明膠親和層析介質(zhì)的體積的3-5倍），至各參數(shù)（例如紫外吸光度UV、pH、 電導(dǎo)等參數(shù)）不變，清洗時間為IOmin以上，分管收集樣品清洗峰，利用蛋白電泳檢測；
[0047] 5)利用洗脫液恒速清洗裝有明膠親和層析介質(zhì)的層析柱（優(yōu)選地，洗脫液的體積 為層析柱中明膠親和層析介質(zhì)的體積的3-5倍），至各參數(shù)（例如UV、pH、電導(dǎo)等參數(shù)）不 變，清洗時間為IOmin以上，收集樣品洗脫峰，并通過測定纖維連接蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算 出纖維連接蛋白濃度，再計算出明膠親和層析介質(zhì)結(jié)合纖維連接蛋白的載量；取洗脫峰的 樣品進(jìn)行蛋白電泳檢測；所述洗脫液為〇? 001-0.5mol/LNa2HP04、0. 001-0.5mol/LKH2P04、 0? 001-0.5mol/LKC1、0. 001-0.5mol/LNaCUL 0-8.Omol/L尿素的混合溶液，所述洗脫液 的 pH 為 7. 0-8. 6 ;
[0048] 6)將層析柱中的明膠親和層析介質(zhì)分別用酸清洗液和堿清洗液交替清洗（優(yōu)選 地，酸清洗液的體積和堿清洗液的體積分別為明膠親和層析介質(zhì)的3-5倍），再用水清洗， 最后用乙醇溶液清洗（優(yōu)選地，乙醇溶液的體積為明膠親和層析介質(zhì)的體積的3-5倍），保 存；所述堿清洗液為NaCl-Tris溶液，pH為7. 0-8. 6 ;所述酸清洗液為NaCl-NaAc溶液，pH 為 2. 0-4. 5。
[0049] 本發(fā)明技術(shù)方案的有益效果是：
[0050] 本發(fā)明將上述制備的明膠親和層析介質(zhì)用于蛋白質(zhì)的分離和純化，尤其是纖維連 接蛋白的分離和純化，與現(xiàn)有技術(shù)的動物血纖維連接蛋白聯(lián)產(chǎn)工藝相比具有以下優(yōu)勢：
[0051] 1、專一性強(qiáng)，本發(fā)明制備的明膠親和層析介質(zhì)與纖維連接蛋白特異性吸附強(qiáng)，本 發(fā)明制備的明膠親和層析介質(zhì)中的多糖高親和性的部位與纖維連接蛋白的結(jié)構(gòu)域相互作 用，可以特異性的吸附纖維連接蛋白；載量可以達(dá)到l_3mg/L，明顯高于其他親和層析介 質(zhì)；
[0052] 2、步驟單一，縮短純化時間，僅僅12-24小時之內(nèi)就可以完成纖維連接蛋白的分 離和純化；
[0053] 3、不僅保證了纖維連接蛋白的活性，而且提高了纖維連接蛋白濃度（纖維連接蛋 白濃度甚至可以達(dá)到8-13mg/L)和純度。
[0054]進(jìn)一步，所述堿清洗液含有 0? 001-0. 5mol/L NaCl 和 0? 001-0. 5mol/L Tris (優(yōu)選 地，Tris-HCl)，所述堿清洗液的pH為7. 0-8. 6。
[0055]進(jìn)一步，所述酸清洗液含有 0? 001-0. 5mol/L NaCl 和 0? 001-0. 5mol/L NaAc，所述 酸清洗液的pH為2. 0-4. 5,所述保存的溫度為4-8 °C。
[0056] 采用上述進(jìn)一步方案的有益效果是：在這個濃度和pH條件下，制備的明膠親和層 析介質(zhì)具有更好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，應(yīng)用更廣泛。
[0057] 本發(fā)明所述的乙醇溶液，優(yōu)選為體積分?jǐn)?shù)20%的乙醇溶液，也可以選擇體積分?jǐn)?shù) 高于20%的乙醇溶液。若不考慮保存的時間盡可能的長，也可以選擇低于體積分?jǐn)?shù)20%的 乙醇溶液。
[0058] 本發(fā)明所述CNBr-瓊脂糖親和層析介質(zhì)指利用溴化氰（CNBr)活化瓊脂糖形成的 親和層析介質(zhì)。
[0059] 本發(fā)明所述的溶液，若沒有特別指出溶劑，溶劑均為水。
[0060] 本發(fā)明中所述的用"A"清洗"B"，清洗完畢后，把A過濾掉，其中"A"和"B"分別代 表不同物質(zhì)。
【附圖說明】
[0061] 圖1為本發(fā)明所述的明膠親和層析介質(zhì)的制備流程；
[0062] 圖2為本發(fā)明制備的明膠親和層析介質(zhì)與現(xiàn)有技術(shù)中三維多孔殼聚糖/明膠微 球圓度對比圖，圖2A為本發(fā)明制備的45-165微米明膠親和層析介質(zhì)的數(shù)碼顯微鏡圖（平 面圖），圖2B為現(xiàn)有技術(shù)中300-500微米三維多孔殼聚糖/明膠微球的掃描電鏡圖（立體 圖）；
[0063] 圖3為實施例1中的原液、流穿液、清洗液、洗脫液的SDS-PAGE圖，從左到右依次 為原液、清洗液、洗脫液、流穿液；
[0064] 圖4為實施例2中的原液、流穿液、清洗液、洗脫液的SDS-PAGE圖，從左到右依次 為原液、流穿液、洗脫液、清洗液；
[0065] 圖5為實施例3中的原液、流穿液、清洗液、洗脫液的SDS-PAGE圖，從左到右依次 為原液、洗脫液、流穿液、清洗液。
[0066] 圖6為實施例4中的原液、流穿液、清洗液、洗脫液的SDS-PAGE圖，從左到右依次 為清洗液、洗脫液、流穿液、原液。
[0067] 圖7為實施例5中的原液、流穿液、清洗液、洗脫液的SDS-PAGE圖，從左到右依次 為清洗液、洗脫液、流穿液、原液。
【具體實施方式】
[0068] 以下結(jié)合附圖對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并 非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0069] 如圖1所示，一種明膠親和層析介質(zhì)的制備方法，包括以下步驟：
[0070] 1)稱取CNBr-瓊脂糖親和層析介質(zhì)加入到抽濾漏斗中，利用4-8°C預(yù)冷的激活液 清洗CNBr-瓊脂糖親和層析介質(zhì)，激活液的體積為CNBr-瓊脂糖親和層析介質(zhì)的體積的 5-10倍，清洗15-30min，去除激活液；再用4-8°C預(yù)冷的結(jié)合液清洗CNBr-瓊脂糖親和層析 介質(zhì)，結(jié)合液的體積為CNBr-瓊脂糖親和層析介質(zhì)體積的5-10倍，去除結(jié)合液，得到已激活 的CNBr-瓊脂糖親和層析介質(zhì)；所述激活液為HCl溶液或NaCl-HCl溶液，pH為2. 0-4. 5 ; 所述結(jié)合液為NaCl-NaHCO3溶液，pH為7. 0-8. 6 ;
[0071] 2)稱取明膠加入到結(jié)合液中，攪拌溶解，制得明膠的濃度為5-20mg/mL的明膠溶 液；
[0072] 3)向步驟2)得到的明膠溶液中加入等體積的步驟1)中已激活的CNBr-瓊脂糖親 和層析介質(zhì)，溫度為4-35°C，攪拌轉(zhuǎn)速為50-200rpm，偶聯(lián)1-24小時；
[0073] 4)偶聯(lián)完畢，利用0. 45微米膜過濾，得到濾液和已偶聯(lián)的明膠親和層析介質(zhì)；檢 測濾液的UV280吸光度，根據(jù)測定明膠的標(biāo)準(zhǔn)曲線（測定明膠的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = 11. 862x， 其中X是UV280的吸光度，y是明膠濃度）計算出慮液中的明膠濃度，根據(jù)步驟2)的明膠 濃度，再計算出CNBr-瓊脂糖親和層析介質(zhì)結(jié)合明膠的濃度；
[0074] 5)將步驟4)得到的已偶聯(lián)的明膠親和層析介質(zhì)抽干并用4_8°C預(yù)冷的封閉液清 洗，封閉液的體積是已偶聯(lián)的明膠親和層析介質(zhì)體積的3-5倍，所述封閉液為HO(CH 2)2NH2 或pH為7. 0-8. 6的0. 001-1. Omol/L Tris-HCl溶液，去除封閉液，并加入等體積的封閉液 控溫（4-35°C條件下）慢速（轉(zhuǎn)速為100_200rpm)攪拌封閉（時間為3-18h)，得到封閉液 處理后的明膠親和層析介質(zhì)；
[0075] 6)將步驟5)得到的封閉液處理后的明膠親和層析介質(zhì)在抽濾漏斗中抽干，分別 利用3-5倍體積的4-8°C預(yù)冷酸清洗液和堿清洗液交替清洗，再用5-10倍體積的4-8°C預(yù) 冷的純水清洗，加入體積分?jǐn)?shù)20 %乙醇溶液，4-8°C保存，得到明膠親和層析介質(zhì)；所述堿 清洗液為NaCl-Tris溶液，pH為7. 0-8. 6 ;所述酸清洗液為NaCl-NaAc溶液，pH為2. 0-4. 5。
[0076] -種利用上述方法制備的明膠親和層析介質(zhì)分離純化纖維連接蛋白的方法，包括 以下步驟：
[0077] 1)裝柱：稱取800mL上述制備的明膠親和層析介質(zhì)，用純水清洗，純水的體積是 明膠親和層析介質(zhì)的體積的5-10倍，去除純水；再用平衡液清洗，平衡液的體積是明膠親 和層析介質(zhì)的體積的3-5倍，去除平衡液；之后，向明膠親和層析介質(zhì)中加入少量平衡液 (平衡液清洗后，再加入20% -100%明膠親和層析介質(zhì)的體積的平衡液，要求為能夠?qū)⒚?膠親和層析介質(zhì)攪拌均勻，但總體積不會超過層析柱體積），混勻后一次性裝入層析柱中， 重力沉降30min以上至柱面無變化，用蠕動泵將平衡液快速壓柱IOmin以上至柱面無變 化；所述平衡液為〇? 001-0. 5mol/L Na2HP04、0. 001-0. 5mol/L KH2P04、0. 001-0. 5mol/L KC1、 0? 001-0. 5mol/L NaCl的混合液，所述平衡液的pH為7. 0-8. 6 ;
[0078] 2)平衡：打開蛋白純化系統(tǒng)，打開AKTA檢測器電源預(yù)熱30min以上，清洗管路并 將步驟1)中的層析柱與蛋白純化系統(tǒng)連接，設(shè)置參數(shù)，用5-10倍體積（指層析柱中明膠親 和層析介質(zhì)的柱體積）的平衡液以恒速平衡層析柱至各參數(shù)（例如UV、pH、電導(dǎo)等參數(shù)）不 變IOmin以上，調(diào)零；
[0079] 3)上樣：將待分離純化纖維連接蛋白的樣品處理后，恒速流過裝有明膠親和層析 介質(zhì)的層析柱，分管收集樣品流穿峰，利用蛋白電泳檢測收集的樣品；
[0080] 4)清洗：利用平衡液恒速清洗裝有明膠親和層析介質(zhì)的層析柱，所述平衡液的體 積是層析柱中明膠親和層析介質(zhì)的體積的3-5倍，至各參數(shù)（例如UV、pH、電導(dǎo)等參數(shù)）不 變，清洗時間為IOmin以上，分管收集樣品清洗峰，利用蛋白電泳檢測（例如SDS-PAGE);
[0081] 5)洗脫：利用洗脫液恒速清洗裝有明膠親和層析介質(zhì)的層析柱，洗脫液的體積 為層析柱中明膠親和層析介質(zhì)的體積的3-5倍，直至各參數(shù)（例如UV、pH、電導(dǎo)等參數(shù)） 不變，清洗時間為IOmin以上，收集樣品洗脫峰，檢測稀釋10倍后UV280吸光度，并通過 測定纖維連接蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線（測定纖維連接蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y = 〇.781x，其中X是 UV280的吸光度，y是纖維連接蛋白濃度）來計算出纖維連接蛋白濃度，再計算出明膠親 和層析介質(zhì)結(jié)合纖維連接蛋白的載量；取洗脫峰的樣品進(jìn)行蛋白電泳檢測；所述洗脫液為 0? 001-0. 5mol/L Na2HP04、0.001-0.5mol/L KH2P04、0.001-0.5mol/L KC1、0. 001-0. 5mol/L NaCl、I. 0-8. Omol/L尿素的混合溶液，所述洗脫液的pH為7. 0-8. 6 ;
[0082] 6)再生：將層析柱中的明膠親和層析介質(zhì)分別用酸清洗液和堿清洗液交替清洗 3次，酸清洗液的體積和堿清洗液的體積分別為明膠親和層析介質(zhì)的3-5倍，再用純水清 洗，最后用體積分?jǐn)?shù)20%的乙醇溶液清洗，乙醇溶液的體積為明膠親和層析介質(zhì)的體積 的3-5倍，4-8°C保存；所述堿清洗液為NaCl-Tris溶液，pH為7. 0-8. 6 ;所述酸清洗液為 NaCl-NaAc 溶液，pH 為 2. 0-4. 5。
[0083] 實施例中的匯瓊親CNBr-瓊脂糖親和層析介質(zhì)購自武漢匯研生物科技股份有限 公司。
[0084] 實施例中未詳細(xì)說明的部分為本領(lǐng)域的常用技術(shù)，本領(lǐng)域技術(shù)人員依說明書的記 載可以實現(xiàn)本技術(shù)方案。
[0085] 實施例中稱取重力沉降狀態(tài)的的匯瓊親CNBr-瓊脂糖親和層析介質(zhì)目的是為了 精確稱量，這是一個稱量的標(biāo)準(zhǔn)，因為匯瓊親CNBr-瓊脂糖親和層析介質(zhì)中含有水分，如用 抽干則會因為抽干不均勻?qū)е路Q量不準(zhǔn)確，因此采用靠匯瓊親CNBr-瓊脂糖親和層析介質(zhì) 自身重力讓其沉降后，精確稱量。
[0086] 實施例1 :
[0087] 1)稱取835g重力沉降狀態(tài)的匯瓊親CNBr-瓊脂糖親和層析介質(zhì)加入到抽濾漏斗 中，用真空泵抽濾清洗，用10倍體積的4°C預(yù)冷激活液（即激活液的體積是匯瓊親CNBr-瓊 脂糖親和層析介質(zhì)的10倍，激活液含有0.0 Olmol/L HC1，激活液的pH為3. 0)清洗30min， 過濾，除去濾液；再用10倍體積的4°C預(yù)冷結(jié)合液（即結(jié)合液的體積是匯瓊親CNBr-瓊脂 糖親和層析介質(zhì)體積的10倍，結(jié)合液含有〇? lmol/L NaCl和0? lmol/L NaHCO3，結(jié)合液的pH 為8. 3)清洗，過濾，除去濾液；測定重力沉降狀態(tài)下的匯瓊親CNBr-瓊脂糖親和層析介質(zhì) (簡稱沉降介質(zhì)）的重量為lkg，即已激活的匯瓊親CNBr-瓊脂糖親和層析介質(zhì)。
[0088] 2)稱取IOg的明膠加入到IL結(jié)合液中，攪拌溶解后，得到明膠溶液；利用紫 外分光光度計檢測明膠溶液的UV280吸光度為0.841，根據(jù)測定明膠的標(biāo)準(zhǔn)曲線y = 11. 862x(其中X是UV280的吸光度，y是明膠濃度），計算出明膠的濃度為9. 98mg/mL。
[0089] 3)將步驟2)中得到的明膠溶液與Ikg已激活的匯瓊親CNBr-瓊脂糖親和層析介 質(zhì)一起裝入容積為3L的反應(yīng)瓶，在水浴鍋中4°C反應(yīng)、IOOrpm攪拌、偶聯(lián)18h。
[0090] 4)偶聯(lián)完畢，用0. 45微米過濾膜的ro-10柱管重力過濾，得到濾液和已偶聯(lián)的明 膠親和層析介質(zhì)；檢測濾液的UV280吸光度為0. 489,根據(jù)測定明膠的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出濾液 中的明膠濃度為5. 80mg/mL，再計