用于除去蛋白質(zhì)聚集體的具有磺酸基團(tuán)的膜的制作方法
【專利說(shuō)明】
[0001] 本申請(qǐng)是2010年02月26日提交的名稱為"用于除去蛋白質(zhì)聚集體的具有磺酸基 團(tuán)的膜"的201080009642. 8號(hào)申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明總體涉及用于從蛋白質(zhì)溶液中除去生物物質(zhì)的介質(zhì)。更具體而言，本發(fā)明 涉及用聚合的交聯(lián)涂層組合物飽和的帶負(fù)電荷的濾膜以及制備和使用所述濾膜的方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 在衍生自完整有機(jī)體或哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源的基于蛋白質(zhì)的治療性生物分 子的生產(chǎn)過(guò)程中除去蛋白質(zhì)聚集體和病毒顆粒是經(jīng)常遇到的分離任務(wù)。例如，衍生自血漿 的蛋白質(zhì)溶液例如免疫球蛋白（IgG)和其他蛋白質(zhì)（天然的或重組的）例如單克隆抗體 (mAb)、肽、糖和/或核酸通常包含堵塞并且污染病毒截留濾器等的蛋白質(zhì)聚集體，其包含 蛋白質(zhì)三聚體或更大的蛋白質(zhì)聚合物。
[0004] 通過(guò)過(guò)濾從蛋白質(zhì)溶液除去病毒顆粒的常見(jiàn)問(wèn)題是使用相對(duì)低容量的超濾濾器， 這顯著增加成本并且減慢過(guò)濾操作。由于病毒顆粒的尺寸僅比蛋白質(zhì)分子的尺寸大約3-5 倍，即約25nm對(duì)約5-10nm，所以不得不仔細(xì)選擇濾器的孔徑使其處于這些個(gè)體的尺寸之 間，通常約20nm。因此，約大于三聚體或更大的蛋白質(zhì)聚合物的蛋白質(zhì)聚集體以及變性蛋白 質(zhì)、脂質(zhì)、甘油三酯等不能通過(guò)典型的病毒截留濾器，引起孔阻塞并且顯著降低濾器的容量 (通量）。即使在〇. 01-0. 1 %的低濃度下這些不需要的和不期望的組分也會(huì)快速堵塞病毒 截留濾器。
[0005] 但是，由于不斷增加的溶液效價(jià)，蛋白質(zhì)聚集仍然是基于蛋白質(zhì)的治療性生物分 子的生物加工生產(chǎn)中日益嚴(yán)峻的問(wèn)題。蛋白質(zhì)聚集體在純化過(guò)程的不同階段形成，并且為 了維持病毒截留濾器足夠的通量，需要在蛋白質(zhì)聚集體到達(dá)病毒截留濾器之前將其除去。 從蛋白質(zhì)溶液選擇性除去約大于三聚體或更大的蛋白質(zhì)聚合物的蛋白質(zhì)聚集體的可選擇 方法包括使用昂貴的凝膠色譜或者分子排阻色譜。選擇性除去蛋白質(zhì)聚集體的最方便的方 式是使蛋白質(zhì)和/或其他生物分子的溶液在到達(dá)位于下游的病毒顆粒超濾截留濾器之前 通過(guò)上游的過(guò)濾介質(zhì)，由此在上游選擇性截留蛋白質(zhì)聚集體，允許蛋白質(zhì)溶液中的蛋白質(zhì) 單體流過(guò)病毒截留濾器。
[0006] 從蛋白質(zhì)溶液除去蛋白質(zhì)聚集體和病毒顆粒的一種方法包括兩步超濾法，在各步 驟中使用超濾膜。參見(jiàn)例如Antoniou的第6, 365, 395號(hào)美國(guó)專利，其中在第一過(guò)濾步驟中 在上游從蛋白質(zhì)溶液除去蛋白質(zhì)聚集體，在第二過(guò)濾步驟中，在下游從不含蛋白質(zhì)聚集體 的蛋白質(zhì)溶液除去病毒顆粒。
[0007] Siwak等人的第7, 118, 675號(hào)美國(guó)專利教導(dǎo)了用于從蛋白質(zhì)流除去蛋白質(zhì)聚集體 和病毒顆粒的另一種兩步過(guò)濾法，其中首先將蛋白質(zhì)流通過(guò)一層或多層吸附性深層濾器、 帶電荷的或表面改性的多孔膜或者小的色譜介質(zhì)床過(guò)濾，以產(chǎn)生不含蛋白質(zhì)聚集體的蛋白 質(zhì)流。之后是使回收的溶液經(jīng)過(guò)超濾膜以除去病毒顆粒的第二步驟。
[0008] 可用于預(yù)處理蛋白質(zhì)流的一種方法采用使用與無(wú)機(jī)助濾劑組合的纖維素介質(zhì)的 深層過(guò)濾。例如，可商購(gòu)自Millipore Corporation的Viresolv# Prefilter當(dāng)被用于在 病毒過(guò)濾前預(yù)處理蛋白質(zhì)流時(shí)可增加細(xì)小病毒濾器的通量。但是，該預(yù)濾器表現(xiàn)出對(duì)苛性 堿處理的抗性不足以及相對(duì)較高的有機(jī)可提取物。由于經(jīng)常需要使用苛性堿溶液清潔或消 毒病毒濾器，因此當(dāng)將病毒濾器與預(yù)濾器組合時(shí)如果可以通過(guò)相同的處理將二者串聯(lián)消毒 則該消毒方法將變得顯著地更有效和經(jīng)濟(jì)。因此，期望提供能夠抵抗暴露于苛性堿水溶液 (例如0.1 N NaOH 1小時(shí)）而不損失預(yù)過(guò)濾性質(zhì)的用于蛋白質(zhì)溶液的預(yù)處理介質(zhì)。另外，通 常在蛋白質(zhì)純化過(guò)程后期進(jìn)行病毒過(guò)濾，此時(shí)需要將進(jìn)入流體流的有機(jī)可提取物的量最小 化?；诶w維素和助濾劑的深層濾器已顯示出與膜相比顯著更高水平的可提取物，并因此 就生物分子等的后期純化而言可能具有潛在問(wèn)題。
[0009] 因此，期望提供過(guò)濾介質(zhì)以及使用和制備所述過(guò)濾介質(zhì)的方法和裝置，用于通過(guò) 上游的預(yù)過(guò)濾方法從包含蛋白質(zhì)和/或生物分子的溶液中除去蛋白質(zhì)聚集體和其他堵塞 性和結(jié)垢性組分，所述預(yù)過(guò)濾方法避免下游過(guò)濾介質(zhì)（例如與下游的從包含蛋白質(zhì)和/或 生物分子的溶液超濾除去病毒顆粒聯(lián)合使用的那些下游過(guò)濾介質(zhì)）的過(guò)早堵塞。
[0010] 通過(guò)本文提供的本發(fā)明的描述，本發(fā)明的這些優(yōu)點(diǎn)以及另外的發(fā)明特征將是顯而 易見(jiàn)的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 對(duì)應(yīng)于上述與在衍生自完整有機(jī)體或哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源的生物分子和基 于蛋白質(zhì)的治療性生物分子的生產(chǎn)中除去蛋白質(zhì)聚集體和病毒顆粒相關(guān)的需要，本發(fā)明在 某些實(shí)施方案中教導(dǎo)了具有高電荷密度的帶負(fù)電荷的微孔過(guò)濾介質(zhì)，其具有苛性堿穩(wěn)定性 (即可以抵抗被堿性溶液的降解）并且適合用于在超濾除去病毒顆粒的上游從蛋白質(zhì)溶液 選擇性除去蛋白質(zhì)聚集體。
[0012] 本發(fā)明在某些實(shí)施方案中教導(dǎo)了在進(jìn)行下游的蛋白質(zhì)流的病毒過(guò)濾或其他生物 加工步驟之前在上游從蛋白質(zhì)流除去蛋白質(zhì)聚集體。在上游除去蛋白質(zhì)聚集體可減少否則 會(huì)出現(xiàn)在下游病毒濾器的污染和堵塞，由此增加它們的通量和流量。
[0013] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明教導(dǎo)了用于從蛋白質(zhì)溶液除去蛋白質(zhì)聚集體的一次性 的帶負(fù)電荷的微孔介質(zhì)，由此省去了與在使用間隔清潔和儲(chǔ)存過(guò)濾介質(zhì)相關(guān)的費(fèi)用，還省 去了與根據(jù)政府管理機(jī)構(gòu)的要求驗(yàn)證此類清潔操作相關(guān)的費(fèi)用和時(shí)間。
[0014] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有高電荷密度的帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的微孔介 質(zhì)，其包括微孔基質(zhì)和交聯(lián)的涂層組合物，所述交聯(lián)的涂層組合物通過(guò)暴露于電子束并且 在不存在化學(xué)聚合自由基引發(fā)劑的條件下在該基質(zhì)的外表面和內(nèi)表面上原位聚合。所述交 聯(lián)的涂層組合物優(yōu)選由帶負(fù)電荷的自由基可聚合的丙烯酰氨基烷基單體和丙烯酰氨基交 聯(lián)劑形成。
[0015] 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有高電荷密度的帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的微孔介 質(zhì)，其包括微孔基質(zhì)和交聯(lián)的涂層組合物，所述交聯(lián)的涂層組合物由具有包含帶負(fù)電荷的 懸垂的磺酸的基團(tuán)及其鹽的可聚合的多官能丙烯酰氨基烷基單體和多官能丙烯酰氨基交 聯(lián)劑形成，在所述基質(zhì)的外表面和內(nèi)表面原位聚合。盡管聚合優(yōu)選地在不存在化學(xué)聚合自 由基引發(fā)劑的條件下通過(guò)將單體/交聯(lián)劑/介質(zhì)系統(tǒng)暴露于電離輻射例如電子束而引發(fā)， 但是也可使用適合的化學(xué)聚合自由基引發(fā)劑以引發(fā)聚合。
[0016] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明教導(dǎo)了帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的微孔介質(zhì)，其包括微孔 基質(zhì)和由反應(yīng)物溶液形成的交聯(lián)的涂層組合物，所述反應(yīng)物溶液包含2-丙烯酰氨基-2-甲 基丙磺酸（AMPS)單體及其鹽的可聚合的單體和Ν，Ν' -亞甲基雙丙烯酰胺（MBAm)交聯(lián)劑， 在所述基質(zhì)的內(nèi)表面和外表面上原位聚合。所得聚合的交聯(lián)的涂層組合物僅包含酰胺-酰 胺交聯(lián)鍵。
[0017] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明教導(dǎo)了帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的微孔膜，其包括微孔基 質(zhì)和AMPS及其鹽的交聯(lián)的聚合涂層組合物，其中所述交聯(lián)的涂層組合物在所述基質(zhì)的內(nèi) 表面和外表面上原位聚合。
[0018] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明教導(dǎo)了微孔膜，其具有覆蓋所述微孔基質(zhì)的全部?jī)?nèi) 表面和外表面的聚合的交聯(lián)的涂層組合物，還包含補(bǔ)加的改性單體，其優(yōu)選地以少于帶負(fù) 電荷的包含磺酸的基團(tuán)單體或交聯(lián)劑的量存在。
[0019] 在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了經(jīng)涂覆的微孔膜，適合用于預(yù)過(guò)濾裝置中，用于 從終端常規(guī)過(guò)濾（NFF)法中的蛋白質(zhì)溶液選擇性除去蛋白質(zhì)聚集體。將蛋白質(zhì)溶液通過(guò)包 括一層或多層本文教導(dǎo)的經(jīng)涂覆的微孔膜的過(guò)濾介質(zhì)預(yù)過(guò)濾，以回收幾乎不含蛋白質(zhì)聚集 體的蛋白質(zhì)溶液。
[0020] 在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備具有高電荷密度的帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的微 孔介質(zhì)的方法，其中所述微孔基質(zhì)用交聯(lián)的涂層組合物涂覆，與交聯(lián)的涂層組合物接觸，或 用交聯(lián)的涂層組合物飽和，所述交聯(lián)的涂層組合物包含帶負(fù)電荷的包含磺酸基團(tuán)的可聚合 的丙烯酰氨基烷基單體和丙烯酰氨基交聯(lián)劑以及任選存在的化學(xué)自由基引發(fā)劑，沉積在所 述微孔基質(zhì)的全部?jī)?nèi)表面和外表面。
[0021] 在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了制備具有高電荷密度的帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的 微孔介質(zhì)的方法，其中在微孔基質(zhì)的全部外表面和內(nèi)表面上用聚合的交聯(lián)的涂層組合物 涂覆，所述交聯(lián)的涂層組合物包含可聚合的AMPS及其鹽的單體和丙烯酰氨基交聯(lián)劑例如 MBAm，使得所述交聯(lián)的涂層組合物在所述微孔基質(zhì)的全部?jī)?nèi)表面和外表面上原位聚合。
[0022] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用聚合的交聯(lián)的涂層組合物涂覆的微孔基質(zhì) 的制備方法，其包括以下步驟：a)提供微孔基質(zhì)；b)任選地用潤(rùn)濕液洗滌所述微孔基質(zhì)從 而將基質(zhì)的全部?jī)?nèi)表面和外表面潤(rùn)濕；c)任選地用第二種潤(rùn)濕液洗滌所述微孔基質(zhì)的潤(rùn) 濕表面以置換第一種潤(rùn)濕液，使所述基質(zhì)的外表面和內(nèi)表面被第二種液體潤(rùn)濕；d)使所述 基質(zhì)與反應(yīng)物溶液接觸，所述反應(yīng)物溶液包含帶負(fù)電荷的可聚合的丙烯酰氨基烷基單體、 丙烯酰氨基交聯(lián)劑例如MBAm和任選存在的自由基聚合引發(fā)劑；e)使帶負(fù)電荷的交聯(lián)的丙 烯酰氨基烷基單體涂層組合物沉積在所述基質(zhì)的內(nèi)表面和外表面上；f)從反應(yīng)物溶液中 取出用交聯(lián)的涂層組合物飽和的經(jīng)涂覆的基質(zhì)；g)使交聯(lián)的丙烯酰氨基烷基涂層組合物 聚合，在所述基質(zhì)的全部?jī)?nèi)表面和外表面上形成聚合的交聯(lián)的涂層組合物；h)在水和/或 有機(jī)溶劑中清洗所述經(jīng)涂覆的微孔基質(zhì)，以除去任何未反應(yīng)的物質(zhì)和寡聚體物質(zhì)；以及i) 干燥所述經(jīng)涂覆的微孔基質(zhì)。
[0023] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過(guò)兩步過(guò)濾法從蛋白質(zhì)溶液中選擇性分離 蛋白質(zhì)聚集體和病毒顆粒，其包括首先在常規(guī)過(guò)濾模式下將蛋白質(zhì)溶液通過(guò)具有一層或多 層本文所教導(dǎo)的經(jīng)涂覆的微孔膜的預(yù)過(guò)濾裝置過(guò)濾，然后回收基本不含蛋白質(zhì)聚集體的蛋 白質(zhì)溶液。第二個(gè)過(guò)濾步驟包括在NFF模式或切向流過(guò)濾（TFF)模式下將回收的蛋白質(zhì)溶 液通過(guò)一個(gè)或多個(gè)超濾病毒去除膜過(guò)濾，以截留病毒顆粒并且允許不含病毒顆粒的蛋白質(zhì) 溶液從其通過(guò)。
[0024] 在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的微孔膜，其適合用于使用 終端NFF法的預(yù)過(guò)濾裝置中，用于從蛋白質(zhì)的水溶液中選擇性地除去蛋白質(zhì)聚集體和其他 結(jié)垢性和堵塞性組分。
[0025] 在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了使用預(yù)過(guò)濾裝置的預(yù)過(guò)濾法，所述預(yù)過(guò)濾裝置 包括一個(gè)或多個(gè)本文教導(dǎo)的一次性的經(jīng)涂覆的微孔膜，用于通過(guò)使用NFF法從生物溶液中 選擇性地除去蛋白質(zhì)聚集體。
[0026] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在除去病毒顆粒之前從含有生物分子的水溶液 中選擇性地除去蛋白質(zhì)聚集體的方法，包括在NFF操作模式下將含有生物分子的水溶液通 過(guò)一個(gè)或多個(gè)本文教導(dǎo)的經(jīng)涂覆的微孔膜過(guò)濾，和回收基本不含蛋白質(zhì)聚集體的含有生物 分子的溶液。
[0027] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供在下游除去病毒顆粒之前從包含生物分子的水溶液 中選擇性地除去蛋白質(zhì)聚集體、變性蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、甘油三酯等的方法，包括在NFF操作模 式下將生物分子水溶液通過(guò)一個(gè)或多個(gè)本文教導(dǎo)的預(yù)過(guò)濾經(jīng)涂覆的微孔膜過(guò)濾，和回收基 本不含蛋白質(zhì)聚集體、變性蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、甘油三酯等的生物分子水溶液。
[0028] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在NFF操作模式中使用一個(gè)或多個(gè)本文教導(dǎo) 的帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的微孔膜從蛋白質(zhì)溶液中選擇性地除去蛋白質(zhì)聚集體的方法。
[0029] 在其他實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在NFF模式中使用一個(gè)或多個(gè)本文教導(dǎo)的帶負(fù)電 荷的經(jīng)涂覆的微孔膜從蛋白質(zhì)溶液中選擇性地除去蛋白質(zhì)聚集體，之后通過(guò)一個(gè)或多個(gè)超 濾病毒去除膜以NFF或TFF模式除去病毒顆粒的方法。
[0030] 本發(fā)明還提供處理包含帶正電荷的生物分子的生物流體的方法，其包括使所述生 物流體與本文教導(dǎo)的帶負(fù)電荷的經(jīng)涂覆的微孔膜接觸。
[0031] 本發(fā)明還提供包括一種或多種本文教導(dǎo)的具有高電荷密度的帶負(fù)電荷的微孔經(jīng) 涂覆的基質(zhì)的濾器裝置、色譜裝置和/或膜組件。
[0032] 本發(fā)