一種連接三羧甲基乙二胺的金屬螯合磁珠制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種金屬螯合磁珠，具體的說是一種連接三羧甲基乙二胺的金屬螯合磁珠制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]在溶液中，金屬離子往往和蛋白質(zhì)、核酸、糖等生物大分子結(jié)合在一起，影響我們對這些生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能的分析。現(xiàn)有獲得脫金屬方法是通過加入高濃度的低分子量螯合劑，如Η)ΤΑ和EGTA等，或者通過金屬螯合瓊脂糖凝膠。前者在移除螯合劑金屬復合物的同時緩沖液中的金屬離子會重新與大分子結(jié)合，影響脫金屬效果。目前廣泛使用瓊脂糖凝膠來對生物大分子進行脫金屬處理。瓊脂糖的粒度均勻，表面有密度適宜的可反應的活性基團，便于連接金屬螯合基團。中國專利申請“四配位體金屬螯合層析填料乙二胺二乙酸瓊脂糖凝膠制備方法”(申請?zhí)朇N200910196910.0)和“一種金屬螯合瓊脂糖凝膠的制備方法及其應用”(申請?zhí)朇N201110329239.X)公開的方法，采用結(jié)合了乙二胺二乙酸(EDDA)或乙二胺二琥珀酸(EDDS)的瓊脂糖凝膠進行金屬離子的螯合，由于EDDA提供4個金屬配位體，EDDS提供6個金屬配位體，制得的瓊脂糖凝膠的金屬螯合能力要比亞氨基二乙酸(IDA，金屬配位數(shù)為3)的強。但是瓊脂糖凝膠在較低壓力下結(jié)構(gòu)就會產(chǎn)生壓縮破壞，為提高其機械強度，常采用增加交聯(lián)度的辦法，但交聯(lián)后的瓊脂糖凝膠吸附性大大下降；另一方面，瓊脂糖凝膠的熱穩(wěn)定性也較差，50°C以上就開始水解，這些缺點使其不能完全滿足目前的研究需要。
[0003]磁珠是近年來發(fā)展起來并已廣泛應用于醫(yī)學生物學領(lǐng)域的一種多功能試劑，它由磁性內(nèi)核和核外包裹的高分子外殼兩部分組成，利用磁核對外磁場的響應，可以將磁珠從周圍介質(zhì)中迅速分離出來。中國專利申請“一種金屬螯合納米磁珠，其制備方法及其應用”(申請?zhí)朇N200610002030.1)公開了一種連接IDA的納米磁珠，該磁珠與金屬離子螯合后，金屬離子(如六配位金屬N1、Cu、Co和Ca等)上還剩余三個空軌道可以與具有金屬結(jié)合位點的蛋白質(zhì)結(jié)合，因此以IDA為螯合基制成納米磁珠吸附蛋白質(zhì)能力較強，能較好地用于溶液中金屬結(jié)合蛋白的分離和鑒定，但并不能從大分子中有效地移除金屬離子。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種連接三羧甲基乙二胺的金屬螯合磁珠制備方法，所制備出金屬螯合磁珠，其金屬結(jié)合能力強，結(jié)合容量大，可用于移除溶液及生物大分子中的金屬離子。
[0005]—種連接三羧甲基乙二胺的金屬螯合磁珠制備方法，包括以下步驟:
步驟一、羥基磁珠的活化:在羥基磁珠中加入堿液進行活化，得到含活化后羥基磁珠和堿液的混合物I，備用；所述堿液的加入量為使混合物I的PH值達到12-14 ;
步驟二、環(huán)氧化:按照混合物1、二甲亞砜、環(huán)氧氯丙烷和氫氧化鈉溶液的體積比為1:2:1: 4的比例，在上述步驟一所得混合物I中加入二甲亞砜、環(huán)氧氯丙烷和濃度為Imol/L的氫氧化鈉，60°C的溫度下，攪拌12-14小時，除去溶液，所得磁珠洗至中性，即得到環(huán)氧活化磁珠，備用；
步驟三、在每1mg上述步驟二所得環(huán)氧活化化磁珠中加入3ml碳酸氫鈉溶液和2ml乙二胺，置于50°C下緩慢震蕩20小時，除去溶液，所得磁珠洗至中性，得到處理后環(huán)氧活化磁珠，備用；
步驟四、在每1mg上述步驟三所得處理后環(huán)氧活化磁珠中加入3 ml氫氧化鈉溶液和2 ml碳酸氫鈉溶液，混合均勻后加入0.1~1 g溴乙酸，室溫下攪拌10~15小時，除去溶液，所得磁珠洗至中性，即制備出連接三羧甲基乙二胺的金屬螯合磁珠，將其保存于質(zhì)量濃度為30%乙醇水溶液中，置于4°C下保存，備用。
[0006]步驟一中所述堿液優(yōu)選為氫氧化鈉溶液或氨水，濃度為5-10 mol/L ;所述輕基磁珠為單分散粒徑納米微球，表面功能基團優(yōu)選為為硅羥基，粒徑為400-600nm。
[0007]步驟二中所述氫氧化鈉溶液和環(huán)氧氯丙烷優(yōu)選為在12-14小時內(nèi)分5次緩慢加入處于攪拌狀態(tài)的磁珠中。
[0008]步驟三中所述碳酸氫鈉溶液的濃度優(yōu)選為0.1-0.5mol/Lo
[0009]步驟四中所述氫氧化鈉溶液的濃度優(yōu)選為1~5 mol/L，碳酸氫鈉溶液的濃度優(yōu)選為 0.2~2mol/Lo
[0010]步驟二、步驟三和步驟四中所述洗至中性的方法優(yōu)選為，先采用蒸餾水洗，再用稀醋酸洗，最后用蒸餾水洗至中性。
[0011]有益效果是:
本發(fā)明的連接三羧甲基乙二胺的金屬螯合磁珠制備方法，以單分散的硅羥基磁珠為基質(zhì)，性質(zhì)穩(wěn)定，經(jīng)環(huán)氧活化后，進一步合成三羧甲基乙二胺(TED)，獲得連接TED的金屬螯合磁珠；該制備方法，制備工藝簡單，易于放大，使用方便，本發(fā)明的連接TED的金屬螯合磁珠含有三個羧基，形成的螯合中心含有5個配位體，當二價金屬離子結(jié)合后，金屬離子僅剩下一個空軌道與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白很容易從螯合位點分離出來。將該磁珠加入溶液后可快速移除溶液及生物大分子中的金屬離子，方便對生物大分子的結(jié)構(gòu)和功能進行分析。該方法尤其適合復合重金屬污染環(huán)境下生長的植物蛋白質(zhì)中重金屬離子的移除。
【具體實施方式】
[0012]—種連接三羧甲基乙二胺的金屬螯合磁珠制備方法，包括以下步驟:
步驟一、羥基磁珠的活化:在羥基磁珠中加入堿液進行活化，得到含活化后羥基磁珠和堿液的混合物I，備用；所述堿液的加入量為使混合物I的PH值達到12-14 ;
步驟二、環(huán)氧化:按照混合物1、二甲亞砜、環(huán)氧氯丙烷和氫氧化鈉溶液的體積比為1:2:1: 4的比例，在上述步驟一所得混合物I中加入二甲亞砜、環(huán)氧氯丙烷和濃度為Imol/L的氫氧化鈉，60°C的溫度下，攪拌12-14小時，除去溶液，所得磁珠洗至中性，即得到環(huán)氧活化磁珠，備用；
步驟三、在每1mg上述步驟二所得環(huán)氧活化化磁珠中加入3ml碳酸氫鈉溶液和2ml乙二胺，置于50°C下緩慢震蕩20小時，除去溶液，所得磁珠洗至中性，得到處理后環(huán)氧活化磁珠，備用；
步驟四、在每1mg上述步驟三所得處理后環(huán)氧活化磁珠中加入3 ml氫氧化鈉溶液和2 ml碳酸氫鈉溶液，混合均勻后加入0.1~1 g溴乙酸，室溫下攪拌10~15小時，除去溶液，
所得磁珠洗至中性，即制備出連接三羧甲基乙二胺的金屬螯合磁珠，將其保存于質(zhì)量濃度為30%乙醇水溶液中，置于4°C下保存，備用。
[0013]步驟一中所述堿液優(yōu)選為氫氧化鈉溶液或氨水，濃度為5-10 mol/L ;所述輕基磁珠的表面功能基團為硅羥基，粒徑為400-600nm。
[0014]步驟二中所述氫氧化鈉溶液和環(huán)氧氯丙烷優(yōu)選為在12-14小時內(nèi)分5次緩慢加入處于攪拌狀態(tài)的磁珠中。
[0015]步驟三中所述碳酸氫鈉溶液的濃度優(yōu)選為0.1-0.5mol/Lo
[0016]步驟四中所述氫氧化鈉溶液的濃度優(yōu)選為1~5 mol/L，碳酸氫鈉溶液的濃度優(yōu)選為 0.2~2mol/Lo
[0017]步驟二、步驟三和步驟四中所述洗至中性的方法優(yōu)選為，先采用蒸餾水洗，再用稀醋酸洗，最后用蒸餾水洗至中性。
[0018]以下實施例用于說明本發(fā)明的技術(shù)方案，并不對本發(fā)明的保護范圍有任何形式的限定；實施例中所述羥基磁珠購買于洛陽惠爾納米科技有限公司。
[0019]實施例1
在Iml 10mg/ml羥基磁珠中加入6 mol/L氫氧化鈉溶液充分活化后，得到含活化后羥基磁珠和堿液的混合物I ;6 mol/L氫氧化鈉溶液加入量為可使混合物I的pH值達到12 ;在混合物加I中加入2ml 二甲亞砜、I ml環(huán)氧氯丙烷和4ml I mol/L氫氧化鈉溶液(I ml環(huán)氧氯丙烷和4ml氫氧化鈉溶液在緩慢攪拌下，14小時內(nèi)分5次加入，每次間隔2.8小時)，于60°C下緩慢攪拌過夜后過夜，然后水洗、稀醋酸洗、水洗，得到的環(huán)氧活化磁珠。然后對環(huán)氧活化磁珠中加入3ml濃度為0.2mol/L碳酸氫鈉溶液和2ml乙二胺，50°C下緩慢震蕩20小時，除去溶液，所得磁珠依次水洗、稀醋酸洗和水洗，隨后對處理后的磁珠再加入3ml濃度為2 mol/L氫氧化鈉溶液和2 ml 0.2 mol/L碳酸氫鈉溶液，混勻后加入0.1 g溴乙酸，室溫下緩慢攪拌10~15小時，除去溶液，所得磁珠先水洗，再稀醋酸洗，最后水洗至中性，即得到連接TED的金屬螯合磁珠，保存于4°C下30%的乙醇溶液中。該實施例制得的金屬螯合磁珠在0.5mol/L硫酸銅溶液中每10毫克能吸收0.09mmol Cu'本實施例中采用的羥基磁珠為娃輕基磁珠，粒徑為400nm-600nm。
[0020]實施例2
在Iml 10mg/ml羥基磁珠中加入5 mol/L氫氧化鈉溶液充分活化后，得到含活化后羥基磁珠和堿液的混合物I ;5mol/L氫氧化鈉溶液加入量為可使混合物I的pH值達到13 ;在混合物加I中加入2ml 二甲亞砜、I ml環(huán)氧氯丙烷和4ml I mol/L氫氧化鈉溶液(I ml環(huán)氧氯丙烷和4ml氫氧化鈉在緩慢攪拌下，13小時內(nèi)分5次加入，每次間隔