用于執(zhí)行熱熔分析和擴(kuò)增的裝置、系統(tǒng)和方法
【專利說明】用于執(zhí)行熱熔分析和擴(kuò)增的裝置、系統(tǒng)和方法
【背景技術(shù)】
[0001] 1.摶術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及用于在多個(gè)反應(yīng)容器的每一個(gè)中執(zhí)行多重?zé)崛鄯治龀绦虻南到y(tǒng)和方 法。
[0003] 2.背景摶術(shù)
[0004] 本文描述或涉及的任何參考文獻(xiàn)均不認(rèn)為是相對(duì)受權(quán)利要求書保護(hù)的本發(fā)明的 現(xiàn)有技術(shù)。
[0005] 診斷分析廣泛用于臨床診斷和健康科學(xué)研究，以檢測(cè)生物體或生物樣品中的生物 抗原、細(xì)胞或遺傳異常、疾病狀態(tài)以及疾病相關(guān)病原體或基因突變的存在或?qū)λ鼈兊牧窟M(jìn) 行定量。在診斷分析允許定量時(shí)，專業(yè)人員能夠更好地計(jì)算感染或疾病的程度，并確定疾病 隨時(shí)間推移的狀態(tài)。診斷分析在很多情況下集中于檢測(cè)所關(guān)注的化學(xué)物質(zhì)、蛋白質(zhì)或多糖 抗原、核酸、生物聚合物、細(xì)胞或組織。可以采用多種分析檢測(cè)這些診斷指標(biāo)。
[0006] 具體地講，基于核酸的分析通常包括用于對(duì)樣品中一個(gè)或多個(gè)靶標(biāo)核酸序列進(jìn) 行檢測(cè)或量化的多個(gè)步驟。靶標(biāo)核酸序列通常對(duì)細(xì)胞、組織、生物體或病毒的可識(shí)別群組 具有特異性，其中所述群組由至少一個(gè)核酸共有序列限定，該序列為群組成員所共有，并且 針對(duì)待分析樣品中的該群組具有特異性。多種基于核酸的檢測(cè)方法在Kohne的美國(guó)專利 No. 4, 851，330和Hogan的美國(guó)專利No. 5, 541，308進(jìn)行了充分描述，這些專利中每一個(gè)的公 開內(nèi)容據(jù)此以引用方式并入。
[0007] 例如，部分通過使樣品暴露于探針來執(zhí)行基于核酸的分析，該探針被配置以在特 定雜交條件下對(duì)屬于所關(guān)注的蛋白質(zhì)、細(xì)胞、組織、生物體或病毒的核酸序列表現(xiàn)出特異 性。通常對(duì)樣品進(jìn)行一定程度的處理，從而以使其適于雜交的方式提取核酸。
[0008] 在將靶標(biāo)核酸暴露于探針之前或之后，可通過靶標(biāo)捕獲方法，使用鍵合到諸如磁 珠的基底上的"捕獲探針"直接地或間接地固定靶標(biāo)核酸。靶標(biāo)捕獲探針通常為能夠與包 含靶標(biāo)序列的核酸序列雜交的較短核酸序列（即寡核苷酸）。當(dāng)磁珠包括捕獲探針時(shí)，使用 靠近反應(yīng)器皿的磁體將磁珠吸引到并保持在器皿的側(cè)面。一旦靶標(biāo)核酸因此固定，可通過 例如從反應(yīng)器皿抽吸流體并任選地執(zhí)行一個(gè)或多個(gè)洗滌步驟，使雜交核酸與樣品中存在的 非雜交核酸分離。
[0009] 在大多數(shù)情況下，希望使用本領(lǐng)域所熟知的若干核酸擴(kuò)增程序中的任一 種擴(kuò)增靶標(biāo)序列。核酸擴(kuò)增的方法在文獻(xiàn)中進(jìn)行了詳盡描述。PCR擴(kuò)增例如在 Mullis 等人的美國(guó)專利 No. 4, 683, 195、4, 683, 202 和 4, 800, 159 以及 Methods in Enzymology, 155:335_35〇(1987)(《酶學(xué)方法》，第 I55 卷，第 335_35〇 頁(yè)，1987 年）中 有所描述，這些文獻(xiàn)中每一個(gè)的公開內(nèi)容據(jù)此以引用方式并入。SDA的例子可見于 Walker, PCR Methods and Applications, 3:25-30(1993) (Walker，《PCR 方法和應(yīng)用》，第 3 卷，第 25-30 頁(yè)，1993 年）、Walker et al. in Nucleic Acids Res. ,20:1691-1996(1992) (Walker等人，《核酸研究》，第20卷，第1691-1996頁(yè)，1992年）以及Proc. Natl. Acad. Sci. ,89:392-396(1991)(《美國(guó)科學(xué)院院報(bào)》，第 89 卷，第 392-396 頁(yè)，1991 年）。LCR 在美國(guó)專利No. 5, 427, 930和5, 686, 272中有所描述，這些專利中每一個(gè)的公開內(nèi)容據(jù) 此以引用方式并入。轉(zhuǎn)錄相關(guān)擴(kuò)增（"TAA"）形式的例子在例如Burg等人的美國(guó)專利 No. 5, 437, 990、Kacian 等人的美國(guó)專利 No. 5, 399, 491 和 5, 554, 516、以及 Gingeras 等人 的國(guó)際申請(qǐng)此.？(：17^587/01966(出版為國(guó)際公布此.10 88/01302)和國(guó)際申請(qǐng)此.？(：1'/ US88/02108(出版為國(guó)際公布No. WO 88/10315)中有所提供，這些專利中每一個(gè)的公開內(nèi) 容據(jù)此以引用方式并入。
[0010] 靶標(biāo)核酸序列的檢測(cè)通常需要使用具有與靶標(biāo)序列或其擴(kuò)增子的至少一部分基 本上互補(bǔ)的核苷酸堿基序列的核酸分子。在選擇性分析條件下，探針將以允許專業(yè)人員檢 測(cè)樣品中靶標(biāo)序列的存在的方式雜交到靶標(biāo)序列或其擴(kuò)增子。有效探針制備的技術(shù)在本領(lǐng) 域中是已知的。然而，一般來講，有效探針被設(shè)計(jì)用于防止與自身或任何將會(huì)妨礙檢測(cè)靶標(biāo) 序列存在的核酸分子的非特異性雜交。探針可包括例如能夠檢測(cè)的標(biāo)記，其中標(biāo)記為例如 放射標(biāo)記物、熒光團(tuán)或熒光染料、生物素、酶、化學(xué)發(fā)光化合物或本領(lǐng)域已知的其他類型的 可檢測(cè)信號(hào)。
[0011] 由于探針以允許檢測(cè)指示樣品中靶標(biāo)序列存在的信號(hào)的方式雜交到靶標(biāo)序列或 其擴(kuò)增子，因此信號(hào)的強(qiáng)度與存在的靶標(biāo)序列或其擴(kuò)增子的量成比例。因此，通過在擴(kuò) 增過程中定期測(cè)量表征擴(kuò)增子存在的信號(hào)，可檢測(cè)擴(kuò)增子隨時(shí)間推移的增長(zhǎng)。根據(jù)在擴(kuò) 增過程的"實(shí)時(shí)"監(jiān)測(cè)期間收集的數(shù)據(jù)，可確定樣品中初始存在的靶標(biāo)核酸的量。用于實(shí) 時(shí)檢測(cè)和用于處理實(shí)時(shí)數(shù)據(jù)以確定核酸水平的系統(tǒng)和方法在例如Lair等人的美國(guó)專利 No.7,932,081, "Signal Measuring System for Conducting Real-Time Amplification Assays"（用于進(jìn)行實(shí)時(shí)擴(kuò)增分析的信號(hào)測(cè)量系統(tǒng)）中有所描述，該專利的公開內(nèi)容據(jù)此以 引用方式并入。
[0012] 為了在單次分析中檢測(cè)不同的所關(guān)注核酸，可使用被配置以雜交到不同核酸的不 同探針，這些探針中的每一個(gè)可以提供可檢測(cè)到的不同信號(hào)。例如，被配置以雜交到不同靶 標(biāo)的不同探針可帶有熒光團(tuán)，當(dāng)暴露于規(guī)定激發(fā)波長(zhǎng)的激發(fā)光時(shí)，該熒光團(tuán)在預(yù)定波長(zhǎng)下 發(fā)熒光。通過使樣品材料交替地暴露于不同激發(fā)波長(zhǎng)并且在實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)過程中檢測(cè)所關(guān)注波 長(zhǎng)下對(duì)應(yīng)于每個(gè)靶標(biāo)核酸的探針的熒光水平，可并行執(zhí)行用于檢測(cè)不同靶標(biāo)核酸的分析。 可使用不同的信號(hào)檢測(cè)設(shè)備執(zhí)行并行處理，所述信號(hào)檢測(cè)設(shè)備被構(gòu)造并布置用于在擴(kuò)增過 程中定期測(cè)量信號(hào)發(fā)射，并且不同的信號(hào)檢測(cè)設(shè)備被配置以生成不同波長(zhǎng)的激發(fā)信號(hào)以及 測(cè)量不同波長(zhǎng)的發(fā)射信號(hào)。合適的信號(hào)檢測(cè)設(shè)備包括熒光計(jì)，諸如下文所述的熒光計(jì)。
[0013] 熱熔分析或熔解曲線分析包括評(píng)估雙鏈DNA在加熱過程中的離解特性，以識(shí)別靶 標(biāo)核酸中的特異性基因型?？墒褂檬占男畔⑼茢鄦魏塑账岫鄳B(tài)性的存在和種類。更具體 地講，破壞兩條DNA鏈之間的堿基-堿基氫鍵所需的能量取決于它們的長(zhǎng)度、GC含量（或鳥 嘌呤-胞嘧啶含量）以及它們的互補(bǔ)性。通過加熱包含雙鏈DNA序列的反應(yīng)混合物并測(cè)量 不同溫度下的離解，可推斷多種屬性。最初使用紫外吸光度測(cè)量觀察鏈離解，但基于熒光測(cè) 量的技術(shù)是目前最常用的方法。可使用DNA插入熒光團(tuán)（諸如SYBR綠、EvaGreen或熒光 團(tuán)標(biāo)記的DNA探針）測(cè)量?jī)蓷lDNA鏈之間的隨溫度變化的離解。就SYBR綠而言，DNA在加 熱過程中的離解可通過其導(dǎo)致的熒光大幅減少來測(cè)量。作為另外一種選擇，可使用一個(gè)具 有熒光團(tuán)而另一個(gè)具有合適的淬滅劑的并置探針來確定探針與靶標(biāo)序列的互補(bǔ)性。例如， 雖然多種其他方法是本領(lǐng)域已知的，熔解曲線的一階負(fù)導(dǎo)數(shù)圖可使得通過由此定義的峰值 確定離解溫度（定義為50 %離解）更為容易。
[0014] 熔解曲線分析描述了用于測(cè)量?jī)蓷l核酸鏈的溫度依賴性離解的方法。為執(zhí)行熔解 曲線分析，升高樣品和/或包含在其中的擴(kuò)增子的溫度，同時(shí)監(jiān)測(cè)由樣品發(fā)出的信號(hào)，諸如 熒光團(tuán)標(biāo)記探針的熒光。隨著溫度上升，可根據(jù)可檢測(cè)到的信號(hào)變化（諸如通過熒光的減 少）測(cè)量探針和擴(kuò)增子的離解。熔解工位包括一個(gè)或多個(gè)包含樣品材料（例如擴(kuò)增子）的 容器，并且使容器的內(nèi)容物經(jīng)受熱能，以沿著受控溫度曲線升高擴(kuò)增子的溫度，同時(shí)監(jiān)測(cè)信 號(hào)，例如由內(nèi)容物發(fā)出的熒光。在檢測(cè)到的信號(hào)為熒光的情況下，可以在一個(gè)或多個(gè)波長(zhǎng)下 監(jiān)測(cè)熒光。該程序得到熒光相對(duì)時(shí)間的熔解曲線。熔解溫度的差值可用于區(qū)別擴(kuò)增子序列 的變型。例如，突變型鏈和野生型鏈可以具有顯著不同的熔解溫度。
[0015] 通常，在成批處理樣品的分子診斷器械上執(zhí)行熱熔分析。將一組樣品（即"一批"） 置于器械（通常為熱塊）中，并運(yùn)行器械以對(duì)所有樣品基本上同時(shí)執(zhí)行熱熔或熱熔分析。 器械繼續(xù)運(yùn)行，直至對(duì)置于器械中的所有樣品完成分析。完成分析后，停止或暫定器械的運(yùn) 行，取出此批樣品，待器械或熱塊的溫度緩降到特定的起始溫度，然后可將后續(xù)批次的樣品 置于器械中并重復(fù)該過程。
[0016] 通常，通過將接納反應(yīng)液體的容器置于器械中來執(zhí)行熔解分析，該器械通過升高 器械的組件（通常稱為熱塊）的溫度來升高反應(yīng)液體的溫度。根據(jù)預(yù)定義的溫度曲線，足 夠緩慢地升高熱塊的溫度，使得反應(yīng)液體的溫度準(zhǔn)確地跟隨塊的溫度?？删徛⒕€性地改 變塊的溫度，或者以階梯式的方式改變，同時(shí)將每個(gè)梯度的溫度保持足夠長(zhǎng)的時(shí)間，以便反 應(yīng)液體在每個(gè)溫度梯度中達(dá)到穩(wěn)態(tài)。塊的溫度必須起始于或低于最低分析溫度，并且結(jié)束 于或高于最高分析溫度，以確保反應(yīng)液體的溫度在整個(gè)熔解過程中是已知的。要為下一個(gè) 容器（即批次）做準(zhǔn)備，塊的溫度必須緩降到起始溫度。器械的總通量受到反應(yīng)液體溫度 從起始溫度變?yōu)榻Y(jié)束溫度的速度以及塊的溫度返回到起始溫度以便為下一個(gè)批次做好準(zhǔn) 備的速度所限制。分析時(shí)間也受到容器內(nèi)反應(yīng)液體的溫度可跟隨塊溫度的速度的限制。
[0017] 與成批方式不同，其他診斷器械以連續(xù)（也稱為線性或管線）方式處理樣品。通 過器械依次并連續(xù)地處理樣品，以并行方式對(duì)不同樣品執(zhí)行不同處理步驟。一個(gè)樣品完成 分析過程，而另一個(gè)樣品立即開始該過程。因此，對(duì)所有樣品的處理并非同時(shí)開始或完成， 并且可以在器械運(yùn)行過程中定期完成分析，例如，每五分鐘一次。
[0018] 就以連續(xù)方式處理樣品的自動(dòng)化器械而言，為了保持每五分鐘或其他所需的間隔 完成一次樣品分析的示例性順序，熔解工位必須能夠一次處理一個(gè)反應(yīng)容器并且優(yōu)選地在 一個(gè)五分鐘間隔內(nèi)完成熱熔周期。如果熱熔工位不能通過在指定時(shí)間間隔內(nèi)完成熱熔周期 來保持所需的頻率，則必須采用兩個(gè)或更多個(gè)并行運(yùn)行的熱熔工位。如上所述，對(duì)使溫度從 起始溫度緩慢升高到結(jié)束溫度然后回到起始溫度的需求，以及容器的內(nèi)容物達(dá)到與熱塊的 熱平衡可能需要的時(shí)間延遲產(chǎn)生了挑戰(zhàn)：需要設(shè)計(jì)一種可在保持連續(xù)處理分子的診斷器械 的期望通量所需的時(shí)間間隔內(nèi)完成熱熔程序的熱熔工位。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0019] 本公開的多個(gè)方面體現(xiàn)在被配置以對(duì)容器的內(nèi)容物施加熱能的裝置，以增加容器 的內(nèi)容物的溫度并檢測(cè)容器的內(nèi)容物隨著內(nèi)容物的溫度上升而發(fā)出的光學(xué)信號(hào)。該裝置包 括：容器固定器，該容器固定器被配置以接納并以可脫開的方式保持容器；器皿接納熱組 件，其一部分被保持在相對(duì)于環(huán)境溫度的恒定高溫下并且被配置以接納容器的至少一部分 并對(duì)容器的內(nèi)容物施加熱能；容器移動(dòng)機(jī)構(gòu)，該容器移動(dòng)機(jī)構(gòu)被配置以在容器固定器與器 皿接納熱組件之間進(jìn)行相對(duì)移動(dòng)，以將由容器固定器保持的容器的至少一部分置于器皿接 納熱組件內(nèi)并將容器的該部分從器皿接納熱組件中移出；以及光學(xué)信號(hào)檢測(cè)設(shè)備，該光學(xué) 信號(hào)檢測(cè)設(shè)備被構(gòu)造和布置用于在通過器皿接納熱組件對(duì)內(nèi)容物施加熱能時(shí)，檢測(cè)保持在 器皿接納熱組件中的容器的內(nèi)容物發(fā)出的光學(xué)信號(hào)。
[0020] 根據(jù)本公開的裝置的其他方面，穩(wěn)態(tài)溫度為至少約90°C。根據(jù)其他方面，穩(wěn)態(tài)溫度 介于約70°C和約120°C之間。根據(jù)其他方面，穩(wěn)態(tài)溫度介于約70°C和約90°C之間。在常見 實(shí)施例中，容器的內(nèi)容物發(fā)出的光學(xué)信號(hào)包括化學(xué)發(fā)光和/或熒光信號(hào)。在常見實(shí)施例中， 此類光學(xué)信號(hào)由兩條核酸鏈（諸如雙鏈DNA)之間的氫鍵斷裂產(chǎn)生。在偶見實(shí)施例中，穩(wěn)態(tài) 溫度包括可發(fā)生等溫核酸擴(kuò)增反應(yīng)（例如，TMA、3SR、NASBA、SMART、SDA、RCA、LAMP、MDA、 HAD、SPIA 或 cHDA)的溫度。
[0021] 根據(jù)其他方面，容器固定器包括蓋和托架，該蓋定位在容器固定器中裝載的容器 上方，并且該托架包括沿著該托架的相對(duì)側(cè)的側(cè)壁和沿著側(cè)壁的底部邊緣延伸的側(cè)向支承 法蘭。
[0022] 根據(jù)其他方面，該裝置還包括被配置以檢測(cè)容器固定器中容器的存在的容器存在 檢測(cè)器。
[0023] 根據(jù)其他方面，容器移動(dòng)機(jī)構(gòu)由系統(tǒng)控制器控制，該系統(tǒng)控制器被配置以在容器 存在檢測(cè)器檢測(cè)到容器固定器中存在容器時(shí)引發(fā)容器固定器與器皿接納熱組件之間的相 對(duì)移動(dòng)。
[0024] 根據(jù)其他方面，器皿接納熱組件包括器皿對(duì)齊塊和熱塊。器皿對(duì)齊塊被構(gòu)造和布 置用于在容器移動(dòng)機(jī)構(gòu)在容器固定器與器皿接納熱組件之間進(jìn)行相對(duì)移動(dòng)時(shí)，將容器固定 器裝載的容器的一部分定位在熱塊中。
[0025] 根據(jù)其他方面，熱塊被配置以保持在恒定高溫下。
[0026] 根據(jù)其他方面，裝置還包括與熱塊熱接觸的熱元件。
[0027] 根據(jù)其他方面，熱元件包括覆蓋熱塊的至少一部分的電阻性箔。
[0028] 根據(jù)其他方面，器皿對(duì)齊塊包括對(duì)齊開口，該對(duì)齊開口形成于其中并被配置以保 持在固定方向通過該開口插入的容器。另外，形成的熱塊由導(dǎo)熱材料形成并且包括形成于 其中的容器開口。熱塊相對(duì)于器皿對(duì)齊塊定位，使得形成于熱塊中的容器開口與穿過器皿 對(duì)齊塊形成的對(duì)齊開口對(duì)齊，以使得通過穿過器皿對(duì)齊塊形成的對(duì)齊開口插入的容器定位 在形成于熱塊中的容器開口內(nèi)。
[0029] 根據(jù)其他方面，該裝置包括至少一個(gè)形成于熱塊中的信號(hào)孔，并且其延伸到形成 于容器中的容器開口。該信號(hào)孔被配置以允許光學(xué)信號(hào)檢測(cè)設(shè)備檢測(cè)位于容器開口內(nèi)的容 器的內(nèi)容物發(fā)出的光學(xué)信號(hào)。
[0030] 根據(jù)其他方面，該裝置包括設(shè)置在器皿對(duì)齊塊與熱塊之間的結(jié)合塊并且具有與器 皿對(duì)齊塊的對(duì)齊開口和熱塊的容器開口對(duì)齊的開口。
[0031] 根據(jù)其他方面，穿過器皿對(duì)齊塊形成的對(duì)齊開口的橫截面為圓形并且形成于熱塊 中的容器開口的橫截面為圓形。
[0032] 根據(jù)其他方面，器皿對(duì)齊塊包括凸起的中心部分，該中心部分在器皿對(duì)齊塊的頂 部表面上沿著器皿對(duì)齊塊的縱向延伸，并且在凸起的中心部分的相對(duì)側(cè)限定凹陷的肩部。
[0033] 根據(jù)其他方面，熱塊包括從熱塊的頂部表面形成于其中的一個(gè)或多個(gè)容器孔以及 從塊的下表面延伸并且圍繞一個(gè)或多個(gè)容器孔而不延伸到容器孔中的任一個(gè)的中空部分。 [0034] 根據(jù)其他方面，該裝置包括固定到熱塊的底部表面的底蓋，以基本上包封中空部 分。
[0035] 根據(jù)其他方面，該裝置包括形成于熱塊和底蓋中并且延伸至在熱塊中形成的容器 孔的信號(hào)孔。該信號(hào)孔被配置以允許光學(xué)信號(hào)檢測(cè)設(shè)備檢測(cè)位于容器孔內(nèi)的容器的內(nèi)容物 發(fā)出的光學(xué)信號(hào)。
[0036] 根據(jù)其他方面，器皿對(duì)齊塊包括一個(gè)或多個(gè)從其表面凸起的安裝塊，器皿對(duì)齊塊 在該安裝塊處附接到熱塊。
[0037] 根據(jù)其他方面，容器固定器被配置以接納并以可脫開的方式保持多個(gè)容器。器皿 接納熱組件被配置以接納多個(gè)容器的一部分并且對(duì)容器的內(nèi)容物施加熱能。該裝置還包括 檢測(cè)器平移機(jī)構(gòu)，該檢測(cè)器平移機(jī)構(gòu)被構(gòu)造和布置用于相對(duì)于器皿接納組件移動(dòng)光學(xué)信號(hào) 檢測(cè)設(shè)備，以選擇性地將信號(hào)檢測(cè)設(shè)備的信號(hào)檢測(cè)通道定位成與保持在器皿接納熱組件內(nèi) 的兩個(gè)或更多個(gè)不同容器檢測(cè)對(duì)齊。
[0038] 根據(jù)其他方面，容器移動(dòng)機(jī)構(gòu)包括電機(jī)、聯(lián)接到電機(jī)的輸出軸的螺紋傳動(dòng)螺桿；以 及聯(lián)接到容器固定器的螺桿從動(dòng)件。傳動(dòng)螺桿與螺桿從動(dòng)件接合，使得由電機(jī)驅(qū)動(dòng)的傳動(dòng) 螺桿的旋轉(zhuǎn)引起容器