本發(fā)明涉及一種適用于生物活性涂層制備過程的冷凍干燥處理工藝，具體涉及一種基于蛋白、多肽修飾的鎂、鈦合金復(fù)合涂層的冷凍干燥處理方法，屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

1、鎂、鈦合金等醫(yī)用金屬材料在生物植入性材料領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，由于鎂、鈦合金耐蝕性低、生物降解速度高，界面處與人體細(xì)胞結(jié)合性差，所以，在其表面涂上一層生物活性涂層是極其必要的，且這種涂層需擁有較好耐腐蝕性、生物活性，這樣就能更好地運(yùn)用鎂、鈦合金解決目前生物植入性材料領(lǐng)域存在的問題，該類生物活性涂層常用的生物活性成分主要包括：蛋白質(zhì)、多肽、細(xì)胞生長因子、多糖以及有機(jī)小分子藥物等。其中蛋白質(zhì)是構(gòu)成生命體的重要結(jié)構(gòu)和功能單元，具有多種特殊的生物功能，將生物親和的蛋白類物質(zhì)修飾在醫(yī)用金屬表面，對提升植入體的生物活性和生物功能具有重要意義，目前，基于蛋白質(zhì)、多肽修飾的生物涂層多處于實(shí)驗(yàn)階段，實(shí)際應(yīng)用效果不盡如人意，原因在于涂層蛋白修飾物的失活、涂層生物活性的長期保存等問題。

2、真空冷凍干燥技術(shù)，簡稱凍干，其基本流程是先將待干燥物料溶液降溫冷凍至共晶點(diǎn)以下，直至物料溶液完全凍結(jié)，不含任何液相，然后給凍結(jié)的物料提供熱量，在真空條件下，將物料溶液中的水分直接升華為氣態(tài)，再用冷阱將這些水蒸氣捕獲，最后得到干燥物料的過程。真空冷凍干燥是由真空技術(shù)、干燥技術(shù)、制冷技術(shù)等多種技術(shù)相互結(jié)合的重要的用于物質(zhì)干燥分離的化工過程。凍干工藝較普通濕法干燥相比優(yōu)越之處在于：冷凍干燥是在極低溫度下操作的，這能夠保持凍干后的物料理化性質(zhì)基本不變，避免了生物類物料受熱導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，保證了物料的生物活性；凍干的物料疏松多孔，具有較好的物理形狀，比表面積大，使用時(shí)可快速恢復(fù)到原來的性狀；凍干干燥效果好，可除去95％至99％以上的水分，密封后的干燥產(chǎn)品可以較長時(shí)間保存而不變質(zhì)。

3、目前生物活性涂層制備工藝往往忽視干燥工藝的重要作用，或者采取較為傳統(tǒng)的干燥工藝，這就導(dǎo)致涂層中的活性蛋白修飾物過早失活，而失活的蛋白物質(zhì)又對醫(yī)用金屬產(chǎn)生強(qiáng)烈的腐蝕作用，降低了醫(yī)用金屬的使用壽命。因此，本發(fā)明開發(fā)了一種適合于生物活性涂層的冷凍干燥處理工藝。

4、中國專利《一種基于蛋白質(zhì)顆粒的超疏水涂層及制備方法》(公開號：cn112029146a)公開了一種基于蛋白質(zhì)顆粒的超疏水涂層材料制備方法，包括以下具體步驟：s1：多孔基底材料的預(yù)處理；s2：蛋白質(zhì)顆粒的吸附和固定；s3：低表面能材料改性。其有蛋白質(zhì)團(tuán)簇的多孔基底材料經(jīng)活性污泥浸泡后需進(jìn)行干燥處理，除去大部分水分，采用常規(guī)干燥方法不利于保持蛋白顆?；钚?，實(shí)際應(yīng)用具有局限性。

5、中國專利《一種用于制備鎂合金心臟支架材料的多功能復(fù)合涂層及其制備方法》(公開號：cn?114917414?a)公開了一種用于制備鎂合金心臟支架材料的多功能復(fù)合涂層及其制備方法，該多功能復(fù)合涂層內(nèi)部是磷酸化的聚堿性氨基酸，在磷酸化的聚堿性氨基酸外部引入同時(shí)含有巰基和羧基的偶聯(lián)劑，并通過同時(shí)含有巰基和羧基的偶聯(lián)劑的偶聯(lián)作用，在外部引入親水性陰離子聚合物，最后通過浸漬-提拉的方法涂覆在鎂合金表面得到。該復(fù)合涂層經(jīng)乙醇清洗后經(jīng)n2氛圍干燥處理，保證了涂層被氧化但高溫干燥環(huán)境下涂層活性成分極易失活，降低涂層的生物功能。

6、中國專利《一種復(fù)合高分子材料表面防污涂層的制備方法》(公開號：cn116285682a)公開了通過高碘酸鈉氧化氫化咖啡酸介導(dǎo)牛血清白蛋白，在材料表面組裝蛋白質(zhì)涂層，首先氧化后的氫化咖啡酸迅速與牛血清白蛋白通過疏水相互作用聚集，同時(shí)，蛋白與酚類間形成的氫鍵和離子鍵增強(qiáng)了交聯(lián)效果，組裝形成穩(wěn)定的氫化咖啡酸介導(dǎo)牛血清白蛋白涂層，氫化咖啡酸介導(dǎo)牛血清白蛋白涂層展現(xiàn)了良好的抗細(xì)胞以及抗血小板粘附性能，具有一定的抗污效果，同時(shí)氫化咖啡酸介導(dǎo)牛血清白蛋白涂層表面具備的大量羧基基團(tuán)為二次接枝抗污分子提供可能，通過酰胺化反應(yīng)共價(jià)接枝聚乙二醇，得到復(fù)合高分子材料表面防污涂層。其制備過程反應(yīng)溫度高達(dá)70℃，臨近蛋白失活溫度，采取普通濕法干燥蛋白活性難以保證。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明為了克服現(xiàn)有生物活性涂層制備技術(shù)的不足，滿足實(shí)際應(yīng)用需要，設(shè)計(jì)了一種生物活性涂層的冷凍干燥處理工藝，該工藝可替代大多數(shù)生物活性涂層制備過程中的干燥工藝，保證涂層生物活性，延長涂層使用壽命，助力涂層的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

2、為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

3、一種適用于生物活性涂層的冷凍干燥處理工藝，包括以下步驟：

4、1)預(yù)處理液成分為甘露醇和叔丁醇，甘露醇在凍干過程中起骨架支撐作用，提高凍干效率，叔丁醇的作用是可與蛋白類物質(zhì)結(jié)合，改善凍干晶型，形成獨(dú)有針型晶型，增大凍干表面積，加速凍干。

5、所述預(yù)處理液中甘露醇質(zhì)量體積為8％w/v～12％w/v、叔丁醇的質(zhì)量體積為3％w/v～9％w/v，余量為水。

6、2)開啟冷凍干燥機(jī)，設(shè)定進(jìn)料前擱板溫度為0.0±5.0℃，為凍干提供較高過冷度，在干燥后可在蛋白涂層表面形成堅(jiān)硬凍膠層，以隔絕空氣，防止涂層失活。

7、3)預(yù)處理待凍干的涂層制品，將外覆涂層的待干燥制品置于干燥容器中，使用噴壺向樣品表面噴涂常溫預(yù)處理液，待樣品表面噴涂均勻后，快速將樣品置于凍干機(jī)擱板上。

8、所述的外覆涂層的待干燥制品為鎂合金或鈦合金。

9、所述涂層為蛋白類。

10、4)調(diào)節(jié)冷凍干燥室溫度為-14.0±3℃，維持1～3小時(shí)。

11、5)調(diào)節(jié)冷凍干燥室溫度為-53.0±5.0℃，維持3～5小時(shí)，將涂層樣品快速冷凍；持續(xù)觀察冷凍情況，充足的冷凍時(shí)間可使晶體凍結(jié)更加堅(jiān)固，消除在升華階段出現(xiàn)制品熔化，蛋白涂層失活的隱患。

12、6)之后在-53.0±5.0℃下，設(shè)備抽真空；真空條件為由40±2pa遞減至20±2pa，每小時(shí)壓力下降不超過1pa，每小時(shí)壓力下降不超過1pa。

13、7)繼續(xù)調(diào)節(jié)冷凍干燥室溫度，4～6小時(shí)由-53.0±5.0℃緩慢升至-28.0±5.0℃；5～7小時(shí)由-28.0±5.0℃緩慢升至-8.0±5.0℃；維持冷凍干燥室溫度在-8.0±5.0℃7～9小時(shí)；3～5小時(shí)由-8.0±5.0℃緩慢升溫至0.0±5.0℃，在步驟6)設(shè)定的真空條件下保持3～5小時(shí)。

14、8)繼續(xù)調(diào)節(jié)冷凍干燥室溫度，2～4小時(shí)由0.0±5.0℃緩慢升溫至45.0±5℃，真空條件下保持3～5小時(shí)；真空條件為在10～30pa之間變壓狀態(tài)。最后冷凍干燥室在45.0±5℃恒溫時(shí)抽極限真空；解吸干燥階段主要任務(wù)是除去涂層中的較難除去的結(jié)合水，約占全部水分的5％，同時(shí)最高解吸干燥溫度不應(yīng)高于50℃，既保證蛋白涂層水分的徹底清除，也保證了涂層蛋白成分不失活。

15、上述步驟6)-步驟7)中的真空條件的設(shè)定摻氣量為0.09±0.03mbar。

16、9)關(guān)閉冷凍干燥機(jī)，真空條件下對外覆涂層樣品進(jìn)行包裝，調(diào)節(jié)冷凍干燥室內(nèi)環(huán)境為常壓后取出涂層樣品。凍干后，經(jīng)氣相測定，涂層樣品內(nèi)沒有叔丁醇?xì)埩簦馊チ耸宥〈济摮碾y題。

17、凍干后，經(jīng)氣相測定，涂層樣品內(nèi)沒有叔丁醇?xì)埩簟?/p>

18、本發(fā)明所公開的技術(shù)方案，通過預(yù)處理、凍干條件調(diào)節(jié)等方式，實(shí)現(xiàn)涂層制品的冷凍干燥。從而在保證涂層原有的活性的基礎(chǔ)上，除去多余水分，保證涂層制品長期不失活。

19、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

20、1、本發(fā)明將制藥領(lǐng)域的冷凍干燥技術(shù)用于生物活性涂層處理工藝，大大增強(qiáng)生物涂層保存期限，保障了涂層不失活。

21、2、本發(fā)明篩選出適用蛋白類涂層的凍干輔料叔丁醇，可形成針型晶型，提高凍干效率，同時(shí)凍干結(jié)束后經(jīng)氣相檢測叔丁醇全部分離，對產(chǎn)品性質(zhì)無影響。

22、3、凍膠層原是凍干工藝中有害現(xiàn)象，是在凍干品表面形成的堅(jiān)固硬層，降低凍干效率，但在本發(fā)明中，有意形成特定的凍膠層，有效阻隔空氣及細(xì)菌的介入，進(jìn)一步保障涂層的活性及無菌性。

23、4、本發(fā)明方法簡單、工藝成熟可行，凍干后的涂層制品外觀規(guī)整、含水量極低，克服了現(xiàn)有生物活性涂層制備技術(shù)的不足，滿足實(shí)際應(yīng)用需要，可替代大多數(shù)生物活性涂層制備過程中的干燥工藝，保證涂層生物活性，延長涂層使用壽命，助力涂層的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，為相關(guān)研究提供有力支撐。