生了明顯變化，其中附圖3中1714cm1為C = O伸縮振動(dòng)峰，1614cm 1為C-C伸縮振動(dòng)峰，1371cm 1為O-H變形振動(dòng)峰，1217cm 1S C-OH伸縮振動(dòng)峰，1037cm 1為C-O伸縮振動(dòng)峰，證明了 GO中所帶的含氧官能團(tuán)。附圖4中1627cm 1為C = C的伸縮振動(dòng)峰，1408cm 1處甲基的對(duì)稱(chēng)及不對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)峰重疊，證明了 META的存在。1048cm 1S C-O伸縮振動(dòng)峰，相比于GO的紅外譜圖，該位置發(fā)生明顯的藍(lán)移，因此證明GO-META形成復(fù)合物。箭頭所標(biāo)記的峰為該測(cè)試條件下1102的特征峰，結(jié)合上述分析認(rèn)為成功制備出T12-GO復(fù)合物。
[0038]管內(nèi)固相微萃取柱的制備:
[0039]SI毛細(xì)管的預(yù)處理:
[0040]截取內(nèi)徑100 μm、長(zhǎng)10cm的具有聚四氟乙烯涂層的熔融石英毛細(xì)管，用lmol/LNaOH沖洗Ih后，再分別用超純水、lmol/L HCl及超純水沖洗毛細(xì)管內(nèi)壁20min，最后用丙酮沖洗30min并用氮?dú)獯蹈伞?br>[0041]將3_(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯與丙酮的混合溶液(V:V = 1:1)注入經(jīng)過(guò)干燥的毛細(xì)管中，將毛細(xì)管兩端用硅膠塞封堵，室溫下避光靜置24h進(jìn)行硅烷化反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后用丙酮充分沖洗毛細(xì)管內(nèi)壁，以除去未反應(yīng)的硅烷偶聯(lián)試劑。最后將毛細(xì)管內(nèi)壁用氮?dú)獯蹈桑瑑啥瞬迦敫蓛綦x心管中待用。
[0042]S2有機(jī)聚合物溶液的配置:
[0043]分別配置由正丙醇、1，4- 丁二醇、水組成的三元致孔劑溶液(V: V: V = 60:30:10)，和由甲基丙烯酸丁酯、乙二醇二甲基丙烯酸酯、2，2-二甲氧基-苯基苯乙酮組成的單體溶液。準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的致孔劑溶液加入到單體溶液中，再加入制備的T12-GO粉末，既得有機(jī)預(yù)聚合整體柱溶液。將配置好的溶液充分震蕩，超聲除氣后待用。
[0044]S3萃取柱的制備:
[0045]截取20cm長(zhǎng)SI中硅烷化的毛細(xì)管，注入S2中配置的預(yù)聚合溶液，兩端用硅膠塞封堵。于紫外反應(yīng)箱中進(jìn)行光引發(fā)聚合反應(yīng)20min。反應(yīng)結(jié)束將毛細(xì)管連接到色譜栗上利用甲醇沖洗未反應(yīng)的單體及致孔劑溶液，并初步判斷萃取柱的滲透性。沖洗干凈既得管內(nèi)固相微萃取柱。
[0046]附圖5為制備的萃取柱放大700倍的掃描電鏡圖，從圖中能夠看出聚合顆粒形成三維交錯(cuò)孔結(jié)構(gòu)，平均孔徑2 μ m，保證了萃取柱良好的滲透性。圖6為制備的萃取柱放大9000倍的掃描電鏡圖，從圖中看出聚合顆粒形成了均勻的整體柱結(jié)構(gòu)骨架，箭頭所示為GO片層，證明了 T12-GO復(fù)合物通過(guò)META的甲基丙烯酸基團(tuán)與單體溶液組分的聚合作用與整體柱結(jié)構(gòu)骨架生長(zhǎng)在一起。
[0047]磷酸肽樣品的配置:
[0048]將一定量氨基酸序列為FQ-pSEEQQQTEDELQDK的單磷酸肽粉末溶解至pH = 3-4,0.1% (v/v)乙酸溶液中，逐步稀釋至50 ymol/L-100 ymol/L。
[0049]磷酸肽樣品的管內(nèi)固相微萃取及解析:
[0050]SI磷酸肽的萃取:
[0051]準(zhǔn)確量取10 yL、50 μπιοΙ/L配置的單磷酸肽溶液于離心管中，如附圖7所示，將該離心管放入圖中4號(hào)位置，放入兩層密封墊，旋緊耐壓鋼瓶。在針頭的引導(dǎo)下，將制備的萃取柱穿透密封墊插到離心管底部，出口端插入收集離心管中，如圖7中2號(hào)所示位置。在壓力的驅(qū)動(dòng)下使單磷酸肽溶液流經(jīng)萃取柱，并通過(guò)Lewis酸堿作用結(jié)合在萃取相T12顆粒上。
[0052]S2磷酸肽的解析:
[0053]準(zhǔn)確量取10 yL、l%的氨水溶液于離心管中，如附圖7所示，將該離心管放入圖7中4號(hào)位置，放入兩層密封墊，旋緊耐壓鋼瓶。在針頭的引導(dǎo)下，將SI中所用的萃取柱穿透密封墊插到離心管底部，出口端插入新的收集離心管中，如圖7中2號(hào)位置所示。在壓力的驅(qū)動(dòng)下使解析溶液流經(jīng)萃取柱，將單磷酸肽洗脫下來(lái)。
[0054]磷酸肽的紫外檢測(cè):
[0055]離線(xiàn)模式下，利用壓力驅(qū)動(dòng)進(jìn)樣，對(duì)實(shí)施例四中末端收集液進(jìn)行紫外檢測(cè)。設(shè)定紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為214nm，檢測(cè)用毛細(xì)管內(nèi)徑為25 μ m，流動(dòng)相為超純水。如附圖8所示，將實(shí)施例四中末端收集液置于4號(hào)位置，放入兩層密封墊，旋緊耐壓鋼瓶，將其命名為樣品瓶。按照相同方法，在另一耐壓鋼瓶中的4號(hào)位置放入盛有超純水的離心管后旋緊，命名為洗脫瓶。檢測(cè)用毛細(xì)管具有檢測(cè)窗口一端連接紫外檢測(cè)器，另一端在針頭引導(dǎo)下穿透密封墊插入到樣品瓶底部離心管中。在200psi壓力驅(qū)動(dòng)下進(jìn)樣3s，快速拔出檢測(cè)毛細(xì)管末端，在針頭引導(dǎo)下插入洗脫瓶中離心管底部，在200psi壓力驅(qū)動(dòng)下連續(xù)洗脫。
[0056]附圖9為本實(shí)施例中對(duì)萃取解析后的末端收集液進(jìn)行紫外檢測(cè)圖。從圖中看出解析后響應(yīng)信號(hào)強(qiáng)度與50 ymol/L單磷酸肽樣品信號(hào)相當(dāng)，說(shuō)明解析效果良好。萃取后收集液出現(xiàn)響應(yīng)較弱的信號(hào)，明顯低于50 ymol/L單磷酸肽樣品，說(shuō)明利用管內(nèi)固相微萃取技術(shù)成功地對(duì)單磷酸肽進(jìn)行富集。實(shí)施過(guò)程中萃取柱的有效長(zhǎng)度12cm，低于一般整體柱結(jié)構(gòu)萃取柱的有效長(zhǎng)度；并且樣品量濃度較高(約2 μ g)，因此證明本發(fā)明中制備的T12-GO復(fù)合物萃取相具有較高的萃取容量。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種管內(nèi)固相微萃取復(fù)合物柱的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)二氧化鈦-石墨烯氧化物復(fù)合物(T12-GO)的制備: 將一定濃度的石墨烯氧化物水溶液滴加至甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨水溶液中，充分?jǐn)嚢韬箅x心、洗滌，再分散超純水中，滴入一定濃度納米二氧化鈦漿液，攪拌7-14h后離心、洗滌、干燥； (2)管內(nèi)固相微萃取柱的制備: 將由單體、交聯(lián)劑、引發(fā)劑、致孔劑及步驟(I)中制備的二氧化鈦-石墨烯氧化物復(fù)合物組成的溶液注入到硅烷化的毛細(xì)管中，在紫外反應(yīng)箱中光聚5-30min ;其中單體是甲基丙烯酸丁酯，交聯(lián)劑是乙二醇二甲基丙烯酸酯，引發(fā)劑是2，2- 二甲氧基-苯基苯乙酮，致孔劑由正丙醇、1，4- 丁二醇和水組成三元致孔劑，硅烷化的毛細(xì)管所用的硅烷化試劑為3_(三甲氧基甲硅基)甲基丙烯酸丙酯。2.按照權(quán)利要求1的一種管內(nèi)固相微萃取復(fù)合物柱的制備方法，其特征在于，步驟(I)二氧化鈦與石墨烯氧化物質(zhì)量比為1: (1-3.5)，二氧化鈦與META的比為1: (1-5)。3.按照權(quán)利要求1的一種管內(nèi)固相微萃取復(fù)合物柱的制備方法，其特征在于，步驟(2)單體、交聯(lián)劑、弓I發(fā)劑、致孔劑的質(zhì)量比為60:40:1:144。4.按照權(quán)利要求1的一種用于萃取磷酸肽的管內(nèi)固相微萃取復(fù)合物柱的制備方法，其特征在于，致孔劑中正丙醇、I, 4- 丁二醇和水的體積百分含量為50-70%，20-40%, 10%。5.按照權(quán)利要求1-4的任一方法制備得到的管內(nèi)固相微萃取復(fù)合物柱。6.按照權(quán)利要求1-4的任一方法制備得到的管內(nèi)固相微萃取復(fù)合物柱用于對(duì)微量甚至痕量磷酸肽的富集或檢測(cè)。7.按照權(quán)利要求1-4的任一方法制備得到的管內(nèi)固相微萃取復(fù)合物柱用于對(duì)微量甚至痕量磷酸肽的萃取和解析的方法，其特征在于: 磷酸肽樣品的管內(nèi)固相微萃取: 在200ps1-500psi壓力驅(qū)動(dòng)下，使配制的單磷酸肽樣品乙酸溶液流經(jīng)制備的管內(nèi)固相微萃取柱，分析物與萃取相結(jié)合留在萃取柱中，用離心管收集萃取柱末端溶液； 磷酸肽樣品的解析: 在200ps1-500psi壓力驅(qū)動(dòng)下，使解析液流經(jīng)萃取柱進(jìn)行解析；萃取物從萃取相洗脫下來(lái)，用離心管收集萃取柱末端溶液； 乙酸溶液PH = 3-4，體積百分比0.1% ;解析液為pH = 9-11，0.01% -1% (v/v)的氨水。8.分析權(quán)利要求7的方法所得的萃取液與解析液的方法，其特征在于磷酸肽樣品的紫外檢測(cè):離線(xiàn)模式下，利用壓力驅(qū)動(dòng)進(jìn)樣，對(duì)萃取液、解析液分別進(jìn)行紫外檢測(cè)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為214nm，檢測(cè)用毛細(xì)管內(nèi)徑為10 μ m_25 μ m，進(jìn)樣時(shí)間3s_6s，流動(dòng)相為超純水。
【專(zhuān)利摘要】一種用于萃取磷酸肽的管內(nèi)固相微萃取復(fù)合物柱的制備方法，屬于分析化學(xué)領(lǐng)域。步驟如下：首先利用甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化銨作為橋梁制備二氧化鈦-石墨烯氧化物復(fù)合物。再將由單體、三元致孔劑及復(fù)合物組成的有機(jī)聚合物溶液注入內(nèi)壁硅烷化的毛細(xì)管中，通過(guò)光聚制備具有整體柱結(jié)構(gòu)的固相微萃取柱，將該萃取柱用于磷酸肽的富集。該發(fā)明方法解決了二氧化鈦萃取柱不易制備的問(wèn)題，具有操作簡(jiǎn)單、調(diào)控靈活的優(yōu)點(diǎn)，適用于復(fù)雜磷酸肽的選擇性萃取，對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)中磷酸肽的分析有一定的應(yīng)用前景。
【IPC分類(lèi)】G01N1/40, B01J20/282, B01D15/20, B01J20/30
【公開(kāi)號(hào)】CN105056913
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510475971
【發(fā)明人】郭廣生, 王思雨, 汪夏燕
【申請(qǐng)人】北京工業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年11月18日
【申請(qǐng)日】2015年8月5日