地結(jié)合樣品中的祀蛋白片 段的能力，所述樣品包含待純化的祀蛋白和祀蛋白片段，所述祀蛋白片段的量等于或大于 祀蛋白量的至少0.2%。因此，雖然活性炭結(jié)合祀蛋白片段，但是其不結(jié)合祀蛋白本身，從而 導(dǎo)致在從樣品去除活性炭之后從樣品選擇性地去除片段。 W60] 如本文所用，術(shù)語"澄清（clarify)"、"澄清（clarification)"和"澄清步驟"指 用于去除懸浮的顆粒和或膠體的加工步驟，從而減少包含祀蛋白的溶液的濁度，如測量的WNTU(比濁法濁度單位）計的。澄清可W通過各種方式實現(xiàn)，包括離屯、或過濾。離屯、可W W分批或連續(xù)模式進行，而過濾可正常流動（例如深層過濾）或切向流模式進行。在 現(xiàn)在工業(yè)中使用的方法中，離屯、之后通常是深層過濾，深層過濾意圖去除離屯、尚未去除的 不溶性雜質(zhì)。此外，可W使用增加澄清效率的方法，例如沉淀。雜質(zhì)的沉淀可W通過各種方 式進行，例如通過絮凝、抑調(diào)節(jié)（酸沉淀）、溫度變化、由于刺激響應(yīng)性聚合物或小分子的相 改變或者運些方法的任何組合。在本文所述的一些實施方案中，澄清包括離屯、、過濾、深層 過濾和沉淀中的兩種或更多種的任何組合。
[0061] 在本文中可交換使用的術(shù)語"流過方法"、"流過模式"和"流過色譜"指一種產(chǎn)物 分離技術(shù)，其中樣品中的至少一種產(chǎn)物意圖流過含碳介質(zhì)，而至少一種潛在組分結(jié)合至所 述含碳介質(zhì)（例如，活性炭）。
[0062] 意圖流過的樣品一般稱作"流動相"。"流過模式"一般為等度運行（即，期間流動 相的組成未改變的過程）。用于流過的介質(zhì)通常用包含祀蛋白分子的相同緩沖液溶液預(yù)平 衡。純化之后，可W用額外量的相同緩沖液沖洗介質(zhì)W增加產(chǎn)物回收率。
[006引術(shù)語"緩沖液"指通過其酸-堿綴合組分的作用抗抑變化的溶液。可W用于本文所 述方法的各種緩沖液描述于Buffers.AGuideforthePreparationandUseofBuffers inBiologicalSystems,Gueffroy,D. ,ed.CalbiochemCorporation(1975)。不同緩沖液 維持不同范圍的抑，例如憐酸鹽緩沖液通常用于6. 0-8.0的抑，而對于更高的抑，可W使用 棚酸鹽緩沖液，而對于更低的pH，可W使用碳酸鹽緩沖液。本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠根據(jù)待維持 的抑容易地確定使用的合適緩沖液?？蒞用于本發(fā)明的方法的緩沖液的非限制性實例包 括MES、MOPS、M0PS0、TriS、肥陽S、憐酸鹽、乙酸鹽、巧樣酸鹽、班巧酸鹽、碳酸鹽、棚酸鹽和錠 緩沖液，W及運些的組合。
[0064]術(shù)語"洗涂緩沖液"或"平衡緩沖液"在本文中可交換使用，指在使樣品與含碳物 質(zhì)接觸之前用來洗涂或重新平衡含碳物質(zhì)（例如，活性炭）的緩沖液。 陽0化]術(shù)語"電導(dǎo)率"指水溶液在兩個電極之間傳導(dǎo)電流的能力。在溶液中，電流通過離 子轉(zhuǎn)運流動。因此，隨著水溶液中存在的離子量的增加，溶液會具有較高的電導(dǎo)率。測量電 導(dǎo)率的單位為毫西口子（milliSiemens)每厘米（mS/cm或mS)，并且可W利用可商購的電導(dǎo) 率計（例如，由化ion銷售）進行測量。溶液的電導(dǎo)率可W通過改變其中離子的濃度來改 變。例如，可W改變?nèi)芤褐芯彌_劑的濃度和/或鹽（例如化C1或KC1)的濃度W獲得期望 的電導(dǎo)率。優(yōu)選地，如下文實施例中，修改各種緩沖液的鹽濃度W獲得期望的電導(dǎo)率。
[0066] II.用于本專所沐方法的示例忡含碳物質(zhì)
[0067] 在本發(fā)明的方法中，某些含碳物質(zhì)如活性炭用于選擇性地去除片段?；钚蕴靠蒞 描述為具有非常高表面積的多孔固體。在一些實施方案中，活性炭包含活性木炭?；钚蕴靠蒞源自各種來源，包括但不限于煤炭、木材、挪殼、果殼和泥炭?？蒞通過在受控氣氛下物理 活化（包括加熱）或者通過利用強酸、堿或氧化劑化學(xué)活化來從運些材料制備活性炭?；?化過程產(chǎn)生具有高表面積的多孔結(jié)構(gòu)，運賦予活性炭更大的雜質(zhì)去除能力?？蒞修改活化 過程W控制表面的酸性。 W側(cè)活性炭可獲得自各種商業(yè)來源，并且有許多等級和形式。活性炭的一些 商業(yè)供應(yīng)商包括公司如Mea抓estVacoCo巧.，Richmond,VA,USA;No;ritAmericas Inc. ,Marshall,TX,USA；CalgonCarbonCorp. ,Pittsburgh,PA,USA。
[0069] 在本文所述的一些實施方案中，如本文所述，將活性炭滲入包含纖維素的纖維介 質(zhì)中。
[0070] 可W用于本發(fā)明的方法的可商購的活性炭材料包括但不限 于Nuchar腳活性炭（MeadWestvacoCorporation,Richmond,VA,USA); NucharSA20(MeadWestVacoCorporation,Richmond,VA,USA);Nuchar SN(MeadWestvacoCorporation,Richmond,VA,USA) ；NucharWV-B 30(MeadWestvacoCo;rporation,Richmond,VA,USA);RGCPowder活性炭 (MeadWestvacoCorporation,Richmond,VA,USA) ;No;ritDarcoKB-G活性 炭(NoritAmericasInc.,Marshall,Texas,USA)；NoritCGPSuper活性 炭(NoritAmericasInc.,Marshall,Texas,USA)；NoritASupraUSP(Norit AmericasInc. ,Marshall,Texas,USA)；NoritESupraUSP(NoritAmericas Inc. ,Marshall,Texas,USA)；NoritCGRAN(NoritAmericasInc. ,Marshall,Texas,USA)； NoritSXUltra(NoritAmericasInc. ,Marshall,Texas,USA) ；ChemvironPulsorb PGC活性炭（ChemvironCarbon,Feluy,Belgium)。
[0071] 活性炭的兩種主要形式為粉狀和顆粒狀。粉狀活性炭包含小且通常小于1mm直徑 的顆粒，并且最常用于液體的純化。顆粒狀活性炭具有較大的顆粒和因此較小的表面積，因 此其優(yōu)選用于其中擴散速度較快的氣體純化。
[0072] 活性炭在消費者應(yīng)用（如水、食品、飲料和藥物純化）中使用的對安全的重要考慮 是減少并控制可提取的化合物。意圖用于飲用水和食品接觸應(yīng)用的活性炭通常按照覆蓋水 的所有間接添加劑的安全標(biāo)準(zhǔn)ANSI/NSFStandard61進行制備。而且，ASTM標(biāo)準(zhǔn)測試方 法D6385描述了通過灰化確定活性炭中酸可提取含量，并且可W用來研究和最小化來自活 性炭的可提取物水平。
[0073] -系列活性炭類型可用于各種應(yīng)用。例如，Mea抓estVacoCo巧.提供隨它們的能 力、表面酸性、對祀分子的孔可接近性和預(yù)期應(yīng)用變化的12種類型的粉狀活性炭。一般期 望最大化活性炭的雜質(zhì)去除能力。
[0074] III.確定樣品中的片段量的方法
[0075] 確定樣品中祀蛋白片段量的一般技術(shù)包括幾種不同的分析色譜方法。大小排阻或 凝膠滲透色譜基于它們流體動力學(xué)體積的差異分離片段與祀蛋白。反相HPLC和疏水相互 作用色譜化1C)基于它們疏水性的差異分離片段與祀蛋白。陰離子交換（AE訝和陽離子交 換（CE訝色譜基于電荷量的差異分離片段與祀蛋白?；旌夏Ｊ缴V基于它們電荷量和它們 疏水性的差異分離片段與祀蛋白。
[0076] 通常利用在線UV檢測器確定回收自色譜柱的溶液中蛋白的相對量，雖然也可W 采用其他類型的在線檢測器，如折射率檢測器、巧光檢測器。將所得的色譜圖中的不同峰整 合W確定祀蛋白峰和對應(yīng)于祀蛋白片段的峰的面積。然后通過用所有片段峰面積的總和除 W祀蛋白峰面積和所有片段峰面積的總和來計算樣品中片段的百分比。
[0077] 確定包含祀蛋白的樣品中的片段量的一般技術(shù)還包括幾種不同的凝膠電泳分析 技術(shù)，如SDS聚丙締酷胺凝膠（PA(iE)電泳、自由流電泳、等電聚焦、等速電泳、親和電泳、免 疫電泳、對流電泳和毛細管電泳。然后通常利用染色使一段凝膠中的蛋白量可見。將染色 點的強度定量，然后通過用片段峰的強度除W祀蛋白峰的強度和片段峰的強度的總和來計 算樣品中片段的百分比。
[0078]IV.含碳物質(zhì)在去除片段中的用旅
[0079] 下文描述一種可W用于從包含祀蛋白的樣品選擇性地去除片段的一般方法。
[0080] 在一些實施方案中，利用本文所述的方法，通過用活性炭靜態(tài)處理溶液來從祀蛋 白的溶液選擇性地減少片段。在運個實施方案中，W干燥形式或懸浮于溶液中來將活性炭 添加至包含祀蛋白和待去除的片段的溶液中。然后允許溶液與活性炭相互作用長達48小 時的時間。優(yōu)選保持將活性炭懸浮于溶液內(nèi)，W便最大化蛋白雜質(zhì)吸附率。通過移動溶液 容器或用磁力攬拌棒攬拌溶液或用機械攬拌器攬拌溶液來攬動溶液。
[0081] 然后從溶液分離出活性炭，其中活性炭結(jié)合至待選擇性地去除的片段?？蒞通過 過濾溶液并回收溶液濾液來分離結(jié)合的活性炭?；蛘?，可W通過離屯、溶液或允許結(jié)合的活 性炭沉降并回收上清溶液來分離結(jié)合的活性炭。如果離屯、或沉降之后任何顆粒留在上清 中，可W通過過濾將它們?nèi)コ?。剩余溶液包含降低水平的選擇性地去除的片段。
[0082] 在一些實施方案中，用活性炭的含水漿裝載色譜裝置，例如柱。還可朗尋活性炭作 為干粉裝入裝置，例如柱，然后用水溶液濕潤。但是，有時，當(dāng)將柱干包裝時，從活性炭之間 去除小氣泡可能具有挑戰(zhàn)性。然后用與包含祀蛋白的溶液相似的緩沖液將柱平衡。隨后使 溶液W-定流速通過活性炭柱，所述流速導(dǎo)致15sec-10.Omin的柱停留時間。然后收集已 通過活性炭柱的溶液，其不含或包含降低水平的利用活性炭選擇性地去除的片段。
[0083] 在各種實施方案中，可W通過過濾或者離屯、或者離屯、和過濾的組合從包含祀蛋白 的樣品去除結(jié)合至片段的活性炭?？蒞通過分析色譜（56(：、陽(：、46乂八6乂、混合模式）或分 析凝膠電泳技術(shù)（SDSPAGE、自由流電泳、等電聚焦、等速電泳、親和電泳、免疫電泳、對流電 泳、毛細管電泳）確定祀蛋白溶液中片段的初始水平。
[0084] 通過W下實施例進一步說明本發(fā)明，所述實施例不應(yīng)當(dāng)理解為限制性的。本申請 中引用的所有參考文獻、專利和公開的專利申請的內(nèi)容W及圖均援引加入本文。 陽0化]連施例
[0086] 實施例1.活忡炭在靜杰結(jié)合條件下去除單巧陳杭體片段中的用旅
[0087] 運個代表性實施例證實通過用活性炭靜態(tài)處理可W從包含單克隆抗體的樣品選 擇性地去除單克隆抗體片段。
[0088] 如下文所述，制備稱作MABI和MABII的兩種單克隆抗體的溶液，從而其包含約 1 %單克隆抗體片段，并且在靜態(tài)結(jié)合條件下用活性炭處理。
[0089] 通過用木瓜蛋白酶消化一部分單克隆抗體W產(chǎn)生片段來開始制備滲入MABI 和MABII片段的溶液。消化之后，通過添加0.3M艦乙酸鹽溶液來將酶滅活。用透析管(StandardRCDialysisTrialKits,Spectra/i)〇r嚴(yán) 1-3, 3. 5KMWCO, 54mmFLATWIDTH, 序列號：132725,SpectrumL油oratories,Inc.RanchoDominguez,CA, 90220USA)將木瓜蛋 白酶消化的單克隆抗體溶液透析入水W去除緩沖液鹽。將透析管裝載約0. 1化木瓜蛋白酶 消化的單克隆抗體溶液并浸入4.化水中24小時。隨后將透析管移入有4.化新鮮水的新 容器中，其中其保持浸沒額外的24小時。
[0090] 滲入片段的MABI儲備溶液制備自0. 5血木瓜蛋白酶消化的MABI和8. 0血的抑 7.0的25mMTris中的未消化的MBIA蛋白洗脫液。滲入片段的MBII儲備溶液制備 自1. 0血木瓜蛋白酶消化的MABII、8. 0血水中的未消化的MABII和2. 0血的抑7. 0的 50mMTris。通過 0.22μηι膜（Stericup-GP0.22μηιMilliporeExpressPLUS膜，250血， 目錄編號：SCGPU02RE，EMDMilliporeCo巧oration,Billerica,ΜΑ, 01821，USA)過濾溶液。 滲入片段的MABI溶液包含5. 52mg/mL的MABI與1. 06%的片段，而滲入片段的MABII溶 液包含5. 72mg/mL的MABII與0. 85%的片段。 陽0川對于兩種單克隆抗體溶液，將15mL離屯、管裝載0mg、5mg或lOmg的Nuchar皿活 性炭（Mea抓estVacoCo巧oration,Richmond,VA,USA)。將 2. 0血滲入片段的MABI儲備 溶液或滲入片段的MABII儲備溶液添加至離屯、管中。允許管旋轉(zhuǎn)20小時。隨后將所有管 進行離屯、并通過 0.22 微米膜（MillexSyringeFilterUnits,Millex-GV, 0.22μm,PVDF, 33mm, 丫滅菌，目錄編號：SLGV033RB,EMDMilliporeCo巧oration,Billerica,MA, 01821, USA)過濾上清溶液，W便去除可能仍然懸浮于溶液中的任何活性炭顆粒。利用IgG