具有貯存穩(wěn)定性、用于快速澆制、印跡和成像的聚丙烯酰胺凝膠的制作方法
【專利說明】具有貯存穩(wěn)定性、用于快速澆制、印跡和成像的聚丙烯酰胺 凝膠
[0001] 相關申請的交叉參考
[0002] 本申請要求2013年3月15日提交的美國臨時專利申請?zhí)?1/793, 884的優(yōu)先權(quán)， 該文通過引用納入本文。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 聚丙烯酰胺凝膠（PAGE)廣泛用于生物技術實驗室，用于處理生物樣品，以分離該 樣品中存在的生物分子以供于鑒定，并且在一些情況中，用于定量分離的物質(zhì)。蛋白質(zhì)混合 物、肽混合物，以及DNA、RNA和DNA與RNA的片段的混合物都可在聚丙烯酰胺凝膠上分離。 對于蛋白質(zhì)混合物，PAGE的具體應用形式是SDS-PAGE，其中在樣品中含有十二烷基硫酸鈉 (SDS)。所有蛋白質(zhì)均由相連的氨基酸殘基組成，并且各蛋白質(zhì)自然折疊成三維形狀，這是 每個個體蛋白質(zhì)的特征和特點。因此，氨基酸序列和折疊的蛋白質(zhì)的形狀在蛋白質(zhì)之間彼 此不同。然而，在SDS的存在下，蛋白質(zhì)經(jīng)歷變性，S卩，它們會展開，進而失去其特征三維形 狀。因此，所有變性的蛋白質(zhì)具有相同的形狀，并且能在SDS-PAGE中僅依賴于其分子量而 被分離。由于蛋白質(zhì)在氨基酸的數(shù)量和種類上均有差異，不同的蛋白質(zhì)通常具有不同的分 子量，并且常見蛋白質(zhì)的分子量范圍較大。
[0005] 然而，某些蛋白質(zhì)的分子量極為接近，這使其難以在SDS-PAGE中分離。為 了分離所述蛋白質(zhì)，或使它們的分離最優(yōu)化，通常在不連續(xù)的凝膠，即，由在"分離 (resolving)"（還稱作"分離（separating)"）凝膠之上饒制的"積層（stacking)"或"積 層（stacker) "凝膠組成的組合凝膠中進行SDS-PAGE，其中所述積層凝膠具有較低的聚丙 烯酰胺濃度，進而具有較高的多孔性。積層凝膠和分離凝膠在某一界面接觸，在該界面處發(fā) 生多孔性的梯式（stepwise)變化，并且在某些情況中，該界面處還包含pH從積層凝膠中的 約中性或略酸性（pH6. 6~7. 0)到分離凝膠中的堿性（pH8. 6~9. 0)的梯式變化。與這 些不連續(xù)構(gòu)成無關，溶質(zhì)、緩沖溶液和和電流能夠自由穿過該界面，從所述凝膠的一部分到 另一部分。該組合凝膠以垂直位置取向，其中積層凝膠處于分離凝膠上方，而樣品初始時被 置于積層凝膠的頂部邊緣。然后施加合適極化的電場，以使樣品中的蛋白質(zhì)穿過積層凝膠 朝向所述界面向下迀移，并進入分離凝膠。在迀移的初始階段，蛋白質(zhì)在所述界面處匯集在 單一明晰條帶中。然后，所述蛋白質(zhì)繼續(xù)其迀移，并進入分離凝膠，此時所述單一條帶分離 成代表個體蛋白質(zhì)的多個條帶。丙烯酰胺在分離凝膠中的百分比可變化，以實現(xiàn)蛋白質(zhì)的 最優(yōu)分離。然而，一般而言，較大蛋白質(zhì)在具有相對較低的百分比的分離凝膠中最易分離， 而較小蛋白質(zhì)在具有高百分比的分離凝膠中最易分離。
[0006] 可是，凝膠的澆制是耗時且耗力的過程，因而，研究者購買預形成凝膠而不是在使 用前澆制凝膠的現(xiàn)象變得越發(fā)普遍。購得的凝膠通常稱為"預澆制凝膠"，而實驗室中制備 的那些稱為"手工澆制凝膠"。預澆制凝膠的生產(chǎn)商已開發(fā)出在多個方面優(yōu)于手工澆制凝 膠的凝膠。例如，在貯存數(shù)天后，聚丙烯酰胺凝膠中的分辨力趨于下降，因此，通常在即將 使用前不久制備手工澆制凝膠。生產(chǎn)商們通過配制預澆制凝膠而解決了該問題，將預澆制 凝膠的壽命延長至一年或更久。另一個難點關于凝膠跑動時的電場強度，以及完成跑動所 需的時間長度。手工澆制凝膠通常在低電場強度下跑動，以避免凝膠在跑動過程中升溫， 因為升溫會造成實驗中的失真，但是電場強度越低，實現(xiàn)蛋白質(zhì)分離所需的時間越長。生 產(chǎn)商們已解決了該問題，通過配制能夠承受高場強度而不顯示因升溫所致的異常現(xiàn)象的預 澆制凝膠。能夠解決這些問題的凝膠制劑的公開內(nèi)容可見于：Rowell等，美國專利號US 8,282,800B2(2012 年 10 月 9 日），和Petersen等，美國授權(quán)前申請?zhí)朥S2010/0187114 A1 (2012年 7月 29 日）。
[0007] -旦凝膠經(jīng)跑動，科研人員通常會將該凝膠染色以觀察在該凝膠中分離的蛋白 質(zhì)，或?qū)⒃谠撃z中分離的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移至膜，供于進一步處理或鑒定。凝膠的染色通 常通過施加化學染劑或染料來進行，所述化學染劑或染料通常是危險化學品。染色也是耗 時過程。預澆制凝膠的生產(chǎn)商們已通過配制能夠使蛋白質(zhì)不用染劑或染料即可被觀察的 凝膠來解決了該問題，由此免去了危險化學品的使用，并縮短了檢測蛋白質(zhì)所需的時間。 例如，生物福射實驗室公司（Bio-RadLaboratories)(加利福尼亞州赫爾克里斯）出售 Stain-Free?凝膠系統(tǒng)。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至膜的方法被稱為"western印跡"，并且其所涉及的 轉(zhuǎn)移以這樣的方式進行：保持個體蛋白質(zhì)的分離狀況，具體而言，保持個體蛋白質(zhì)條帶在凝 膠中的相對位置。所述轉(zhuǎn)移允許科研人員進行在凝膠上無法進行的分析。所述分析包括， 免疫試驗，例如，由于免疫試驗中所用的抗體太大，無法有效進入凝膠，但能夠容易地接觸 膜上的蛋白質(zhì)。所有蛋白質(zhì)，包括在免染（Stain-Free)凝膠中的那些，均可被印跡至膜上， 進一步為科研人員提供了便利，并加速了實驗進程。一些預澆制凝膠，例如生物輻射實驗室 公司的TGX和TGX免染凝膠允許蛋白質(zhì)從凝膠至膜的更快速轉(zhuǎn)移。
[0008] 盡管預澆制凝膠具有優(yōu)勢，但其也有缺點。一個缺點是，它們比手工澆制凝膠更 貴，因為生產(chǎn)商會將制造、貯存和分配所述凝膠的成本傳遞給用戶。第二個缺點是，用戶會 受限于生產(chǎn)商能夠提供的凝膠類型。采用手工澆制凝膠，用戶能夠通過親自選擇特定組成 的單體溶液來個性化地制備分離凝膠，以達具體實驗的特殊需求或偏好，但是，采用預澆制 凝膠通常無法實現(xiàn)這樣的靈活性。因此，不論其益處，手工澆制凝膠通常缺乏生產(chǎn)商制備的 預澆制凝膠的多種所需性質(zhì)，包括如下能力：貯存凝膠以供未來使用，使凝膠快速跑動，無 需染色步驟即可觀察蛋白質(zhì)，和將蛋白質(zhì)條帶從凝膠快速轉(zhuǎn)移至膜，以在無需染色的情況 下即可確認蛋白質(zhì)成功地轉(zhuǎn)移到膜上。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本文公開了一種用于手工澆制法的手工澆制凝膠系統(tǒng)和儲液，所述方法和溶液均 提供目前僅能在預澆制凝膠獲得的優(yōu)點這些優(yōu)點包括但不限于，延長凝膠在使用前貯存的 時間長度（例如在底部敞開（bottom-open)的玻璃盒中貯存長達30天，或采用密封塑料盒 貯存甚至更久）而不劣化或幾乎不劣化的能力，以比采用典型手工澆制凝膠的完成時間更 快地運行電泳實驗的能力，比采用典型手工澆制凝膠更快地將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移或印跡至 膜的能力，和，無需染色（即以"免染"方式）即可使凝膠成像的能力。儲液具有另外的優(yōu) 點：相對于用于制備手工澆制凝膠所用的一些儲液而言，該溶液本身能夠穩(wěn)定延長的時間 長度。
[0010] 在一些實施方式中，提供用于聚丙烯酰胺凝膠電泳的手工澆制凝膠系統(tǒng)。在一些 實施方式中，所述系統(tǒng)包含：剛性模具，其包含所述聚丙烯酰胺凝膠；和所述聚丙烯酰胺凝 膠，其包含丙烯酰胺、三乙醇胺、選自甘氨酸和N-三（羥甲基）甲基甘氨酸（tricine)的兩 性電解質(zhì)、以及由口匕在8. 3~9. 6范圍內(nèi)的氨基酸組成的共輒兩性電解質(zhì)。
[0011] 在一些實施方式中，所述系統(tǒng)能夠在所述聚丙烯酰胺凝膠已于4C°貯存長達30 天后分離蛋白質(zhì)樣品。在一些實施方式中，所述系統(tǒng)能夠在短至15分鐘的時間內(nèi)進行電 泳，并且能夠在短至3分鐘的時間內(nèi)通過印跡將蛋白質(zhì)基本完全轉(zhuǎn)移至硝化纖維素上。
[0012] 在一些實施方式中，所述凝膠還包含下述的一種或多種物質(zhì)：甘油、Tris和在紫 外光輻照后與色氨酸殘基反應以形成熒光化合物的鹵素取代的化合物。在一些實施方式 中，所述鹵素取代的化合物是三氯烷烴。在一些實施方式中，所述三氯烷烴選自下組：氯仿、 三氯乙酸和三氯乙醇，或其混合物。
[0013] 在一些實施方式中，所述凝膠是不連續(xù)的。在一些實施方式中，所述凝膠是連續(xù) 的。
[0014] 在一些實施方式中，