一種陽離子交換層析柱的清洗方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及層析柱的清洗方法，特別涉及一種陽離子交換層析柱的清洗方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在生物制藥領(lǐng)域，陽離子交換層析柱被廣泛應(yīng)用。在陽離子交換層析柱使用后，填 料中會有一些殘留物質(zhì)，可能會對下次使用造成污染，引入外來污染物，比如會對下一次使 用引入內(nèi)毒素或者將上一次沒有清洗干凈的蛋白引入到下次產(chǎn)物中。
[0003] 現(xiàn)有清洗方法主要用水浸泡沖洗，或用緩沖溶液，酸，堿等溶液進(jìn)行浸泡沖洗，但 因沒有適當(dāng)?shù)臋z測方法對清洗過的填料進(jìn)行檢測，對清洗效果無法保障。為保證每次使用 后的陽離子交換層析柱清洗干凈，不會對下一次使用造成污染，需要建立規(guī)范的陽離子交 換層析柱的清洗流程。
[0004] 本發(fā)明經(jīng)過研究，找到一種簡單易行，適合工業(yè)化的清洗方法，即通過三步清洗 法，可以保證內(nèi)毒素和總有機(jī)碳清洗合格。本發(fā)明通過固定并優(yōu)化的清洗方法對陽離子交 換層析柱進(jìn)行清洗，使得陽離子交換層析柱清洗效果得到了保障，去除了陽離子交換層析 內(nèi)的內(nèi)毒素，微生物以及上一次使用殘留的蛋白，確保了總有機(jī)碳檢驗合格。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了一種陽離子交換層析柱的清洗方法，所述清洗是指對使用過或?qū)⒁?使用的不潔填料進(jìn)行清洗，清洗合格后進(jìn)行下一次的柱層析。
[0006] 本發(fā)明所述陽離子交換層析柱，其填料為任何一種具有陽離子交換層析功能的填 料，優(yōu)選：SPSepharoseFastFlow，SSepharoseFastFlow最優(yōu)選的為SPSepharose FastFlow。
[0007] 上述填料均可以通過現(xiàn)有技術(shù)制備，也可通過購買得到。
[0008] 本發(fā)明提供一種陽離子交換層析柱的清洗方法，包括如下步驟：
[0009]步驟1，
[0010] 將不潔的陽離子交換層析柱填料，用水清洗，再用NaOH水溶液清洗；
[0011] 步驟 2，
[0012] 用平衡緩沖液（pH5. 0-8)清洗。
[0013] 根據(jù)需要，本發(fā)明還包括步驟3和步驟4的步驟，如下：
[0014]步驟 3，
[0015] 取步驟2得到的清洗液，滴磷酸，觀察有無沉淀產(chǎn)生，如無沉淀，用總有機(jī)碳分析 儀測定該清洗液，測定結(jié)果低于500ppm，則表示清洗合格。
[0016]步驟 4，
[0017] 若有沉淀產(chǎn)生，須用水將清洗液稀釋直至滴加磷酸后無沉淀出現(xiàn)后，將稀釋后的 清洗液用總有機(jī)碳分析儀測定該清洗液，測定結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)獲得的數(shù)據(jù)低于500ppm， 則表示清洗合格
[0018] 本發(fā)明所述的陽離子交換層析柱，優(yōu)選填料為SPSepharoseFastFlow;柱型號： BPG100、BPG500、XK2、XK20、XK50、XK20 中一種，優(yōu)選BPG100。所述的柱子徑高比：（0? 5-1): 1，優(yōu)選（0. 5-0. 7) :1。最優(yōu)選柱子高15cm以內(nèi)，直徑：10cm。
[0019] 本發(fā)明的清洗方法，可以將填料從層析柱上取下后在容器中清洗，也可裝在層析 柱中清洗，優(yōu)選裝在層析柱中清洗，其中清洗液流速為120-150ml/min，優(yōu)選120ml/min。
[0020] 本發(fā)明步驟（1)中所述的水優(yōu)選為注射用水，清洗時間為30_45min。
[0021] 所述的氫氧化鈉水溶液優(yōu)選1-1. 5M的氫氧化鈉水溶液，清洗時間90min以上，最 佳為I.OM氫氧化鈉清洗90-100min。
[0022] 所述的IM氫氧化鈉配制方法：稱取氫氧化鈉400. 0g，用注射用水將其移入血清瓶 或儲液袋中，放入攪拌子，移至磁力攪拌器上使固體全部溶解均勻，將血清瓶或儲液袋內(nèi)溶 液標(biāo)定到10L，繼續(xù)攪拌2分鐘。配制后放置于2~12°C環(huán)境的準(zhǔn)備間指定區(qū)域內(nèi)備用。
[0023] 本發(fā)明步驟（2)中所述的平衡緩沖液優(yōu)選為磷酸緩沖液并含NaCl，優(yōu)選0.Olmol/ L磷酸緩沖液（pH6. 0含0. 1-0. 2MNaCl)，最佳為0.Olmol/L磷酸緩沖液（pH6. 0含0.IM NaCD0
[0024] 優(yōu)選所述的0?Olmol/L平衡緩沖液（pH6. 0±0. 1含0?lmol/LNaCl)的配制：稱 取氯化鈉58. 9g，磷酸二氫鈉12. 0g，磷酸氫二鈉2. 0g，用注射用水將其移入血清瓶或儲液 袋中，放入攪拌子，移至磁力攪拌器上使固體全部溶解均勻，將血清瓶或儲液袋內(nèi)溶液標(biāo)定 到10L，繼續(xù)攪拌2分鐘，確定其pH值在6.0±0. 1范圍內(nèi)。配制后放置于2~12°C環(huán)境的 準(zhǔn)備間指定區(qū)域內(nèi)備用。
[0025] 本發(fā)明步驟（3)中所述的滴磷酸，是將清洗液加到容器中，加入濃度的磷酸，靜置， 肉眼觀察有無沉淀析出。其目的是初步確認(rèn)清洗液中含碳量，如果出現(xiàn)沉淀說明含碳量較 高，可能在檢驗過程中會堵塞總有機(jī)碳分析儀管路。
[0026] 所述用總有機(jī)碳分析儀測定，是用總有機(jī)碳分析儀清洗液中的總有機(jī)碳濃度。本 發(fā)明步驟（4)中所述的須用水稀釋清洗液，方法如下：若有沉淀產(chǎn)生，須用水將清洗液稀釋 直至滴加磷酸后無沉淀出現(xiàn)后，將稀釋后的清洗液用總有機(jī)碳分析儀測定該清洗液，測定 結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)獲得的數(shù)據(jù)低于500ppm，則表示清洗合格。
[0027] 本發(fā)明相關(guān)術(shù)語的解釋：
[0028] 1、陽離子交換層析：是蛋白分離的一種技術(shù)，主要依賴電荷間的相互作用，利用帶 電分子中電荷微小差異進(jìn)行蛋白質(zhì)分離。
[0029] 2、內(nèi)毒素：是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分，叫做脂多糖。脂多糖對宿主是 有毒性的。內(nèi)毒素只有當(dāng)細(xì)菌死亡溶解或用人工方法破壞菌細(xì)胞后才釋放出
[0030]來。
[0031] 3、總有機(jī)碳（T0C):是指水體中溶解性和懸浮性有機(jī)物含碳的總量。TOC是一個快 速檢定的綜合指標(biāo)，它以碳的數(shù)量表示水中含有機(jī)物的總量，單位為ppm或ppb。在國際上 TOC被作為評價水體中有機(jī)物污染程度的一項重要參考指標(biāo)。
[0032] 本發(fā)明的陽離子交換層析柱的清洗方法，是經(jīng)過篩選獲得的，篩選過程如下：
[0033] 1、清洗液濃度的選擇
[0034]下表1清洗液按照實施例的順序沖洗，結(jié)果如下：
[0035]表1
[0041] 從上表2可見，清洗液用時間100與110效果相同，出于節(jié)省原則，優(yōu)選清洗液時 間為 90-100min。
[0042] 以下通過比較實驗證明本發(fā)明的有益效果：
[0043] 現(xiàn)有技術(shù)沖柱子方法與本發(fā)明的方法進(jìn)行比較
[0044]表 3
[0045]
[0046] 現(xiàn)有技術(shù)沖柱子方法1:
[0047] 將使用過的陽離子交換層析柱首先用注射用水清洗30min，然后用IMNaOH清洗 60min，最后用 0?Olmol/L平衡緩沖液（pH6. 0±0. 1 含 0?lmol/LNaCl)沖柱子 90min，清洗 時液體流速為：120ml/min;取柱子流出液進(jìn)行內(nèi)毒素及TOC檢測，結(jié)果不符合要求。
[0048] 現(xiàn)有技術(shù)方法2:
[0049] 將使用過的陽離子交換層析柱首先用注射用水清洗30min，然后用0. 5MNaOH清 洗 90min，最后用 0.Olmol/L平衡緩沖液（pH6. 0±0. 1 含 0.lmol/LNaCl)沖柱子 90min， 清洗時液體流速為：120ml/min;取柱子流出液進(jìn)行內(nèi)毒素及TOC檢測，結(jié)果不符合要求。
[0050] 試驗例2
[0051] 對本發(fā)明實施例1的方法進(jìn)行了多次實證實驗，證明在本發(fā)明的條件下，用實施 例1的方法，內(nèi)毒素含量，總有機(jī)碳含量，微生物含量，合格率可以達(dá)到99%。實驗如下：
[0052] 陰離子交換層析柱使用完畢開始清洗
[0053] 清洗時液體流速為：120ml/min
[0054] 用注射用水清洗3900ml
[0055] 用 0? 5MNaOH含IMNaCl清洗 3900 ~4200ml
[0056] 用注射用水清洗3900ml
[0057] 用30%異丙醇清洗3900ml
[0058] 用 25% 乙酸清洗 3900ml
[0059] 用注射用水清洗3900~4200ml
[0060] 用 0? 5MNaOH含IMNaCl清洗 3900 ~4200ml
[0061] 然后用磷酸緩沖液（0?OlMPBS(pH6. 0 含 0? 1 ~0? 2MNaCl))沖柱子 13000ml;
[0062] 清洗結(jié)束后，將層析柱保存于2~12°C的層析柜內(nèi)
[0063] 其中，內(nèi)毒素含量的檢測方法如下：
[0064]I. 1檢驗前準(zhǔn)備
[0065] I. I. 1實驗開始前準(zhǔn)備鱟試劑、陽性對照液、細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水、樣品及實驗相 關(guān)用品（除熱源槍頭、移液器、酒精、剪刀、封口膜等）；
[0066]I. 1. 2輕敲干粉狀鱟試劑安瓿瓶上部，使瓶內(nèi)干粉末保留在瓶底部，避免開瓶時丟 失粉末；
[0067] 1. 1.3用75%酒精將安瓿瓶外壁擦拭一遍，待酒精揮發(fā)后，小心掰開安瓿瓶。
[0068] L2樣品處理
[0069] 1. 2. 1使用入=0.25EU的鱟試劑進(jìn)行實驗，樣品處理同時進(jìn)行陽性對照、供試品陽 性及陰性對照實驗，作為實驗是否成立的依據(jù)。
[0070] 1. 2. 2陽性對照：取鱟試劑1支，向其中加入0.Iml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶，再 加入0.Iml細(xì)菌內(nèi)毒素陽性對照液（0. 5EU/ml);
[0071] 1. 2. 3陰性對照：取鱟試劑1支，向其中加入0. 2ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水。
[0072] 1. 2. 4供試品陽性：取鱟試劑1支，向其中加入0.Iml純化溶液樣品復(fù)溶，再加入 0.Iml細(xì)菌內(nèi)毒素陽性對照液（0. 5EU/ml);
[0073] 1. 2. 5樣品處理：取鱟試劑1支，向其中加入0.Iml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水復(fù)溶，再 加入0.Iml樣品(具體操作可見下表）；
[0074]
[0075]I. 2. 6樣品保溫：將加樣后的鱟試劑安瓿瓶輕輕混勻后，用封口膜封口，放在試管 架上；將此試管架放入37°C±1°C的恒溫條件，保溫60±2min，保溫過程應(yīng)避免受到震動。
[0076] L2. 7結(jié)果觀察
[0077] 1. 2. 7. 1保溫結(jié)束后，將放有鱟試劑安瓿瓶的試管架從恒溫培養(yǎng)箱中取出；
[0078] 1. 2. 7. 2從試管架上小心拿起鱟試劑安瓿瓶，緩緩倒轉(zhuǎn)180°;
[0079] 1. 2. 7. 3若管內(nèi)形成凝膠，并且凝膠不變形、不從管壁滑脫者為陽性記為（+ );
[0080] 1. 2. 7. 4未形成凝膠或形成的凝膠不堅實、變形并從管壁滑脫者為陰性記為（-);
[0081] 1.2. 8檢驗結(jié)果判定
[0082] 1. 2. 8. 1實驗成立條件：陽性對照管及供試品陽性均為（ + )，陰性對照管為（_)，該 實驗方可成立。
[0083] 1. 2. 8. 2樣品管為（-)，則表明樣品檢測合格（〈0. 25EU/ml)
[0084] 1. 2. 8. 3若樣品為（ + )，取備用樣品進(jìn)行復(fù)試2支，兩支結(jié)果均顯示（_)，則表明樣 品檢測合格（〈〇. 25EU/ml)，否則表明樣品檢測不合格（>0. 25EU/ml)
[0085] 其中
[0086] 總有機(jī)碳含量的檢測方法如下：
[0087] 柱子清洗液，滴磷酸，觀察有無沉淀產(chǎn)生，如無沉淀，用總有機(jī)碳分