核殼型磁性金屬有機(jī)骨架納米顆粒的制備及其應(yīng)用
【專利說明】
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及化工技術(shù)領(lǐng)域，具體地說，是一種核殼型磁性金屬有機(jī)骨架納米顆粒的制備及其應(yīng)用。
【【背景技術(shù)】】
[0002]蛋白質(zhì)的可逆磷酸化修飾是最重要的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式之一，調(diào)控著眾多生理過程，如細(xì)胞分裂、細(xì)胞增殖、信號傳導(dǎo)和新陳代謝等。據(jù)估計(jì)，在同一時(shí)刻有30%的蛋白質(zhì)處于磷酸化修飾狀態(tài)，所以對蛋白質(zhì)的磷酸化機(jī)理的研宄對于蛋白組學(xué)十分重要。磷酸化蛋白的定量以及定性檢測是了解這些過程的前提。如今，質(zhì)譜已被證明是分析和鑒定蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)的有效工具。然而，直接用質(zhì)譜分析樣品仍存在著許多問題。比如，磷酸肽在生物樣品中含量低，質(zhì)譜分析時(shí)離子化效率較低，同時(shí)存在大量非磷酸肽干擾信號。因此，在質(zhì)譜分析復(fù)雜樣品前，采用預(yù)富集方法進(jìn)行樣品前處理是十分重要的。
[0003]為了提高樣品中磷酸肽的質(zhì)譜信號，當(dāng)前已發(fā)展了多種分離技術(shù)和富集材料用于富集磷酸肽和磷酸化蛋白，如金屬氧化物親和色譜法(MOAC)，固定金屬離子親和色譜法(IMAC)，強(qiáng)陽離子交換色譜法(SCX)和強(qiáng)陰離子交換色譜法(SAX)等。其中，固定金屬離子親和色譜法已成為一種最重要的技術(shù)，其基本原理是基于聚合物基質(zhì)、多孔基質(zhì)和納米顆粒表面的金屬離子與磷酸肽基團(tuán)之間強(qiáng)烈的螯合作用。一系列的不同基質(zhì)(如硅膠、聚合物、磁球、介孔微粒)的IMAC材料已被廣泛應(yīng)用于磷酸肽富集中。近年來，微孔IMAC材料由于其較大的比表面積，較大的孔體積，規(guī)整的孔結(jié)構(gòu)而被廣泛應(yīng)用于磷酸肽研宄。鄧等合成了一種多巴胺包裹的介孔硅材料，并在表面修飾有大量的Ti4+，對磷酸化蛋白的富集顯示出較高的選擇性，較低的檢測限，較大的富集容量。盡管已有前人的研宄成果，設(shè)計(jì)合成出新型的帶有大量作用位點(diǎn)以及易于分離的微孔IMAC材料仍然是磷酸化蛋白富集的一個(gè)研宄熱點(diǎn)。
[0004]對于傳統(tǒng)的IMAC技術(shù)，樣品的分離需要高速離心，過程繁瑣且目標(biāo)磷酸肽丟失不可避免。作為一種替代技術(shù)，磁性基質(zhì)因易于制備，便于分離得到了廣泛的關(guān)注。近年來功能化的磁性納米材料已被廣泛應(yīng)用于蛋白組學(xué)。對于磷酸肽的富集，研宄者設(shè)計(jì)出一系列的磁性納米材料，大都顯示出好的選擇以及富集效率。微孔磁性IMAC材料具有大的比表面積，能提供更多的作用位點(diǎn)從而進(jìn)一步提高富集效率。陸等制備了一種磁性介孔鈦微球，具有大的比表面積，符合窄分布的孔徑，較好的磁響應(yīng)且對磷酸肽具有較好的特異性以及較大的富集容量。因此，迄今為止，設(shè)計(jì)新型的介孔磁性IMAC材料仍然是蛋白組學(xué)的研宄熱點(diǎn)。
[0005]金屬有機(jī)骨架材料是一類以金屬離子為配位中心，與有機(jī)配體通過配位作用形成的多孔配位聚合物。金屬有機(jī)骨架材料具有超高比表面積、超大孔體積、良好的熱穩(wěn)定性、介孔孔徑、孔內(nèi)和孔外易于修飾等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于氣體存儲、催化、藥物載體、吸附和分離等領(lǐng)域。因?yàn)镸OF材料表面易于修飾，且具有孔特征，因此在蛋白組中的應(yīng)用日漸廣泛。此夕卜，由于nm級的孔徑使得MOF材料對一些較大的蛋白具有體積排阻效應(yīng)，并捕捉分子量較小的蛋白以及肽段。然而迄今為止很少有具有IMAC特性的MOF材料被用于磷酸肽的富集。鄧等制備了一種基于鋯離子的親水MOF材料，此材料將磁球的易于分離，多巴胺的親水性以及MOF材料的大的比表面積等優(yōu)點(diǎn)結(jié)合，在磷酸化蛋白的富集中顯示出較高的選擇性以及富集效率，但是合成方法較為復(fù)雜。因此，用一種簡單，有效的方法制備一種磁性的MOF材料對于磷酸肽的富集仍然是技術(shù)熱點(diǎn)。
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【發(fā)明內(nèi)容】
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[0006]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種核殼型磁性金屬有機(jī)骨架納米顆粒的制備及其應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的:
[0008]一種核殼型磁性金屬有機(jī)骨架納米顆粒的制備方法，其具體步驟為:
[0009](I) I?2g的三氯化鐵和70?80mL的乙二醇和3?4g的檸檬酸鈉進(jìn)行均勻混合，在150?250°C進(jìn)行高溫水解反應(yīng)，得到順磁性的磁性納米基質(zhì)；
[0010](2)將300?400mg步驟⑴制備的順磁性的磁性納米基質(zhì)分散在80?10mL乙醇溶液中，逐滴加入5?10 μ L的0.3?0.6mmol L—1巰基乙酸機(jī)械攪拌20?26小時(shí)，得到羧基修飾的磁性納米顆粒，乙醇清洗2?3次；
[0011](3)將100?200mg步驟⑵中制備的羧基修飾的磁性納米顆粒分散在5?1mL的1mmol T1FeCl3.6H20的乙醇溶液，室溫下靜置15?20min，所得納米顆粒用乙醇清洗2?3次除去未被吸附的FeCl3.6H20 ;隨后，把磁性納米顆粒分散于5?1mL含1mmol1711，3，5-均苯三甲酸的乙醇溶液，在70°0下靜置30?60min ;如此循環(huán)操作10?40次，得到磁性納米顆粒在150°C下真空干燥12?24小時(shí)，得到核殼型磁性金屬有機(jī)骨架納米顆粒。
[0012]一種核殼型磁性金屬有機(jī)骨架納米顆粒在選擇性富集內(nèi)源性磷酸肽中的應(yīng)用，其具體方法為:
[0013](I)將制得的核殼型磁性金屬有機(jī)骨架納米顆粒用水和乙腈分別清洗I?3次，去除殘留的反應(yīng)試劑；
[0014](2)將步驟⑴清洗后的核殼型磁性金屬有機(jī)骨架納米顆粒與0.8?1.2mg/L磷酸肽溶液例如α-酪蛋白(a-Casin)酶解液和酪蛋白(β-Casin)酶解液混合溶于體積比為1:1?3: 7的水和乙腈的混合溶液中，20?30°C條件下震蕩孵育30?50min;利用磁分離對含有磷酸化蛋白或者多肽進(jìn)行選擇性富集和快速分離，實(shí)現(xiàn)對高豐度的多肽或蛋白進(jìn)行的去除和低豐度的磷酸肽或蛋白的富集；
[0015](3)將步驟⑵中吸附多肽或蛋白的磁性金屬有機(jī)骨架納米顆粒用5%?10%氨水溶液進(jìn)行洗脫，利用基質(zhì)輔助激光解析串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對所富集的肽段進(jìn)行定性定量分析。
[0016]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的積極效果是:
[0017]采用多層自主裝法制備了核殼結(jié)構(gòu)磁性金屬有機(jī)骨架納米顆粒，F(xiàn)e3O4OMIL-1OO(Fe)，并將其應(yīng)用于選擇性富集樣品中的磷酸化肽。完美的孔結(jié)構(gòu)以及大量的Fe3+離子大大增加的材料與磷酸肽的作用位點(diǎn)，提高了材料的選擇性，檢測限，以及富集容量。選用牛血清白蛋白和酪蛋白酶解液考察了 Fe3O4麵IL-100 (Fe)納米顆粒對肽段的吸附性能及對蛋白的排阻