本發(fā)明涉及生物芯片以及細(xì)胞檢測(cè)，具體涉及液晶光流控芯片、光學(xué)成像裝置及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

1、外泌體含量的測(cè)定對(duì)于患者癌癥早期診斷和治療有著廣泛的應(yīng)用：在已完成臨床試驗(yàn)的研究中，外泌體應(yīng)用領(lǐng)域有：癌癥及子癇早期診斷、帕金森病、血小板功能及凝血、腫瘤疫苗；正在招募的臨床試驗(yàn)中，外泌體應(yīng)用領(lǐng)域有：癌癥的早期診斷、腫瘤預(yù)后監(jiān)測(cè)、免疫治療、多囊卵巢綜合癥疾病診斷、組織修復(fù)等。因此外泌體的研究及檢測(cè)一直受到人們的廣泛關(guān)注。

2、已報(bào)道的用于檢測(cè)外泌體的方法，其中包括透射電子顯微鏡觀察法(tem)、流式細(xì)胞術(shù)(fcm)、western?blot檢測(cè)、化納米顆粒示蹤技術(shù)(nta)等。綜合分析以上方法，我們發(fā)現(xiàn)這些檢測(cè)方法在進(jìn)行生物樣品中外泌體的檢測(cè)時(shí)存在一定的缺陷，比如：流式細(xì)胞術(shù)(fcm)對(duì)外泌體的檢測(cè)限范圍較差，需要對(duì)外泌體進(jìn)行富集，提高濃度后才能檢測(cè)，并顯示出一般的靈敏度。此外，還有一些方法比如透射電子顯微鏡觀察法(tem)、化納米顆粒示蹤技術(shù)(nta)顯示出理想的分析性能，但通常需要精密儀器與較為嚴(yán)格的人為操作。并且目前的方法均存在測(cè)試周期長(zhǎng)、勞動(dòng)密集、儀器復(fù)雜、不適合快速、靈敏、選擇性的檢測(cè)外泌體。

3、液晶生物傳感器是利用液晶分子作為生物傳感器的信號(hào)轉(zhuǎn)化元件，將生物分子間的特異性識(shí)別結(jié)合事件轉(zhuǎn)化為放大的光學(xué)信號(hào)輸出。其檢測(cè)原理是液晶分子在功能化傳感界面上的排列取向會(huì)隨著特定目標(biāo)分子的加入而發(fā)生變化，從而引起液晶對(duì)光線折射方向的改變，進(jìn)一步放大為液晶在偏光顯微鏡下的光學(xué)圖像形貌的改變。由于其操作簡(jiǎn)單、反應(yīng)靈敏等優(yōu)勢(shì)而在小分子藥品控制、蛋白質(zhì)檢測(cè)中有了一定的應(yīng)用。本發(fā)明試圖探索能夠用于生物體如外泌體檢測(cè)的液晶生物傳感器。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路

1、本發(fā)明提供液晶光流控芯片、光學(xué)成像裝置及應(yīng)用，目的是開發(fā)一種新的液晶光流控芯片及光學(xué)成像裝置，并探索其在外泌體檢測(cè)的可能。

2、為了實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：

3、第一方面，本發(fā)明提供液晶光流控芯片，包括基底，所述基底上具有封閉的微結(jié)構(gòu)，所述微結(jié)構(gòu)包括數(shù)量相同且一一對(duì)應(yīng)的若干個(gè)樣品池和若干個(gè)光學(xué)池，每個(gè)所述樣品池和與所述樣品池相對(duì)應(yīng)的一個(gè)光學(xué)池通過微混合通道相通；每個(gè)所述樣品池均設(shè)有進(jìn)出口管道一，每個(gè)所述光學(xué)池均設(shè)有進(jìn)出口管道二；所述微混合通道包括彼此相通的第一通道和第二通道，其中，所述第一通道設(shè)有進(jìn)樣管道。

4、優(yōu)選地，所述樣品池內(nèi)設(shè)有若干個(gè)小分子過濾孔，所述小分子過濾孔位于所述樣品池與所述微混合通道相連的一側(cè)；和/或，所述光學(xué)池內(nèi)設(shè)有用于若干個(gè)裝載光學(xué)成分的孔槽；優(yōu)選地，所述孔槽橫截面為矩形、正六邊形、正三角形、圓形結(jié)構(gòu)；更為優(yōu)選地，若干個(gè)所述孔槽排列形成方形矩陣。

5、優(yōu)選地，所述第一通道為層級(jí)式樹狀通道；和/或，所述第二通道包括若干個(gè)第三通道，每個(gè)所述第三通道均與其中一個(gè)樣品池和與所述樣品池相對(duì)應(yīng)的一個(gè)光學(xué)池分別連通。

6、優(yōu)選地，所述第三通道與所述樣品池和所述光學(xué)池分別通過管道連通；更優(yōu)選地，所述第三通道為曲線型通道。

7、優(yōu)選地，所述基底為pdms柔性基底；進(jìn)一步優(yōu)選地，所述芯片還包括殼體，更優(yōu)選地，所述殼體為透明結(jié)構(gòu)。

8、第二方面，本發(fā)明提供第一方面所述的液晶光流控芯片的制備方法，包括如下步驟：

9、步驟1，通過掩模板設(shè)計(jì)微結(jié)構(gòu)圖案；

10、步驟2，將掩模板上的微結(jié)構(gòu)圖案轉(zhuǎn)移到硅片上；

11、步驟3，將硅片上的微結(jié)構(gòu)圖案轉(zhuǎn)移到基底上。

12、優(yōu)選地，所述步驟2中，將掩模板上的微結(jié)構(gòu)圖案轉(zhuǎn)移到硅片上，包括以下步驟：

13、步驟2-1，硅片一次涂膠，優(yōu)選采用旋涂方式，旋涂速度為500rpm，加速度為500rpm·s-1，時(shí)間為5s；優(yōu)選采用su8-3000系列光刻膠；

14、步驟2-2，硅片二次涂膠，優(yōu)選采用旋涂方式，旋涂速度為1800-2500rpm，加速度為1800-2500rpm·s-1，時(shí)間為60s；

15、步驟2-3，將二次涂膠完畢的硅片進(jìn)行分步前烘，冷卻至室溫后將硅片與掩模板疊放后進(jìn)行紫外曝光，再將硅片進(jìn)行分步后烘；

16、步驟2-4，硅片顯影，優(yōu)選采用pgmea顯影劑顯影，時(shí)間為4-10min；顯影完成后清洗并干燥；

17、步驟2-5，將硅片進(jìn)一步于120～150℃加熱20～30min，冷卻至室溫，獲得具有微結(jié)構(gòu)的硅片；

18、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述步驟2-3中，分步前烘包括：第一步室溫加熱至50±5℃，保持10～15min；第二步加熱至65±5℃，保持10～15min；第三步加熱至95±5℃，保持10～15min；第四步，95℃冷卻至室溫；和/或，

19、分步后烘包括：第一步室溫加熱至50±5℃，50±5℃保持10min；第二步50±5℃加熱至65±5℃，65±5℃保持10min；第三步65±5℃加熱至80±5℃，80±5℃保持10min；第四步，80±5℃冷卻至室溫；和/或，

20、所述紫外曝光的控制參數(shù)為：曝光時(shí)間25～30s，紫外強(qiáng)度120～130μm·cm-2。

21、優(yōu)選地，所述步驟3中，將硅片上的微結(jié)構(gòu)圖案轉(zhuǎn)移到基底上；所述基底為pdms柔性基底，采用兩片pdms柔性基底，其中一片pdms柔性基底具有微結(jié)構(gòu)中的樣品池、光學(xué)池、第一通道，另一片pdms柔性基底具有微結(jié)構(gòu)中的第二通道，具體包括如下步驟：

22、步驟3-1，將pdms和固化劑按照質(zhì)量比為10:1混合后消除氣泡，獲得液態(tài)pdms；

23、步驟3-2，將液態(tài)pdms覆蓋在硅片上，進(jìn)行熱固化，優(yōu)選地，固化參數(shù)包括：溫度80～90℃，時(shí)間30～40min，冷卻至室溫；固化結(jié)束后將pdms從硅片上剝離，獲得具有相應(yīng)微結(jié)構(gòu)的兩片pdms柔性基底；

24、步驟3-3，將兩片pdms柔性基底進(jìn)行鍵合，其中，具有微結(jié)構(gòu)中的樣品池、光學(xué)池、第一通道的pdms柔性基底位于下層，具有微結(jié)構(gòu)中的第二通道的pdms柔性基底位于上層；

25、進(jìn)一步優(yōu)選地，所述制備方法還包括將鍵合后的pdms柔性基底加載殼體。

26、第三方面，本發(fā)明提供光學(xué)成像裝置，包括第一方面所述的液晶光流控芯片和偏光顯微鏡，所述偏光顯微鏡用于觀察所述液晶光流控芯片光學(xué)池中的光學(xué)現(xiàn)象。

27、第四方面，本發(fā)明提供第一方面所述的液晶光流控芯片和/或第三方面所述的光學(xué)成像裝置在生物體檢測(cè)上的應(yīng)用。生物體涵蓋細(xì)胞、病毒以及蛋白質(zhì)、核酸等生物小分子。

28、第五方面，本發(fā)明提供一種外泌體檢測(cè)方法，是采用第三方面所述的光學(xué)成像裝置，包括如下步驟：

29、將液晶與陽(yáng)離子表面活性劑溶液混合，得到液晶混合液，其中，所述陽(yáng)離子表面活性劑溶液的濃度＜0.025mm；

30、將待檢測(cè)生物體注入樣品池并引入微混合通道，同時(shí)將適配體溶液注入微混合通道中與待檢測(cè)生物體混合；優(yōu)選地，所述適配體溶液濃度為45～50nmol/l；

31、將混合物進(jìn)一步引入光學(xué)池，同時(shí)向光學(xué)池中注入液晶混合液與所述混合物進(jìn)一步混合；

32、將光學(xué)池置于偏光顯微鏡下檢測(cè)，通過檢測(cè)獲得的光學(xué)圖片進(jìn)行外泌體分析。

33、優(yōu)選地，所述陽(yáng)離子表面活性劑選自溴化十六烷基三甲胺、十二烷基二甲基芐基溴化銨、十八烷基三甲基氯化銨、甲基二牛脂酰乙基-2-羥乙基硫酸甲酯銨中的至少一種。

34、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

35、本發(fā)明將傳統(tǒng)微流控技術(shù)與液晶光學(xué)傳感技術(shù)相結(jié)合，基于適配體構(gòu)象變化原理和液晶雙折射性能，開發(fā)出一種全新的可以實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)的液晶光流控芯片及光學(xué)成像裝置，通過偏光顯微鏡觀察樣品在液晶光流控芯片上的不同液晶光學(xué)形貌，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)檢測(cè)樣品中外泌體的目的。該液晶光流控芯片及光學(xué)成像裝置用于檢測(cè)外泌體具有高通量、快速檢測(cè)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，且整個(gè)操作過程簡(jiǎn)單、試劑消耗少、樣品處理時(shí)間短，解決了現(xiàn)有檢測(cè)方法復(fù)雜、成本高等技術(shù)問題，并拓寬了液晶光流控芯片的應(yīng)用范疇。