油(1ng/ml，avanti?791640c)，d7-磷脂酰肌醇(0.5ng/ml，avanti791641c)，d9-磷脂酰膽堿(1ng/ml,avanti?852475c)，d9-鞘磷脂(1ng/ml，avanti791649c)，d7-神經(jīng)酰胺(5ng/ml，avanti?860681p)，c8-葡萄糖神經(jīng)酰胺(2ng/ml，avanti?860540p)，d3-乳糖神經(jīng)酰胺(2ng/ml，matreya?llc?1534)，三己糖神經(jīng)酰胺(1ng/ml，matreya?llc?1523)，d7-溶血磷脂酰膽堿(5ng/ml，avanti?791643c)，d7-溶血磷脂酰乙醇胺(5ng/ml，avanti?791644c)，c17:1-溶血磷脂酰肌醇(0.5ng/ml，avanti?850103p)，d6-膽固醇酯(6μg/ml，cdn?isotopesd5823)，d5-甘油三酯(0.1μg/ml，cdn?isotopes?d6958)，d5-甘油二酯(0.05μg/ml，avanti110538)，d5-甘油二酯(0.04μg/ml，avanti?110581)，d3-肉堿(0.6ng/ml?cambridgeisotopes?laboratory?dlm-1263)溶于溶劑中。所述溶劑由甲醇:乙腈(honeywell?lc015-4):水:1m乙酸銨的體積比為450:450:100:2的比例混合。

30、在本技術(shù)的一些實施方式中，所述脂質(zhì)分析的樣本來自單細(xì)胞。

31、在本技術(shù)的一些實施方式中，從所述單細(xì)胞中提取脂質(zhì)的方法包括：

32、s1)流式細(xì)胞分選儀上使用130μm噴嘴進(jìn)行細(xì)胞分選。將單細(xì)胞分選到2ml玻璃瓶中，每個玻璃瓶中含有1ml?lcms級甲醇(fisher?chemical?a456-4)用于立即淬滅細(xì)胞的進(jìn)一步的生物活性。細(xì)胞分選完成后，將甲醇中的細(xì)胞短暫離心，然后立即在-80℃下冷凍，直到提取脂質(zhì)。

33、s2)向1ml?lcms級甲醇中的單個心肌細(xì)胞中加入333μl冰冷氯仿(cnwtechnologies?caeq-4-011024-4000)和148μl水(fisher?chemical?w6-4)。樣品在4℃下以1500rpm孵育30分鐘，然后在4℃下以4200rpm離心10分鐘。將清潔的上清液轉(zhuǎn)移到新鮮的玻璃小瓶中，使用speedvac真空濃縮儀在中oh模式下干燥。將2ml玻璃瓶中干燥的脂質(zhì)提取物徹底重懸于150μl氯仿：甲醇(1:1，v/v)中，小心地轉(zhuǎn)移到玻璃內(nèi)插管(agilent?5181-1270)中，使用speedvac真空濃縮儀在中oh模式下再次干燥獲得濃縮的脂質(zhì)提取物。

34、將濃縮的脂質(zhì)提取物重懸于15μl內(nèi)標(biāo)混合物中，并在分析前短暫離心以去除氣泡。

35、在本技術(shù)的一些實施方式中，所述方法還包括使用qc樣品進(jìn)行質(zhì)量控制，所述qc樣品為n個單細(xì)胞提取的脂質(zhì)濃縮物溶解在15×nμl內(nèi)標(biāo)混合物中后進(jìn)行n等分獲得的，50≤n≤200；

36、所述質(zhì)量控制通過在待測樣本之間隨機(jī)加入的qc樣本結(jié)果的測定結(jié)果準(zhǔn)確性實現(xiàn)。

37、在本技術(shù)的一些實施方式中，所述qc樣品隨機(jī)加入待測樣品之間，根據(jù)qc樣本的檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性來判斷待測樣本檢測結(jié)果的可靠性。