一種三維結構的細胞捕獲與釋放芯片及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及微流控芯片的制備方法，具體的是一種三維結構的細胞捕獲與釋放芯片，及采用該芯片來捕獲和釋放細胞的方法，適用于微米尺度的細胞和顆粒的捕獲和釋放。
【背景技術】
[0002]微流芯片是微分析系統(tǒng)的核心，微流芯片的發(fā)明及應用給化學、食品、環(huán)境、醫(yī)學等科學領域提供了很大的便利，促使了一些分析的微型化、集成化、自動化及便捷化。大大的節(jié)省了一些化學反應對貴重化學試劑的消耗，也大大的提高了分析效率、降低了費用。
[0003]通常捕獲細胞的微流芯片主要是運用機械分離法、電誘導分離法和磁操控分離法。目前運用機械分離法制作的微流芯片，捕獲效率達97%，但是也具有本身的一些缺點，其缺點可以概括為制作工藝復雜，孔道容易堵塞，不能滿足大批量的檢測需求。
[0004]目前制備的微流芯片主要采用光刻和化學刻蝕。主要使用的材料有石英、玻璃和高聚物等，使用高聚物制作的微流芯片多采用光刻制備的方法，刻蝕出來的微流芯片溝道形狀規(guī)則，且光刻的工藝復雜成本高，不宜推廣應用。在玻璃及石英等硅基介質制作出來的微流芯片主要采用化學刻蝕的方法來制備，其制作出來的微流芯片穩(wěn)定性好，使用壽命長。但是傳統(tǒng)的化學刻蝕的方法刻蝕出來的微流芯片的溝道都很規(guī)則，無法刻蝕出具有特殊形狀的微流溝道的微流芯片。傳統(tǒng)的刻蝕方法不能夠刻蝕出特殊形狀溝道的微流芯片。

【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服上述現(xiàn)有技術的不足，提供一種三維結構的細胞捕獲及釋放芯片及其制備方法，其特點包括加工簡單，不堵塞，效率高，適合大批量生產與檢測芯片，具有良好的化學穩(wěn)定性。另一個目的在于提供一種基于三維結構的芯片進行捕獲及釋放細胞的方法，捕獲效率高，釋放出的細胞完整度好。
[0006]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決上述技術問題所采用的技術方案是:
一種三維結構的細胞捕獲及釋放芯片，包括上部蓋片和下部基片，上層蓋片的背面刻蝕有微流溝道，蓋片的微流溝道兩端分別設置入口和出口，基片上有一層殼聚糖薄膜，蓋片和基片通過粘合劑粘合。
[0007]上述三維結構的細胞捕獲及釋放芯片制備方法，其步驟如下:
(1)芯片的制備:
(a)基底的選擇及清洗:選取蓋片和基片的材料可以是硅片、石英或玻璃等硬質材料且至少有一個材料是透明的，將選擇好的蓋片和基片進行清洗，去除表面的油污等雜質；
(b)刻蝕掩膜處理:對清洗好的蓋片和基片在50°C~100°C的烘箱中進行烘干處理，烘干處理之后在蓋片的上下表面粘附耐化學腐蝕性的掩膜，通過激光切割，把即將要刻蝕的區(qū)域部分切出來，除去切割出來的防腐蝕掩膜，得到要刻蝕的區(qū)域；
掩膜處理的目的在于裸露出需要進行刻蝕的基片的一部分，把不需要進行刻蝕的基片的其他部分保護起來。
[0008](c)濕法刻蝕:將處理好的蓋片，通過夾具按照0.0lmm/min-lmm/min的速率垂直緩慢的放入到刻蝕液中進行刻蝕，因為進入刻蝕液有先后順序，所以導致刻蝕的時間不相同，導致了刻蝕的深度不同，從而蓋片上刻蝕出的微流溝道為鍥形的三維結構；
(d)打孔:去除掉蓋片表面的刻蝕掩膜，使整個蓋片完整的裸露出來，蓋片進行清洗處理之后對蓋片進行打孔，在蓋片的至少兩個不同等高面的區(qū)域打孔，兩個孔分別為入口孔和出口孔；
(e)殼聚糖薄膜的制備:使用脫乙酰度60%-95%的殼聚糖，使0.3g-2.0g殼聚糖融入體積為10ml的0.lmol/L醋酸溶液中，經過1.5-2.5h的攪拌形成殼聚糖膠體；使用移液槍吸取殼聚糖凝膠溶液滴至基片上，將基片放置在勻膠機上，轉速依次為800r/min和1500r/min，各轉15s，均勻鋪設后靜置，直至膠體成膜；
(f)蓋片與基片的組合:基片和蓋片貼合后，在它們的邊沿涂上PDMS(polydimethylsiloxane,聚二甲基娃氧燒膠)，等待10_20min后放入馬弗爐進行加熱，加熱溫度范圍為200-450°C，便得到了基于三維結構的細胞捕獲及釋放芯片。
[0009]—種基于三維結構的芯片進行捕獲及釋放細胞的方法，其步驟如下:
(1)細胞的捕獲:
(a)將待檢測含有細胞的液體樣本通過注射栗以0.01ul/min-lul/min的速率從入口孔注入到鍵合完全的芯片中；
(b)繼續(xù)在入口注入磷酸鹽緩沖溶液(即PBS溶液)，以50-100ul/min的速度注入進行清洗;
(c)在入口注入示蹤物質(如:染細胞核的熒光染料如DAPI或者Hoechst染料)或加入免疫試劑，對目標細胞進行識別；
(d)再次在入口注入磷酸鹽緩沖溶液進行清洗，將芯片放置在顯微鏡下觀察捕獲的目標細胞；
(2)細胞的釋放:
(a)芯片捕獲到特定捕獲大小的細胞卡在相應的位置，其他的細胞由出口流出芯片；
(b)在芯片入口注入體積分數(shù)為3%-5%的醋酸溶液，通入速度為50ul/min-80ul/min；
(c)繼續(xù)在入口注入磷酸鹽緩沖溶液(即PBS溶液)，以50-100ul/min的速度注入進行清洗，芯片中殼聚糖薄膜被溶解掉，芯片內部高度變大，被捕獲住的細胞有芯片的出口處被沖出來。
[0010]由于采用了以上技術方案，本發(fā)明改變了以往只針對不同細胞尺寸制作不同芯片的情況且該情況經常發(fā)生阻塞。本發(fā)明的制備方法，加工工藝簡單，制備出來捕獲和釋放細胞/顆粒的芯片具有微型化結構的特點，捕獲時間短且效率高，可廣泛的用于分析領域。
【附圖說明】
[0011]圖1.芯片的俯視圖。
[0012]圖2.芯片的剖視圖。
[0013]圖3.芯片捕獲細胞后的剖視圖。
[0014]圖4.芯片捕獲細胞后的俯視圖。
[0015]圖5.芯片細胞釋放剖視圖。
[0016]圖6.芯片細胞釋放俯視圖。
[0017]其中:1_蓋片，2_基底，3_入口，4_微流溝道，5_出口，6_殼聚糖薄膜，7_ctc循環(huán)腫瘤細胞。
【具體實施方式】
[0018]下面結合實施實例對本發(fā)明進行進一步說明。
[0019]實施例1:
如圖1-2所示，一種三維結構的細胞捕獲及釋放芯片，包括上部蓋片1和下部基片2，上層蓋片1的背面刻蝕有微流溝道4，蓋片1的微流溝道4兩端分別設置入口 3和出口 4，基片2上有一層殼聚糖薄膜6，蓋片1和基片2通過粘合劑粘合。
[0020]上述三維結構的細胞捕獲及釋放芯片的制備方法，步驟如下:
(a)選取蓋片和基片的材料玻璃或者硅片或者石英，將選擇好的蓋片和基片進行清洗，去除表面的油污等雜質；
(b)對清洗好的蓋片和基片在50°C~100°C的烘箱中進行烘干處理，烘干處理之后在蓋片的上下表面粘附耐化學腐蝕性的掩膜，通過激光切割，把即將要刻蝕的區(qū)域部分切出來，除去切割出來的防腐蝕掩膜，得到要刻蝕的區(qū)域；
(c)將處理好的蓋片，通過夾具按照或0.5mm/min的速率垂直緩慢的放入到刻蝕液中進行刻蝕，從蓋片進入刻蝕液到刻蝕完成，總共耗時為1小時，因為進入刻蝕液有先后順序，所以導致刻蝕的時間不相同，導致了刻蝕的深度不同，從而蓋片上刻蝕出的微流溝道為鍥形的三維結構；
所述的刻蝕液為典型的緩沖氧化硅蝕刻液，其中含氟化銨，(BOE: Buffer OxideEtcher)與去離子水按1:10的質量比例勾兌而成。
[0021](d)去除掉蓋片表面的刻蝕掩膜，使整個蓋片和基片完整的裸露出來，對蓋片和基片進行清洗處理之后，對蓋片進行打孔，在蓋片的至少兩個不同等高面的區(qū)域打孔，直徑為0.6mm，兩個孔分別為入口孔和出口孔；
(e)使用脫乙酰度60%-95%的殼聚糖，使0.3g殼聚糖融入體積為10ml的0.lmol/L醋酸溶液中，經過2h的攪拌形成殼聚糖膠體；使用移液槍吸取殼聚糖凝膠溶液滴至下片上，將下片放置在勻膠機上，轉速依次為800r/min和1500r/min，各轉15s，均勻鋪設后靜置，直至膠體成膜；
(f )基片和蓋片貼合后，在它們的邊沿涂上PDMS (polydimethyl si loxane,聚二甲基娃氧烷膠)，等待15min后放入馬弗爐進行加熱，加熱溫度范圍為300°C處理，便得到了基于三維結構的細胞捕獲及釋放芯片。
[0022]實施例2:
一種三維結構的細胞捕獲及釋放芯片的制備方法，步驟如下:
(a)選取蓋片和基片的材料或玻璃為玻璃或者硅片或者石英，將選擇好的蓋片和基片進行清洗，去除表面的油污等雜質；
(b)對清洗好的蓋片和