本申請要求2016年12月2日提交的美國臨時申請序列號62/429,466的優(yōu)先權(quán)，其內(nèi)容通過引用整體并入本文。
背景技術(shù)：
：多肽的四級結(jié)構(gòu)可以極大地影響它們的物理化學(xué)和生物學(xué)特性。蛋白質(zhì)聚集或非天然聚集是指蛋白質(zhì)分子組裝成由兩種或兩種以上蛋白質(zhì)構(gòu)成的穩(wěn)定復(fù)合物的過程，其中單個蛋白質(zhì)表示為單體。聚集體通常通過強(qiáng)非共價接觸保持在一起，并且需要一定程度的構(gòu)象變形(解折疊或錯誤折疊)以便呈現(xiàn)形成單體之間的強(qiáng)接觸的關(guān)鍵氨基酸段。雖然聚集傾向于增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，但它通常以蛋白質(zhì)的生物活性為代價，降低組合物的均勻性，并且在一些情況下可能增加蛋白質(zhì)的免疫原性。這些性質(zhì)對使用此些蛋白質(zhì)作為生物劑進(jìn)行治療的能力產(chǎn)生不利影響。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本技術(shù)涉及將含myc多肽控制組裝成具有確定尺寸范圍的生物活性顆粒群。本文提供了用于產(chǎn)生保持生物活性的含myc納米顆粒的穩(wěn)定制劑的方法。還提供了使用生物活性顆粒進(jìn)行治療的方法，包含治療細(xì)胞的體外和體內(nèi)方法。本文公開了包括被配制成生物活性穩(wěn)定納米顆粒的含myc多肽的組合物。在一些實(shí)施例中，含myc多肽包括融合肽，其中融合肽包括：(i)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；(ii)myc多肽序列，并且其中納米顆粒表現(xiàn)出myc的生物活性。在一些實(shí)施例中，融合肽包括seqidno:1。在一些實(shí)施例中，融合肽包括seqidno:10。在某些實(shí)施例中，本文提供了包括生物活性納米顆粒群的組合物，所述生物活性納米顆粒群包括一或多種含myc多肽。在一些實(shí)施例中，生物活性納米顆粒的數(shù)均直徑介于約80nm和約150nm之間。在一些實(shí)施例中，調(diào)配物的ph為至少約ph6.0，但不大于約ph8。在一些實(shí)施例中，相較于未與含myc多肽的組合物接觸的抗cd3或抗cd28活化的t細(xì)胞，在適合t細(xì)胞增殖的條件下使抗cd3或抗cd28活化的t細(xì)胞與含myc多肽納米顆粒組合物接觸增強(qiáng)了t細(xì)胞的活化、存活或增殖中的一或多種。在一些實(shí)施例中，myc多肽是乙?；?。在一些實(shí)施例中，含myc多肽包括myc融合肽，其包括與myc多肽連接的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，myc融合肽進(jìn)一步包括一或多個連接蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和myc多肽的分子。在一些實(shí)施例中，含myc多肽包括具有以下一般結(jié)構(gòu)的myc融合肽：蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域-x-myc序列，其中-x-是連接蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和myc序列的分子。在一些實(shí)施例中，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域序列是tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域序列。在一些實(shí)施例中，tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域序列選自由以下組成的群組：tat[48-57]和tat[57-48]。在一些實(shí)施例中，myc多肽是包括seqidno:1的myc融合肽。在一些實(shí)施例中，myc多肽是包括seqidno:10的myc融合肽。在一些實(shí)施例中，納米顆粒的數(shù)均直徑介于約80nm和約150nm之間。在一些實(shí)施例中，納米顆粒的數(shù)均直徑介于約100nm和約110nm之間。在一些實(shí)施例中，組合物進(jìn)一步包括藥學(xué)上可接受的賦形劑。在一些實(shí)施例中，組合物被配制用于局部施用、口服施用、腸胃外施用、鼻內(nèi)施用、口腔施用、直腸施用或透皮施用。在某些實(shí)施例中，本文還提供了通過施用治療有效量的本文提供的組合物來在有需要的受試者中增加一或多種免疫細(xì)胞的活化、存活或增殖中的一或多種或增加免疫應(yīng)答的方法，所述組合物包括生物活性納米顆粒群，所述生物活性納米顆粒群包括一或多種含myc多肽。在一些實(shí)施例中，一或多種免疫細(xì)胞包括一或多種無能免疫細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，一或多種免疫細(xì)胞是t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，t細(xì)胞選自由以下組成的群組：幼稚t細(xì)胞、cd4+t細(xì)胞、cd8+t細(xì)胞、記憶t細(xì)胞、活化t細(xì)胞、無能t細(xì)胞、耐受t細(xì)胞、嵌合b細(xì)胞和抗原特異性t細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，一或多種免疫細(xì)胞是b細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，b細(xì)胞選自由以下組成的群組：幼稚b細(xì)胞、血漿b細(xì)胞、活化b細(xì)胞、記憶b細(xì)胞、無能b細(xì)胞、耐受b細(xì)胞、嵌合b細(xì)胞和抗原特異性b細(xì)胞。在某些實(shí)施例中，本文還提供了在造血干細(xì)胞移植(hsct)之后引發(fā)造血干細(xì)胞以增強(qiáng)植入的方法，其包括在移植造血干細(xì)胞之前在體外使一或多種造血干細(xì)胞與本文提供的組合物接觸，所述組合物包括生物活性納米顆粒群，所述生物活性納米顆粒群包括一或多種含myc多肽。在某些實(shí)施例中，本文還提供了制備包括一或多種含myc多肽的生物活性納米顆粒群的方法，所述方法包括：(a)使含myc多肽溶解在包括某一濃度的變性劑的增溶溶液中增溶以提供增溶的含myc多肽；(b)用第一重折疊緩沖液對增溶的含myc多肽進(jìn)行第一重折疊步驟至少約30到180分鐘以提供第一多肽混合物，所述第一重折疊緩沖液包括約0.35到約0.65濃度的步驟(a)的變性劑和約100mm到約1m堿金屬鹽和/或堿性金屬鹽；(c)用第二重折疊緩沖對第一多肽混合物進(jìn)行第二重折疊步驟至少約30到180分鐘以提供第二多肽混合物，所述第二重折疊緩沖液包括約0.10到約0.30濃度的步驟(b)的變性劑和約100mm到1m堿金屬鹽和/或堿性金屬鹽；(e)用第三重折疊緩沖液對第二多肽混合物進(jìn)行第三重折疊步驟至少約30到180分鐘，所述第三重折疊緩沖液包括約100mm到1m堿金屬鹽和/或堿性金屬鹽；和(f)將含myc多肽保持在第三重折疊緩沖液中一段時間，所述時間足以產(chǎn)生數(shù)均直徑介于約80nm和約150nm之間的生物活性納米顆粒，其中相較于未與生物活性納米顆粒接觸的抗cd3或抗cd28活化的t細(xì)胞，在適合t細(xì)胞增殖的條件下使抗cd3或抗cd28活化的t細(xì)胞與生物活性納米顆粒接觸增強(qiáng)了t細(xì)胞的活化、存活或增殖中的一或多種。在一些實(shí)施例中，第一重折疊步驟、第二重折疊步驟和/或第三重折疊步驟包括通過緩沖液更換來進(jìn)行步驟。在一些實(shí)施例中，使用切向流過濾進(jìn)行緩沖液更換。在一些實(shí)施例中，堿金屬鹽包括鈉鹽、鋰鹽和鉀鹽中的一或多種。在一些實(shí)施例中，堿金屬鹽包括氯化鈉(nacl)、溴化鈉、硫酸氫鈉、硫酸鈉、碳酸氫鈉、碳酸鈉、氯化鋰、溴化鋰、硫酸氫鋰、硫酸鋰、碳酸氫鋰、碳酸鋰、氯化鉀、溴化鉀、硫酸氫鉀、硫酸鉀、碳酸氫鉀和碳酸鉀中的一或多種。在一些實(shí)施例中，堿性鹽包括鎂鹽和鈣鹽中的一或多種。在一些實(shí)施例中，堿性金屬鹽包括氯化鎂、溴化鎂、硫酸氫鎂、硫酸鎂、碳酸氫鎂、碳酸鎂、氯化鈣、溴化鈣、硫酸氫鈣、硫酸鈣、碳酸氫鈣和碳酸鈣中的一或多種。在一些實(shí)施例中，堿金屬鹽包括氯化鈉(nacl)。在一些實(shí)施例中，第一、第二和/或第三重折疊緩沖液包括約500mmnacl。在一些實(shí)施例中，步驟(a)中的變性劑的濃度為約1m到約10m。在一些實(shí)施例中，變性劑包括胍、鹽酸胍、氯化胍、硫氰酸胍、尿素、硫脲、高氯酸鋰、氯化鎂、苯酚、甜菜堿、肌氨酸、氨基甲酰肌氨酸、?；撬帷⒍讈嗧?dmso)；醇，例如丙醇、丁醇和乙醇；洗滌劑，例如十二烷基硫酸鈉(sds)、n-月桂酰肌氨酸、兩性洗滌劑、非洗滌劑磺基甜菜堿(ndsb)、tritonx-100、nonidettmp-40、tweentm系列和brijtm系列；氫氧化物，例如氫氧化鈉和氫氧化鉀中的一或多種。在一些實(shí)施例中，第一重折疊緩沖液、第二重折疊緩沖液和/或第三重折疊緩沖液各自獨(dú)立地包括緩沖劑。在一些實(shí)施例中，緩沖劑包括tris(三[羥甲基]氨基甲烷)、hepps(n-[2-羥乙基]哌嗪-n'-[3-丙烷-磺酸])、capso(3-[環(huán)己基氨基]-2-羥基-1-丙磺酸)、amp(2-氨基-2-甲基-1-丙醇)、caps(3-[環(huán)己基氨基]-1-丙磺酸)、ches(2-[n-環(huán)己基氨基]乙磺酸)、精氨酸、賴氨酸和硼酸鈉中的一或多種。在一些實(shí)施例中，緩沖劑獨(dú)立地以約1mm到約1m的濃度存在。在一些實(shí)施例中，第一重折疊緩沖液、第二重折疊緩沖液和/或第三重折疊緩沖液各自獨(dú)立地包括氧化劑和還原劑，其中氧化劑與還原劑的摩爾比為約2:1到約20:1。在一些實(shí)施例中，氧化劑包括半胱氨酸、二硫化谷胱甘肽(“氧化型谷胱甘肽”)或兩者。在一些實(shí)施例中，氧化劑的包含濃度為約0.1mm到約10mm。在一些實(shí)施例中，還原劑包括β-巰基乙醇(bme)、二硫蘇糖醇(dtt)、二硫赤蘚糖醇(dte)、三(2-羧乙基)膦(tcep)、胱氨酸、半胱胺、巰基乙酸鹽、谷胱甘肽和硼氫化鈉中的一或多種。在一些實(shí)施例中，還原劑的包含濃度為約0.02mm到約2mm。在一些實(shí)施例中，變性劑包括尿素。在一些實(shí)施例中，變性劑包括6-8m尿素。在一些實(shí)施例中，第一、第二和/或第三重折疊緩沖液包括谷胱甘肽和/或氧化型谷胱甘肽。在一些實(shí)施例中，第一、第二和/或第三重折疊緩沖液包括5mm谷胱甘肽和/或1mm氧化型谷胱甘肽。在一些實(shí)施例中，第一、第二和/或第三重折疊緩沖液包括甘油。在一些實(shí)施例中，步驟(f)進(jìn)行至少5小時。在一些實(shí)施例中，步驟(f)進(jìn)行至少10小時。在一些實(shí)施例中，步驟(f)進(jìn)行10-12小時。在一些實(shí)施例中，步驟(f)進(jìn)一步包括以小于1000rpm的速度在第三重折疊緩沖液中攪拌含myc多肽。在一些實(shí)施例中，本文提供的方法進(jìn)一步包括從微生物宿主細(xì)胞分離重組含myc多肽。在一些實(shí)施例中，微生物宿主細(xì)胞是大腸桿菌。在一些實(shí)施例中，從微生物宿主細(xì)胞分離重組含myc多肽包括從誘導(dǎo)型啟動子表達(dá)含myc多肽。在一些實(shí)施例中，從微生物宿主細(xì)胞分離重組含myc多肽包括使用親和色譜和/或陰離子交換色譜純化含myc多肽。在一些實(shí)施例中，含myc多肽是乙?；?。在一些實(shí)施例中，本文提供的納米顆粒組合物及其產(chǎn)生方法的含myc多肽是重組多肽。在一些實(shí)施例中，本文提供的納米顆粒組合物的含myc多肽包括myc融合肽，其包括與myc多肽連接的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，myc融合肽進(jìn)一步包括一或多個連接蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和myc多肽的分子。在一些實(shí)施例中，含myc多肽包括具有以下一般結(jié)構(gòu)的myc融合肽：蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域-x-myc序列，其中-x-是連接蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和myc序列的分子。在一些實(shí)施例中，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域序列是tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域序列。在一些實(shí)施例中，tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域序列選自由以下組成的群組：tat[48-57]和tat[57-48]。在一些實(shí)施例中，含myc多肽是包括seqidno:1的myc融合肽。在一些實(shí)施例中，含myc多肽是包括seqidno:10的myc融合肽。在一些實(shí)施例中，納米顆粒的數(shù)均直徑為約80nm和約150nm。在一些實(shí)施例中，納米顆粒的數(shù)均直徑為約100nm和約110nm。在一個示例性實(shí)施例中，本文提供了一種制備包括一或多種含myc多肽的生物活性納米顆粒群的方法，所述方法包括：(a)使含myc多肽在緩沖增溶溶液中變性以提供變性的含myc多肽，所述緩沖增溶溶液包括6-8m尿素；(b)用第一重折疊緩沖液對變性的含myc多肽進(jìn)行第一重折疊步驟至少約120分鐘以提供第一多肽混合物，所述第一重折疊緩沖液包括約3m尿素和約500mmnacl；(c)用第二重折疊緩沖液通過緩沖液更換對第一多肽混合物進(jìn)行第二重折疊步驟至少約120分鐘以提供第二多肽混合物，所述第二重折疊緩沖液包括約1.5m尿素和約500mmnacl；(d)用第三重折疊緩沖液通過緩沖液更換對第二多肽混合物進(jìn)行第三重折疊步驟至少約120分鐘，所述第三重折疊緩沖液包括約500mmnacl；(f)將含myc多肽保持在第三重折疊緩沖液中一段時間，所述時間足以產(chǎn)生數(shù)均直徑介于約80nm和約150nm之間的生物活性納米顆粒，其中相較于未與生物活性納米顆粒接觸的抗cd3或抗cd28活化的t細(xì)胞，在適合t細(xì)胞增殖的條件下使抗cd3或抗cd28活化的t細(xì)胞與生物活性納米顆粒接觸增強(qiáng)了t細(xì)胞的活化、存活或增殖中的一或多種。附圖說明圖1a和圖1b示出了使用流式細(xì)胞術(shù)技術(shù)的含myc納米顆粒調(diào)配物c2a對抗cd3和抗cd28活化的t細(xì)胞的增殖的影響。圖1a示出了緩沖液對照樣品中t細(xì)胞的增殖。圖1b示出了用含myc納米顆粒調(diào)配物c2a溫育24小時的t細(xì)胞的增殖。圖2a和圖2b示出了通過非對稱流場流分離(af4)和多角度激光散射(malls)分析的選擇含myc納米顆粒調(diào)配物的色譜圖。圖2a和2b分別示出了從調(diào)配物f01和調(diào)配物f02的分析獲得的色譜圖。從在25℃下儲存的樣品獲得跡線t1和t2。從在5℃下儲存的樣品獲得跡線t2*和t4*。時間(t)以周為單位測量，并以t后的數(shù)值示出(即，t1＝一周，t2＝兩周等)。圖3示出了通過使用串聯(lián)sepaxsrt-c2000和300柱通過尺寸排阻色譜(sec)分離生物活性和非活性含myc納米顆粒調(diào)配物而得到的色譜圖的比較。指示了示出生物活性納米顆粒調(diào)配物c12和c13以及生物非活性調(diào)配物r147的分離的跡線。圖4a和圖4b示出了使用尺寸排阻色譜的含myc納米顆粒調(diào)配物c2a的分析以及多角度光散射分析(sec-mals)。圖4a示出了隨折射率(左側(cè)縱坐標(biāo)，rvxri)或分子尺寸(右側(cè)縱坐標(biāo)，rvxmw)而變化的保留體積(ml)。圖4b示出了色譜圖，其示出了生物活性含myc納米顆粒調(diào)配物和生物非活性調(diào)配物的分離。圖5a-d描繪了通過動態(tài)光散射(dls)技術(shù)分析的選擇調(diào)配物中含myc納米顆粒的尺寸分布。圖5a描繪了通過dls的含myc納米顆粒調(diào)配物c2a的尺寸分布。圖5b描繪了以0.5mg/ml濃度測試的非生物活性含myc納米顆粒調(diào)配物r149的尺寸分布。圖5c描繪了以0.5mg/ml濃度測試的生物活性含myc納米顆粒調(diào)配物c12的納米顆粒尺寸分布。圖5d示出了以0.5mg/ml濃度測試的生物活性含myc納米顆粒調(diào)配物c13的納米顆粒尺寸分布。圖6a和圖6b示出了使用納米顆粒跟蹤分析(nta)技術(shù)的含myc納米顆粒調(diào)配物c2a的分析。圖6a示出了從納米顆粒調(diào)配物c2a的三份確定觀察到的跟蹤。圖6b示出了從圖6a中所示的c2a納米顆粒調(diào)配物的分析得到的三份確定的共識跟蹤。圖7示出了使用電子顯微鏡檢查技術(shù)的含myc納米顆粒調(diào)配物c2b的分析。圖8示出了通過肽圖譜分析技術(shù)的生物活性和非活性含myc納米顆粒調(diào)配物的asp-n胞內(nèi)蛋白酶消化物的比較。將生物活性含myc納米顆粒調(diào)配物c2b、c6和c7(“功能性”)與生物非活性含myc納米顆粒調(diào)配物c4、147和149(“非功能性”)進(jìn)行比較。圖9示出了含myc納米顆粒調(diào)配物c13的代表性肽圖譜，其中標(biāo)識出了各個肽峰。圖10a-c示出了納米顆粒調(diào)配物c13的rp-hplc色譜圖。圖10a示出了完整的色譜圖。圖10b和圖10c示出了圖10a中的完整色譜圖的兩個不同的縮放視圖。圖11示出了納米顆粒調(diào)配物c13的遠(yuǎn)uvcd光譜分析的結(jié)果，其被描繪為隨波長(nm)而變化的平均殘基摩爾橢圓率(度·厘米2/分摩爾)。圖12示出了納米顆粒調(diào)配物c13的近uvcd光譜分析的結(jié)果，其被描繪為隨波長(nm)而變化的平均殘基摩爾橢圓率(度·厘米2/分摩爾)。圖13示出了四個單獨(dú)的納米顆粒調(diào)配物c14樣品與兩個牛血清白蛋白(bsa)對照樣品相比的歸一化二階導(dǎo)數(shù)傅里葉變換紅外光譜(ftir)。圖14示出了納米顆粒調(diào)配物c13的分析超速離心(auc)數(shù)據(jù)。圖15a和圖15b分別示出了納米顆粒調(diào)配物c13的非還原(nr)和還原(r)變性sec色譜圖。每個色譜圖上的重疊跡線表示對于在2℃-8℃下儲存的樣品間隔大約1個月進(jìn)行的測試。圖16a和圖16b示出了tat-myc和tat-3amyc納米顆粒調(diào)配物的變性sec色譜圖。圖16b示出了tat-myc的色譜圖。tat-myc蛋白復(fù)合物在6分鐘和7分鐘之間洗脫。較小的蛋白質(zhì)多聚體和賦形劑在8分鐘和15分鐘之間洗脫。圖16b示出了tat-3amyc與功能性tat-myc蛋白制劑相比的色譜圖。大部分非功能性tat-3amyc蛋白制劑包含較小的蛋白質(zhì)多聚體，并且可以看到在8分鐘和17分鐘之間洗脫的賦形劑峰。圖17示出了t細(xì)胞效力測定的結(jié)果。與未治療(nt)相比，tat-myc表現(xiàn)出活t細(xì)胞群增加3倍。與未治療(nt)相比，tat-3amyc表現(xiàn)出活t細(xì)胞群沒有增加。圖18描繪了通過動態(tài)光散射(dls)技術(shù)分析的綠猴tat-myc的選擇調(diào)配物中含myc納米顆粒的尺寸分布。圖19示出了與人tat-myc相比的綠猴tat-myc的rp-hplc色譜圖。圖20示出了與人tat-myc相比的綠猴tat-myc的sec-hplc色譜圖。圖21示出了與人tat-myc相比的綠猴tat-myc的t細(xì)胞效力測定的結(jié)果。具體實(shí)施方式本公開不限于本申請中描述的特定實(shí)施例，其旨在作為本公開的各個方面的單個說明。本文將不描述本公開的所有各個實(shí)施例。在不脫離本公開的精神和范圍的情況下，可以對本公開進(jìn)行多種修改和變化，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所顯而易見。除了本文列舉的那些之外，通過前面的描述，本公開范圍內(nèi)的功能等同的方法和設(shè)備對于本領(lǐng)域技術(shù)人員也是顯而易見的。此些修改和變化旨在落入所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)。本公開僅受所附權(quán)利要求以及此些權(quán)利要求所授權(quán)的等同物的全部范圍的限制。應(yīng)當(dāng)理解，本公開不限于特定用途、方法、試劑、化合物、組合物或生物系統(tǒng)，其當(dāng)然可以有所不同。還應(yīng)當(dāng)理解，本文使用的術(shù)語僅用于描述特定實(shí)施例的目的，而不旨在是限制性的。另外，在根據(jù)馬庫什群組描述本公開的特征或方面的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，本公開因此也根據(jù)馬庫什群組的任何單個成員或成員子群組來描述。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，出于任何和所有目的，特別是在提供書面描述方面，本文公開的所有范圍還涵蓋任何和所有可能的子范圍及其子范圍的組合。任何列出的范圍可以容易地被認(rèn)識為充分描述并實(shí)現(xiàn)了相同的范圍被分解成至少相等的一半、三分之一、四分之一、五分之一、十分之一等。作為一個非限制性實(shí)例，本文討論的每個范圍可以容易地被分解成下三分之一、中三分之一和上三分之一等。本領(lǐng)域技術(shù)人員還將理解，諸如“多達(dá)”、“至少”、“大于”、“小于”等的所有語言包含所述的數(shù)字并且是指可以隨后被分解成如上所討論的子范圍的范圍。最后，如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，范圍包含每個單獨(dú)的成員。因此，例如，具有1-3個細(xì)胞的群組是指具有1個、2個或3個細(xì)胞的群組。類似地，具有1-5個細(xì)胞的群組是指具有1個、2個、3個、4個或5個細(xì)胞的群組等等。除非另外定義，否則本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本公開所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。i.定義本文使用的術(shù)語僅用于描述特定實(shí)施例的目的，并不旨在限制本公開。如本文使用，單數(shù)形式“一個/一種(a/an)”和“所述(the)”旨在也包含復(fù)數(shù)形式，除非上下文另有明確說明。如本文使用，術(shù)語“約”是指值可以變化+/-20％、+/-15％、+/-10％或+/-5％并且仍然在本公開的范圍內(nèi)。例如，“約200iu/ml的濃度”涵蓋介于160iu/ml和240iu/ml之間的濃度。如本文使用，術(shù)語“施用”藥劑(向受試者)包含將藥劑引入或遞送至受試者以執(zhí)行其預(yù)期功能的任何途徑。施用可以通過任何合適的途徑進(jìn)行，包含靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下。施用包含自我施用和由其它人施用。術(shù)語“氨基酸”是指天然存在的和非天然存在的氨基酸，以及以與天然存在的氨基酸類似的方式起作用的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然編碼的氨基酸是20種常見的氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸)和吡咯賴氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸類似物是指與天然存在的氨基酸具有相同基本化學(xué)結(jié)構(gòu)的藥劑，即α碳與氫、羧基基團(tuán)、氨基基團(tuán)和r基團(tuán)結(jié)合，例如高絲氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亞砜、蛋氨酸甲基锍。此些類似物具有修飾的r基團(tuán)(例如，正亮氨酸)或修飾的肽主鏈，但保留了與天然存在的氨基酸相同的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施例中，形成多肽的氨基酸為d形式。在一些實(shí)施例中，形成多肽的氨基酸為l形式。在一些實(shí)施例中，形成多肽的第一多個氨基酸為d形式，而第二多個氨基酸為l形式。氨基酸在本文中通過它們通常已知的三字母符號或由iupac-iub生物化學(xué)命名委員會推薦的單字母符號來指代。同樣，核苷酸通過它們普遍接受的單字母代碼來指代。術(shù)語“多肽”、“肽”和“蛋白質(zhì)”在本文中可互換使用，指代氨基酸殘基的聚合物。所述術(shù)語適用于天然存在的氨基酸聚合物以及其中一或多個氨基酸殘基是非天然存在的氨基酸(例如，氨基酸類似物)的氨基酸聚合物。所述術(shù)語涵蓋任何長度的氨基酸鏈，包含全長蛋白質(zhì)，其中氨基酸殘基通過共價肽鍵連接。如本文使用，“對照”是在實(shí)驗(yàn)中用于比較目的的替代樣品。對照可以是“陽性的”或“陰性的”。例如，當(dāng)實(shí)驗(yàn)的目的是確定治療劑針對特定類型疾病的治療功效的相關(guān)性時，通常使用陽性對照(已知表現(xiàn)出期望的治療性效果的組合物)和陰性對照(未接受治療或接受安慰劑的受試者或樣品)。如本文使用，術(shù)語“有效量”或“治療有效量”是指足以實(shí)現(xiàn)期望的治療性效果的藥劑的量。在治療應(yīng)用的背景下，向受試者施用的治療性肽的量可能取決于感染的類型和嚴(yán)重度以及個體的特點(diǎn)，例如一般健康狀況、年齡、性別、體重和對藥物的耐受性。它還可能取決于疾病的程度、嚴(yán)重度和類型。技術(shù)人員將能夠根據(jù)這些和其它因素確定合適的劑量。如本文使用，術(shù)語“表達(dá)”是指多核苷酸轉(zhuǎn)錄成mrna的過程和/或轉(zhuǎn)錄的mrna隨后被翻譯成肽、多肽或蛋白質(zhì)的過程。如果多核苷酸源自基因組dna，則表達(dá)可以包含在真核細(xì)胞中的mrna剪接?？梢酝ㄟ^測量細(xì)胞或組織樣品中mrna或蛋白質(zhì)的量來確定基因的表達(dá)水平。在一個方面，可以將來自一個樣品的基因的表達(dá)水平直接與來自對照或參考樣品的所述基因的表達(dá)水平進(jìn)行比較。在另一個方面，可以將來自一個樣品的基因的表達(dá)水平直接與施用本文公開的組合物后來自相同樣品的所述基因的表達(dá)水平進(jìn)行比較。術(shù)語“表達(dá)”還指一或多個以下事件：(1)在細(xì)胞內(nèi)從dna序列產(chǎn)生rna模板(例如，通過轉(zhuǎn)錄)；(2)在細(xì)胞內(nèi)處理rna轉(zhuǎn)錄物(例如，通過剪接、編輯、5'帽形成和/或3'末端形成)；(3)在細(xì)胞內(nèi)將rna序列翻譯成多肽或蛋白質(zhì)；(4)在細(xì)胞內(nèi)的多肽或蛋白質(zhì)的翻譯后修飾；(5)在細(xì)胞表面上呈遞多肽或蛋白質(zhì)；和(6)從細(xì)胞分泌或呈遞或釋放多肽或蛋白質(zhì)。術(shù)語“連接子”是指連接(connect/link)兩個序列(例如，連接兩個多肽結(jié)構(gòu)域)的合成序列(例如，氨基酸序列)。在一些實(shí)施例中，連接子含有1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個氨基酸序列。本文使用的術(shù)語“凍干(lyophilized/lyophilization)”等是指首先冷凍待干燥的材料(例如，納米顆粒)然后通過在真空環(huán)境中升華去除冰或冷凍溶劑的工藝。賦形劑可以包含在預(yù)凍干調(diào)配物中以增強(qiáng)凍干產(chǎn)品在儲存時的穩(wěn)定性。凍干樣品可以進(jìn)一步含有另外的賦形劑。如本文使用，術(shù)語免疫細(xì)胞是指在免疫應(yīng)答中起作用的任何細(xì)胞。免疫細(xì)胞具有造血起源，并且包含淋巴細(xì)胞，例如b細(xì)胞和t細(xì)胞；自然殺傷細(xì)胞；骨髓細(xì)胞，例如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和粒細(xì)胞。術(shù)語“淋巴細(xì)胞”是指所有未成熟、成熟、未分化和分化的白色淋巴細(xì)胞群，包含組織特異性和特化變種。作為非限制性實(shí)例，它涵蓋b細(xì)胞、t細(xì)胞、nkt細(xì)胞和nk細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，淋巴細(xì)胞包含所有b細(xì)胞系，包含前b細(xì)胞、祖b細(xì)胞、早期原b細(xì)胞、晚期原b細(xì)胞、大前b細(xì)胞、小前b細(xì)胞、未成熟b細(xì)胞、成熟b細(xì)胞、血漿b細(xì)胞、記憶b細(xì)胞、b-1細(xì)胞、b-2細(xì)胞和無能an1/t3細(xì)胞群。如本文使用，術(shù)語t細(xì)胞包含幼稚t細(xì)胞、cd4+t細(xì)胞、cd8+t細(xì)胞、記憶t細(xì)胞、活化t細(xì)胞、無能t細(xì)胞、耐受t細(xì)胞、嵌合b細(xì)胞和抗原特異性t細(xì)胞。作為非限制性實(shí)例，術(shù)語“b細(xì)胞(bcell/bcells)”是指前b細(xì)胞、祖b細(xì)胞、早期原b細(xì)胞、晚期原b細(xì)胞、大前b細(xì)胞、小前b細(xì)胞、未成熟b細(xì)胞、成熟b細(xì)胞、幼稚b細(xì)胞、血漿b細(xì)胞、活化b細(xì)胞、無能b細(xì)胞、耐受b細(xì)胞、嵌合b細(xì)胞、抗原特異性b細(xì)胞、記憶b細(xì)胞、b-1細(xì)胞、b-2細(xì)胞和無能an1/t3細(xì)胞群。在一些實(shí)施例中，術(shù)語b細(xì)胞包含在其細(xì)胞表面上表達(dá)免疫球蛋白重鏈和/或輕鏈的b細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，術(shù)語b細(xì)胞包含表達(dá)和分泌免疫球蛋白重鏈和/或輕鏈的b細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，術(shù)語b細(xì)胞包含在其細(xì)胞表面上結(jié)合抗原的細(xì)胞。在本文公開的一些實(shí)施例中，b細(xì)胞或an1/t3細(xì)胞用于所述工藝中。在某些實(shí)施例中，此些細(xì)胞任選地被適于表達(dá)、能夠表達(dá)(例如，可誘導(dǎo)表達(dá))或能夠分化成適于表達(dá)抗體的細(xì)胞的任何動物細(xì)胞取代，包含例如造血干細(xì)胞、幼稚b細(xì)胞、b細(xì)胞、前b細(xì)胞、祖b細(xì)胞、早期原b細(xì)胞、晚期原b細(xì)胞、大前b細(xì)胞、小前b細(xì)胞、未成熟b細(xì)胞、成熟b細(xì)胞、血漿b細(xì)胞、記憶b細(xì)胞、b-1細(xì)胞、b-2細(xì)胞、無能b細(xì)胞或無能an1/t3細(xì)胞。術(shù)語“myc”和“myc基因”是同義詞。它們是指編碼myc多肽的核酸序列。myc基因包括至少120個核苷酸的核苷酸序列，其與ncbi登錄號nm_002467.5的序列具有至少60％到100％的同一性或同源性，例如至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％或約70％到約100％的任何其它百分比的同一性。在一些實(shí)施例中，myc基因是原癌基因。在某些情況下，在8號染色體上8q24.21處發(fā)現(xiàn)myc基因。在某些情況下，myc基因起始于磷酸三酯酶相關(guān)蛋白(pter)的128,816,862bp處，終止于磷酸三酯酶相關(guān)蛋白的128,822,856bp處。在某些情況下，myc基因?yàn)榧s6kb。在某些情況下，myc基因編碼至少八個單獨(dú)的mrna序列——5個選擇性剪接變體和3個未剪接變體。術(shù)語“myc蛋白”、“myc多肽”和“myc序列”是同義詞，是指ncbi登錄號np_002458.2(下文提供)或uniprotkb/swiss-prot:p01106.1中公開的氨基酸殘基聚合物，其是人myc同種型2及其功能同源物、變體、類似物或片段。本序列如下所示。mdffrvvenqqppatmplnvsftnrnydldydsvqpyfycdeeenfyqqqqqselqppapsediwkkfellptpplspsrrsglcspsyvavtpfslrgdndggggsfstadqlemvtellggdmvnqsficdpddetfikniiiqdcmwsgfsaaaklvseklasyqaarkdsgspnparghsvcstsslylqdlsaaasecidpsvvfpyplndssspkscasqdssafspssdsllsstesspqgspeplvlheetppttssdseeeqedeeeidvvsvekrqapgkrsesgspsagghskpphsplvlkrchvsthqhnyaappstrkdypaakrvkldsvrvlrqisnnrkctsprssdteenvkrrthnvlerqrrnelkrsffalrdqipelennekapkvvilkkatayilsvqaeeqkliseedllrkrreqlkhkleqlrnsca(seqidno:2)在一些實(shí)施例中，myc多肽是完整myc多肽序列。在一些實(shí)施例中，myc多肽是部分myc多肽序列。在一些實(shí)施例中，myc多肽是c-myc。在一些實(shí)施例中，myc多肽序列包括如下所示的序列：mdffrvvenqqppatmplnvsftnrnydldydsvqpyfycdeeenfyqqqqqselqppapsediwkkfellptpplspsrrsglcspsyvavtpfslrgdndggggsfstadqlemvtellggdmvnqsficdpddetfikniiiqdcmwsgfsaaaklvseklasyqaarkdsgspnparghsvcstsslylqdlsaaasecidpsvvfpyplndssspkscasqdssafspssdsllsstesspqgspeplvlheetppttssdseeeqedeeeidvvsvekrqapgkrsesgspsagghskpphsplvlkrchvsthqhnyaappstrkdypaakrvkldsvrvlrqisnnrkctsprssdteenvkrrthnvlerqrrnelkrsffalrdqipelennekapkvvilkkatayilsvqaeeqkliseedllrkrreqlkhkleqlrkgelnskle(seqidno:3)。在一些實(shí)施例中，myc多肽序列包括如下所示的序列：plnvsftnrnydldydsvqpyfycdeeenfyqqqqqselqppapsediwkkfellptpplspsrrsglcspsyvavtpfslrgdndggggsfstadqlemvtellggdmvnqsficdpddetfikniiiqdcmwsgfsaaaklvseklasyqaarkdsgspnparghsvcstsslylqdlsaaasecidpsvvfpyplndssspkscasqdssafspssdsllsstesspqgspeplvlheetppttssdseeeqedeeeidvvsvekrqapgkrsesgspsagghskpphsplvlkrchvsthqhnyaappstrkdypaakrvkldsvrvlrqisnnrkctsprssdteenvkrrthnvlerqrrnelkrsffalrdqipelennekapkvvilkkatayilsvqaeeqkliseedllrkrreqlkhkleqlr(seqidno:4)。在一些實(shí)施例中，myc多肽序列包括來自非人物種的myc多肽序列。在一些實(shí)施例中，非人物種選自由以下組成的群組：猿、猴、小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠、兔、貓、狗、豬、綿羊、山羊、牛和馬物種。在一些實(shí)施例中，myc多肽序列包括如下所示的序列，其來自綠猴(綠猴)(xp_007999715.1)：mplnvsftnrnydldydsvqpyfycdeeenfyqqqqqselqppapsediwkkfellptpplspsrrsglcspsyvavtpfsprgdndggggsfstadqlemvtellggdmvnqsficdpddetfikniiiqdcmwsgfsaaaklvseklasyqaarkdsgspnparghsvcstsslylqdlsaaasecidpsvvfpyplndssspkscaspdssafspssdsllsstesspqaspeplvlheetppttssdseeeqedeeeidvvsvekrqapgkrsesgspsagghskpphsplvlkrchvsthqhnyaappstrkdypaakrvkldsvrvlrqisnnrkctsprssdteenvkrrthnvlerqrrnelkrsffalrdqipelennekapkvvilkkatayilsvqaeeqklisekdllrkrreqlkhkleqlrnsca在一些實(shí)施例中，myc多肽序列包括如下所示的序列：plnvsftnrnydldydsvqpyfycdeeenfyqqqqqselqppapsediwkkfellptpplspsrrsglcspsyvavtpfslrgdndggggsfstadqlemvtellggdmvnqsficdpddetfikniiiqdcmwsgfsaaaklvseklasyqaarkdsgspnparghsvcstsslylqdlsaaasecidpsvvfpyplndssspkscasqdssafspssdsllsstesspqaspeplvlheetppttssdseeeqedeeeidvvsvekrqapgkrsesgspsagghskpphsplvlkrchvsthqhnyaappstrkdypaakrvkldsvrvlrqisnnrkctsprssdteenvkrrthnvlerqrrnelkrsffalrdqipelennekapkvvilkkatayilsvqaeeqklisekdllrkrreqlkhkleqlr(seqidno:9)。在一些實(shí)施例中，myc多肽包括氨基酸序列，其與ncbi登錄號np002458.2(seqidno:2)的序列具有至少40％到100％的同一性，例如至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、90％、91％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或約40％到約100％的任何其它百分比的同一性。在一些實(shí)施例中，myc多肽是指np002458.2(seqidno:2)的420個、421個、422個、423個、424個、425個、426個、427個、428個、429個、430個、431個、432個、433個、434個、435個、436個、437個、438個、439個、440個、441個、442個、443個、444個、445個、446個、447個、448個、449個、450個、451個、452個、453個、454個連續(xù)氨基酸的聚合物。在一些實(shí)施例中，myc多肽是指未經(jīng)歷任何翻譯后修飾的np002458.2(seqidno:2)的435個氨基酸的聚合物。在一些實(shí)施例中，myc多肽是指經(jīng)歷翻譯后修飾的np002458.2(seqidno:2)的435個氨基酸的聚合物。在一些實(shí)施例中，myc多肽是48,804kda。在一些實(shí)施例中，myc多肽含有堿性螺旋-環(huán)-螺旋亮氨酸拉鏈(bhlh/lz)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，bhlh/lz結(jié)構(gòu)域包括序列elkrsffalrdqipelennekapkvvilkkatayilsvqaeeqkliseedllrkrreqlkhkleqlr(seqidno:5)。在一些實(shí)施例中，myc多肽是轉(zhuǎn)錄因子(例如，轉(zhuǎn)錄因子64)。在一些實(shí)施例中，myc多肽含有e-boxdna結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，myc多肽結(jié)合到包括cacgtg的序列。在一些實(shí)施例中，myc多肽促進(jìn)細(xì)胞存活和/或增殖中的一或多種。在一些實(shí)施例中，myc多肽包含上述那些中的一或多種，并且包含一或多種翻譯后修飾(例如，乙?；?。在一些實(shí)施例中，myc多肽在多肽的n-末端或c-末端包括一或多個另外的氨基酸殘基。在一些實(shí)施例中，myc多肽是融合蛋白。在一些實(shí)施例中，myc多肽與多肽的n-末端或c-末端處的一或多個另外的肽連接。適用于本文所述方法的蛋白質(zhì)還包含功能變體，包含相較于本文所述的任何蛋白質(zhì)具有1到15個氨基酸變化(例如，1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個或15個氨基酸取代、缺失或添加)的蛋白質(zhì)。在其它實(shí)施例中，改變的氨基酸序列與本文所述的任何蛋白質(zhì)抑調(diào)配物的氨基酸序列具有至少75％的同一性，例如75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性。此些序列變體蛋白適用于本文所述的方法，只要改變的氨基酸序列保留足夠的生物活性以在本文所述的組合物和方法中起作用。在進(jìn)行氨基酸取代的情況下，取代可以是保守氨基酸取代。例如，在常見的天然存在的氨基酸中，“保守氨基酸取代”通過以下各個群組內(nèi)的氨基酸之間的取代來說明：(1)甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸，(2)苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸，(3)絲氨酸和蘇氨酸，(4)天冬氨酸和谷氨酸，(5)谷氨酰胺和天冬酰胺，和(6)賴氨酸、精氨酸和組氨酸。blosum62表是從蛋白質(zhì)序列節(jié)段的約2,000個局部多重比對得到的氨基酸取代矩陣，表示超過500個群組的相關(guān)蛋白質(zhì)的高度保守區(qū)域(亨尼科夫(henikoff)等人，(1992年)，美國國家科學(xué)院學(xué)報(proc.natlacad.sci.usa)，89:10915-10919)。因此，使用blosum62取代頻率來限定保守氨基酸取代，其在一些實(shí)施例中被引入本文描述或公開的氨基酸序列中。盡管可以僅基于化學(xué)性質(zhì)設(shè)計氨基酸取代(如上所討論)，但語言“保守氨基酸取代”優(yōu)選地是指由大于-1的blosum62值表示的取代。例如，如果取代的特征在于blosum62值為0、1、2或3，則氨基酸取代是保守的。根據(jù)本體系，優(yōu)選的保守氨基酸取代的特征在于blosum62值為至少1(例如，1、2或3)，而更優(yōu)選的保守氨基酸取代的特征在于blosum62值為至少2(例如，2或3)。短語“e-box序列”和“增強(qiáng)子盒序列”在本文中可互換使用，并且是指核苷酸序列canntg，其中n是任何核苷酸。在某些情況下，e-box序列包括cacgtg。在某些情況下，由myc編碼的轉(zhuǎn)錄因子的堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域與e-box序列結(jié)合。在某些情況下，e-box序列位于基因的上游(例如，p21，bc1-2或鳥氨酸脫羧酶)。在某些情況下，myc多肽含有e-boxdna結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在某些情況下，e-boxdna結(jié)合結(jié)構(gòu)域包括序列krrthnvlerqrrn(seqidno:6)。在某些情況下，由myc編碼的轉(zhuǎn)錄因子與e-box序列的結(jié)合允許rna聚合酶轉(zhuǎn)錄e-box序列下游的基因。術(shù)語“myc活性”或“myc生物活性”或“生物活性myc”包含增強(qiáng)或誘導(dǎo)細(xì)胞存活、細(xì)胞增殖和/或抗體產(chǎn)生中的一或多種。作為實(shí)例而非限制，myc活性包含增強(qiáng)抗cd3和抗cd28活化的t細(xì)胞的擴(kuò)增和/或增加長期自我更新的造血干細(xì)胞的增殖。myc活性還包含進(jìn)入細(xì)胞核、結(jié)合到核酸序列(例如，結(jié)合e-box序列)和/或誘導(dǎo)myc靶基因的表達(dá)。術(shù)語“患者”、“受試者”、“個體”等在本文中可互換使用，并且是指動物，通常是哺乳動物。在一個優(yōu)選實(shí)施例中，患者、受試者或個體是哺乳動物。在一個特別優(yōu)選實(shí)施例中，患者、受試者或個體是人。術(shù)語“蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(ptd)”或“轉(zhuǎn)運(yùn)子肽序列”(也被稱為細(xì)胞滲透蛋白(cpp)或膜轉(zhuǎn)位序列(mts))在本文中可互換使用，是指能夠不依賴于經(jīng)典內(nèi)吞作用將更大的分子運(yùn)送到細(xì)胞中的小肽。在一些實(shí)施例中，可以在蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)核定位信號，其介導(dǎo)分子進(jìn)一步轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核中。本文使用的術(shù)語“治療(treating/treatment)”涉及受試者(例如，人)中的疾病的治療，并且包含：(i)抑制疾病，即阻止其發(fā)展；(ii)緩解疾病，即導(dǎo)致疾病消退；(iii)減緩疾病的進(jìn)展；和/或(iv)抑制、緩解或減緩疾病的一或多種癥狀的進(jìn)展。還應(yīng)當(dāng)理解，所描述的各種治療或預(yù)防醫(yī)學(xué)疾病和病狀的方式旨在表示“大體上的”，其包含總治療或預(yù)防，但也包含少于總治療或預(yù)防，并且其中實(shí)現(xiàn)了一些生物學(xué)或醫(yī)學(xué)相關(guān)結(jié)果。治療可以是對慢性疾病的持續(xù)延長治療，或者是用于治療急性病狀的單次或幾次施用。本文使用的術(shù)語“治療性”是指治療和/或預(yù)防。通過遏制、緩和或根除疾病狀態(tài)獲得治療性效果。ii.包括納米顆粒myc肽的組合物本文公開了包括被配制成生物活性穩(wěn)定納米顆粒的含myc多肽的組合物以及制造和使用所述組合物的方法。在一些實(shí)施例中，含myc多肽是myc多肽和蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的融合物，例如hivtat。在一些實(shí)施例中，myc融合多肽還包含一或多種標(biāo)簽序列。在一些實(shí)施例中，myc融合多肽包括seqidno:1。在一些實(shí)施例中，myc融合多肽包括seqidno:10。如下文更詳細(xì)討論并如實(shí)例中所示，本技術(shù)的生物活性含myc多肽組合物在一些實(shí)施例中包含約90-140nm的納米顆粒，分子質(zhì)量為約104-106道爾頓。在一些實(shí)施例中，顆粒包含約200個含myc多肽的分子。在一些實(shí)施例中，生物活性納米微粒組合物包含翻譯后修飾的myc蛋白。作為實(shí)例但不作為限制，在一些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)包含至少一個乙酰基。a.含myc多肽的表達(dá)和純化本文提供了用于產(chǎn)生用于提供的納米顆粒組合物的含myc多肽的方法。在本發(fā)明的方法中，含myc多肽通過微生物發(fā)酵重組產(chǎn)生。在一些實(shí)施例中，微生物發(fā)酵在約1到約10,000升的發(fā)酵體積(例如，約10到約1000升的發(fā)酵體積)中進(jìn)行。發(fā)酵可以利用任何合適的微生物宿主細(xì)胞和培養(yǎng)基。在示例性實(shí)施例中，大腸桿菌用作微生物宿主細(xì)胞。在替代實(shí)施例中，可以使用其它微生物，例如釀酒酵母、巴斯德畢赤酵母、乳酸桿菌、桿菌和曲霉菌。在一個示例性實(shí)施例中，微生物宿主細(xì)胞是bl-21startm大腸桿菌菌株(英杰公司(invitrogen))。在一個示例性實(shí)施例中，微生物宿主細(xì)胞是blrde3大腸桿菌菌株。在一些實(shí)施例中，修飾宿主細(xì)胞以提供稀有密碼子的trna，其用于克服宿主微生物細(xì)胞密碼子偏倚以改善表達(dá)的蛋白質(zhì)的翻譯。在示例性實(shí)施例中，用質(zhì)粒(例如，prare(camr))轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞(例如，大腸桿菌)，其表達(dá)agg、aga、aua、cua、ccc、gga密碼子的trna。另外，用于提供特定密碼子的trna的合適的質(zhì)?；驑?gòu)建體是本領(lǐng)域已知的，并且可以用于所提供的方法中。整合或自我復(fù)制載體可以用于將含myc多肽表達(dá)盒引入所選宿主細(xì)胞中的目的。在表達(dá)盒中，含myc多肽的編碼序列與啟動子(例如，誘導(dǎo)型啟動子)可操作地連接。誘導(dǎo)型啟動子是響應(yīng)于培養(yǎng)條件的一些變化(例如，存在或不存在營養(yǎng)物或溫度的變化)在其控制下啟動dna轉(zhuǎn)錄水平的增加的啟動子。在一些實(shí)施例中，編碼含myc多肽的核酸經(jīng)密碼子優(yōu)化用于細(xì)菌表達(dá)。被各種潛在宿主細(xì)胞識別的示例性啟動子是眾所周知的。這些啟動子可以通過以下來與含myc多肽編碼dna可操作地連接：通過限制酶消化從源dna去除啟動子(如果存在)并將分離的啟動子序列插入載體中。適合與微生物宿主一起使用的啟動子包含但不限于β-內(nèi)酰胺酶和乳糖啟動子系統(tǒng)(常(chang)等人，(1978年)，自然(nature)，275:617-624；戈德爾(goeddel)等人，(1979年)，自然(nature)，281:544)、堿性磷酸酶、色氨酸(trp)啟動子系統(tǒng)(戈德爾(1980年)核酸研究(nucleicacidsres.)，8:4057；ep36,776)、和雜合啟動子，例如tac啟動子(德波爾(deboer)等人，(1983年)，美國國家科學(xué)院學(xué)報(proc.natl.acad.sci.usa)，80:21-25)?？梢允褂眠m合由選擇宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)的任何啟動子。公布了合適的核苷酸序列，從而使技術(shù)人員能夠使用連接子或適配子提供任何所需的限制位點(diǎn)來可操作地將它們與編碼含myc多肽的dna連接(參見例如西貝內(nèi)特(siebenlist)等人，(1980年)，細(xì)胞(cell)20:269)。在示例性實(shí)施例中，用于細(xì)菌系統(tǒng)的啟動子可以含有與編碼序列可操作連接到編碼序列的塞恩-達(dá)爾加默(shine-dalgarno)(s.d.)序列。在一些實(shí)施例中，誘導(dǎo)型啟動子是lacz啟動子，其用異丙基β-d-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(iptg)誘導(dǎo)，如本領(lǐng)域所熟知。啟動子和表達(dá)盒也可以使用眾所周知的合成目標(biāo)dna序列的技術(shù)從頭合成。在一個示例性實(shí)施例中，在本文中用于表達(dá)含myc多肽的表達(dá)載體是pet101/d-topo(invitrogen)。為了表達(dá)含myc多肽，含有編碼含myc多肽的表達(dá)載體的微生物宿主通常在發(fā)酵反應(yīng)器中生長至高密度。在一些實(shí)施例中，反應(yīng)器具有受控的葡萄糖進(jìn)料。在一些實(shí)施例中，首先在補(bǔ)充有抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)發(fā)酵罐接種物(例如，過夜培養(yǎng))。然后使用發(fā)酵罐接種物來接種發(fā)酵罐培養(yǎng)物以表達(dá)蛋白質(zhì)。在發(fā)酵罐培養(yǎng)物的od600為至少約15(通常至少約20、至少25、至少約30或更高)處，誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)。在示例性實(shí)施例中，其中誘導(dǎo)型啟動子是lacz啟動子，將iptg加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中以誘導(dǎo)含myc多肽的表達(dá)。通常，在od600表示對數(shù)生長期處，將iptg加入到發(fā)酵罐培養(yǎng)物中。在所提供的方法的某些實(shí)施例中，誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)表達(dá)在誘導(dǎo)后維持大致約2到大致約5小時，并且可以是大致約2到大致約3小時的誘導(dǎo)后表達(dá)。由于重組蛋白的降解，可能不期望更長的誘導(dǎo)期。誘導(dǎo)期間反應(yīng)混合物的溫度優(yōu)選為約28℃到約37℃，通常為約30℃到約37℃。在特定實(shí)施例中，誘導(dǎo)在約37℃下。含myc多肽通常在微生物細(xì)胞中被表達(dá)為胞質(zhì)包涵體。為了收獲包涵體，在誘導(dǎo)后通過離心發(fā)酵培養(yǎng)物收集細(xì)胞團(tuán)塊，在-70℃或更低溫度下冷凍，解凍并重懸于破碎緩沖液中。通過常規(guī)方法(例如，超聲處理、均質(zhì)化等)裂解細(xì)胞。然后將裂解物重懸于增溶緩沖液中，通常在存在有效增溶蛋白質(zhì)的濃度(例如，約5m、6m、7m、8m、9m或更高)的尿素的條件下。重懸可能需要機(jī)械地將團(tuán)塊破碎并攪拌以實(shí)現(xiàn)均質(zhì)性。在一些實(shí)施例中，將細(xì)胞團(tuán)塊直接重懸于尿素緩沖液中并混合至均質(zhì)。在一些實(shí)施例中，重懸/增溶緩沖液是8m尿素、50mm磷酸鹽ph7.5，并使混懸液通過均質(zhì)器。在一些實(shí)施例中，均質(zhì)的混懸液是磺酰化的。例如，在一些實(shí)施例中，將均質(zhì)的混懸液調(diào)節(jié)至包含200mm亞硫酸鈉和10mm連四硫酸鈉。然后將溶液在室溫下混合至均質(zhì)。然后將混合的裂解物再混合一段時間以完成磺酰化(例如，在2-8℃下≥12小時)。然后將磺?；牧呀馕镫x心一小時。然后通過離心收集含有磺?；琺yc多肽的上清液，棄去細(xì)胞團(tuán)塊。然后將上清液通過過濾器，例如0.22μm膜過濾器以澄清裂解物。然后純化增溶的蛋白質(zhì)。純化方法可以包含親和色譜、反相色譜、凝膠排阻色譜等。在一些實(shí)施例中，使用親和色譜。例如，使蛋白質(zhì)具有表位標(biāo)簽或組氨酸6標(biāo)簽，以便于純化。在本方法中，示例性含myc多肽包括組氨酸6標(biāo)簽，用于使用ni-樹脂利用ni親和色譜進(jìn)行純化。在示例性實(shí)施例中，ni-樹脂柱在含有尿素的緩沖液中平衡。在一些實(shí)施例中，平衡緩沖液是6m尿素、50mm磷酸鹽、500mmnacl和10％甘油溶液。然后將包括含myc多肽的磺酰化和澄清上清液上樣到ni-樹脂柱上。然后用洗滌緩沖液(例如，6m尿素、50mm磷酸鹽、10％甘油、500mmnacl，ph7.5)洗滌柱。然后用鹽濃度遞減的連續(xù)洗滌緩沖液洗滌柱。例如，示例性的后續(xù)洗滌可以包括6m尿素、50mm磷酸鹽、10％甘油和2mnacl，ph7.5，接著是6m尿素、50mm磷酸鹽、10％甘油、50mmnacl和30mm咪唑，ph7.5的另一次洗滌。在連續(xù)施加洗滌緩沖液后，通過加入洗脫緩沖液(例如，6m尿素、50mm磷酸鹽、10％甘油和50mmnacl，ph7.5，具有梯度為100到300mm的咪唑)并收集級分來從柱洗脫含myc多肽。然后將待合并的含蛋白質(zhì)級分通過0.22μm膜過濾。蛋白質(zhì)得率的評估可以使用任何合適的方法測量，例如在uv波長280下的分光光度法。在一些實(shí)施例中，可以使用一或多種另外的純化方法來進(jìn)一步純化分離的含myc多肽。在示例性實(shí)施例中，來自ni-瓊脂糖凝膠色譜步驟的合并級分使用q-瓊脂糖凝膠樹脂通過陰離子交換色譜進(jìn)一步純化。在一些實(shí)施例中，通過用來自ni瓊脂糖凝膠色譜步驟的第二洗滌緩沖液(例如，6m尿素、50mm磷酸鹽、10％甘油、2mnacl，ph7.5)將樣品稀釋至q瓊脂糖凝膠緩沖液的電導(dǎo)率(17.52+/-1ms/cm)來制備合并物(pool)，以用于上樣到q-瓊脂糖凝膠柱上。然后將稀釋的合并物上樣到q-瓊脂糖凝膠柱上，接著使用追加緩沖液(例如，6m尿素、50mm磷酸鹽、300mmnacl和10％甘油)進(jìn)行兩個追加步驟，其中進(jìn)一步連續(xù)施加追加緩沖液直至uv跡線達(dá)到基線，表明蛋白質(zhì)已從柱洗脫。(以下稱“段落a”)b.將含myc多肽重折疊成納米顆粒本技術(shù)的組合物可以根據(jù)以下方法由分離的含myc多肽制備。(以下稱“段落b”)在一些實(shí)施例中，含myc多肽被重折疊以產(chǎn)生生物活性納米顆粒。在一些實(shí)施例中，所述方法包括切向流過濾(tff)或交叉流過濾。tff是一種使用泵使樣品跨容納在多層結(jié)構(gòu)(盒)中的膜的表面(即，與膜表面“相切”)循環(huán)的工藝。施加的跨膜壓力作為將溶質(zhì)和小分子轉(zhuǎn)運(yùn)通過膜的驅(qū)動力。膜表面上的液體交叉流動從表面掃除保留分子，使它們保持在循環(huán)流中。(以下稱“段落c”)在一些實(shí)施例中，含myc多肽用變性劑(例如，尿素)變性。然后使用跨超濾/滲濾(ufdf)膜的多個tff步驟并連續(xù)加入具有遞減濃度的變性劑(例如，尿素)的重折疊緩沖液來重折疊含myc多肽。在一些實(shí)施例中，連續(xù)重折疊緩沖液的尿素濃度從約3m尿素降至<0.001m或無尿素。在一些實(shí)施例中，連續(xù)重折疊緩沖液包括磷酸鹽、nacl、甘油、gsh(還原型谷胱甘肽)和gssg(氧化型谷胱甘肽))。在一些實(shí)施例中，重折疊緩沖液包括約50mm磷酸鹽。在一些實(shí)施例中，重折疊緩沖液包括堿土金屬鹽。在一些實(shí)施例中，堿土金屬鹽是鈉(na)、鋰(li)或鉀(k)鹽。在一些實(shí)施例中，重折疊緩沖液包括鈉鹽，例如nacl。在一些實(shí)施例中，重折疊緩沖液包括約100mm到2m濃度的堿土金屬鹽。在一些實(shí)施例中，重折疊緩沖液包括約200mm到1m濃度的堿土金屬鹽。在一些實(shí)施例中，重折疊緩沖液包括約500mm到1m濃度的堿土金屬鹽。在一些實(shí)施例中，重折疊緩沖液包括約100mm到2m濃度的nacl。在一些實(shí)施例中，重折疊緩沖液包括約200mm到1m濃度的nacl。在一些實(shí)施例中，重折疊緩沖液包括約200mm到800mm濃度的nacl。在特定實(shí)施例中，重折疊緩沖液包括約200-500mmnacl。在一些實(shí)施例中，重折疊緩沖液包括約500mmnacl。在一些實(shí)施例中，重折疊緩沖液的同滲容摩介于約300mosm和1000mosm之間。在一些實(shí)施例中，重折疊緩沖液包括約1到20％的甘油。在一些實(shí)施例中，重折疊緩沖液包括約10％甘油。在一些實(shí)施例中，重折疊緩沖液包括約0.1到50mmgsh(還原型谷胱甘肽)。在一些實(shí)施例中，重折疊緩沖液包括約5mmgsh(還原型谷胱甘肽)。在一些實(shí)施例中，重折疊緩沖液包括約0.1到50mmgssg(氧化型谷胱甘肽))。在一些實(shí)施例中，重折疊緩沖液包括約1mmgssg(氧化型谷胱甘肽))。在示例性實(shí)施例中，重折疊緩沖液包括50mm磷酸鹽、500mmnacl、10％甘油、5mmgsh(還原型谷胱甘肽)和1mmgssg(氧化型谷胱甘肽))。在一些實(shí)施例中，重折疊緩沖液的ph值介于約5.0和8.0之間。在一些實(shí)施例中，重折疊緩沖液的ph值為7.5。在一個示例性實(shí)施例中，使用跨超濾/滲濾(ufdf)膜的三個ttf步驟來重折疊含myc多肽。在一個示例性實(shí)施例中，第一重折疊步驟涉及在整個約120分鐘的過程中更換重折疊緩沖液1(例如，3m尿素、50mm磷酸鹽、500mmnacl、10％甘油、5mmgsh(還原型谷胱甘肽)、1mmgssg(氧化型谷胱甘肽))。在一些實(shí)施例中，第二重折疊步驟涉及在大約120分鐘的過程中更換重折疊緩沖液2(1.5m尿素、50mm磷酸鹽、500mmnacl、10％甘油、5mmgsh(還原型谷胱甘肽)、1mmgssg(氧化型谷胱甘肽))，然后是約120分鐘的再循環(huán)。在一些實(shí)施例中，第三重折疊步驟涉及在大約120分鐘的過程中更換重折疊緩沖液3(50mm磷酸鹽、500mmnacl、10％甘油、5mmgsh(還原型谷胱甘肽)、1mmgssg(氧化型谷胱甘肽))，然后是12小時的再循環(huán)。在最終重折疊步驟完成后，可以通過0.2μm膜過濾最終重折疊溶液，并調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)濃度。在重折疊之后，納米顆粒調(diào)配物含有具有寬范圍尺寸和穩(wěn)定性的納米顆粒。因此，在一些實(shí)施例中，在第三重折疊步驟之后進(jìn)行溫育步驟或平衡步驟。例如，在一些實(shí)施例中，將重折疊的含myc多肽保持在第三重折疊緩沖液中一段時間，所述時間足以產(chǎn)生數(shù)均直徑介于約80nm和約150nm之間的生物活性納米顆粒。不受理論束縛，據(jù)信平衡步驟允許納米顆粒調(diào)配物平衡成具有更窄尺寸范圍和更多穩(wěn)定性的穩(wěn)定納米顆粒。在一些實(shí)施例中，這些穩(wěn)定的納米顆粒的數(shù)均直徑介于約80nm和約150nm之間。在一些實(shí)施例中，平衡步驟進(jìn)行至少5、6、7、8、9、10、11或12小時或更長的時間長度。在示例性實(shí)施例中，平衡步驟進(jìn)行至少或約10-12小時。在示例性實(shí)施例中，平衡步驟涉及在第三重折疊緩沖液中輕柔地攪拌重折疊的含myc多肽的納米顆粒調(diào)配物。在示例性實(shí)施例中，平衡步驟涉及以小于1000rpm的速度在第三重折疊緩沖液中攪拌含myc多肽的調(diào)配物。在一些實(shí)施例中，進(jìn)行最終重折疊緩沖液3的另外的更換以將重折疊緩沖液更換為適于施用的調(diào)配物緩沖液(例如，適于注射的緩沖液)。在示例性實(shí)施例中，針對合適的調(diào)配物緩沖液透析重折疊緩沖液3中的重折疊的tat-myc。在示例性實(shí)施例中，使用跨超濾/滲濾(ufdf)膜的tff透析重折疊緩沖液3中的重折疊的tat-myc。在示例性實(shí)施例中，調(diào)配物緩沖劑包括緩沖劑。在示例性實(shí)施例中，緩沖劑選自磷酸鈉、磷酸鉀、組氨酸和檸檬酸鹽。在示例性實(shí)施例中，重折疊的tat-myc在ph值介于5.5和8.0之間的調(diào)配物中是穩(wěn)定的。在示例性實(shí)施例中，重折疊的tat-myc在ph值介于6.0和8.0之間的調(diào)配物中是穩(wěn)定的。在示例性實(shí)施例中，重折疊的tat-myc在ph值為約6.0、約6.5、約7.0、約7.5或約8.0的調(diào)配物中是穩(wěn)定的。在示例性實(shí)施例中，重折疊的tat-myc在ph值為約ph7.5的調(diào)配物中是穩(wěn)定的。在示例性實(shí)施例中，重折疊的tat-myc在約ph7.5+/-ph0.3的調(diào)配物中是穩(wěn)定的。在示例性實(shí)施例中，重折疊的tat-myc在同滲容摩大于300mosm的調(diào)配物中是穩(wěn)定的。在示例性實(shí)施例中，重折疊的tat-myc在同滲容摩大于400mosm的調(diào)配物中是穩(wěn)定的。在示例性實(shí)施例中，重折疊的tat-myc在同滲容摩介于300mosm和1000mosm之間(例如，介于400mosm和800mosm之間)的調(diào)配物中是穩(wěn)定的。在示例性實(shí)施例中，重折疊的tat-myc在包括大于100mmnacl的調(diào)配物中是穩(wěn)定的。在示例性實(shí)施例中，重折疊的tat-myc在包括大于150mmnacl的調(diào)配物中是穩(wěn)定的。在示例性實(shí)施例中，重折疊的tat-myc調(diào)配物的nacl濃度為約150mm、200mm、250mm、300mm、350mm、400mm、450mm、500mm或550mmnacl。在示例性實(shí)施例中，重折疊的tat-myc調(diào)配物的nacl濃度為約500mm+/-50mmnacl。在一些實(shí)施例中，重折疊的tat-myc可以儲存至約1.2mg/ml的濃度。如本文使用，關(guān)于儲存條件的“穩(wěn)定性”是指相較于在儲存之前的重折疊的tat-myc的myc生物活性，重折疊的tat-myc在儲存之后保留至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的其myc生物活性的能力。在一些實(shí)施例中，重折疊的tat-myc在-80℃下穩(wěn)定長達(dá)2年。在一些實(shí)施例中，一旦解凍，重折疊的tat-myc在4℃下儲存長達(dá)1個月時是穩(wěn)定的。在示例性實(shí)施例中，一旦解凍，重折疊的tat-myc在4℃下儲存長達(dá)2個月時是穩(wěn)定的。在示例性實(shí)施例中，一旦解凍，重折疊的tat-myc在4℃下儲存長達(dá)3個月時是穩(wěn)定的。在示例性實(shí)施例中，一旦解凍，重折疊的tat-myc在4℃下儲存長達(dá)4個月時是穩(wěn)定的。在示例性實(shí)施例中，一旦解凍，重折疊的tat-myc在4℃下儲存長達(dá)5個月時是穩(wěn)定的。在示例性實(shí)施例中，一旦解凍，重折疊的tat-myc在4℃下儲存長達(dá)6個月或更長時是穩(wěn)定的。在示例性實(shí)施例中，一旦解凍，重折疊的tat-myc在4℃下儲存長達(dá)100天或更長時是穩(wěn)定的。因此，與野生型myc多肽的穩(wěn)定性相比，本文提供的重折疊的tat-myc的穩(wěn)定性顯著增加，所述野生型myc多肽具有大約34分鐘的半衰期(卡普丁(kaptein)等人(1996年)，jbc，271,18875-18884)。c.納米顆粒尺寸本技術(shù)的納米顆粒的尺寸和質(zhì)量可以通過本領(lǐng)域熟知的方法確定。作為實(shí)例而非限制，此些方法包含尺寸排阻色譜、高效液相色譜、動態(tài)光散射、納米顆粒跟蹤分析和電子顯微鏡檢查。在一些實(shí)施例中，調(diào)配物中納米顆粒的平均粒度介于約70nm和約140nm之間，例如介于70nm和140nm之間。在一些實(shí)施例中，調(diào)配物中納米顆粒的平均粒度介于約80nm和約120nm之間，例如介于80nm和120nm之間。在一些實(shí)施例中，調(diào)配物中納米顆粒的平均粒度介于約80nm和約110nm之間，例如介于80nm和110nm之間。在一些實(shí)施例中，調(diào)配物中納米顆粒的平均粒度介于約80nm和約90nm之間，例如介于80nm和90nm之間。在一些實(shí)施例中，調(diào)配物中納米顆粒的平均粒度為約84nm或84nm。在一些實(shí)施例中，調(diào)配物中納米顆粒的平均粒度介于約100nm和約120nm之間，例如介于100nm和120nm之間。在一些實(shí)施例中，調(diào)配物中納米顆粒的平均粒度為約111nm或111nm。在一些實(shí)施例中，調(diào)配物中顆粒的平均分子量為約103-107道爾頓，例如103-107道爾頓。在一些實(shí)施例中，調(diào)配物中顆粒的平均分子量為約104-107道爾頓，例如104-107道爾頓。在一些實(shí)施例中，調(diào)配物中顆粒的平均分子量為約105-107道爾頓，例如105-107道爾頓。在一些實(shí)施例中，調(diào)配物中顆粒的平均分子量為約106-107道爾頓，例如106-107道爾頓。在一些實(shí)施例中，調(diào)配物中顆粒的平均分子量為約2x106或2x106道爾頓。在一些實(shí)施例中，組合物中小于約0.01％或小于0.01％的納米顆粒具有大于200nm、大于300nm、大于400nm、大于500nm、大于600nm、大于700nm或大于800nm的粒度。在一些實(shí)施例中，組合物中小于約0.001％的納米顆粒具有大于200nm、大于300nm、大于400nm、大于500nm、大于600nm、大于700nm或大于800nm的粒度。在一些實(shí)施例中，組合物中小于約0.01％或小于0.01％的納米顆粒具有大于800nm的粒度。在一些實(shí)施例中，組合物中小于約0.001％或小于0.001％的納米顆粒具有大于800nm的粒度。在一些實(shí)施例中，調(diào)配物中小于約0.01％或小于0.01％的納米顆粒具有小于80nm、小于70nm、小于60nm、小于50nm、小于40nm、小于30nm、小于20nm或小于10nm的粒度。在一些實(shí)施例中，組合物中小于約0.001％或小于0.001％的納米顆粒具有小于80nm、小于70nm、小于60nm、小于50nm、小于40nm、小于30nm、小于20nm或小于10nm的粒度。在一些實(shí)施例中，組合物中小于約0.01％或小于0.01％的納米顆粒具有小于50nm的粒度。在一些實(shí)施例中，組合物中小于約0.001％或小于0.001％的納米顆粒具有小于50nm的粒度。d.myc融合蛋白在一些實(shí)施例中，含myc多肽的生物活性納米微粒組合物包括myc融合蛋白。在一些實(shí)施例中，myc融合蛋白包括蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、促進(jìn)細(xì)胞存活或增殖中的一或多種的myc多肽、和任選的蛋白質(zhì)標(biāo)簽結(jié)構(gòu)域，例如有助于融合蛋白純化的一或多種氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，與myc多肽(例如，本技術(shù)的納米顆粒調(diào)配物)接觸的細(xì)胞表現(xiàn)出增加的存活時間(例如，相較于未與myc接觸的相同類型的相同或相似的細(xì)胞)，和/或或增加的增殖(例如，相較于未與myc接觸的相同類型的相同或相似的細(xì)胞)。在一些實(shí)施例中，融合蛋白包括(a)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；(b)myc多肽序列。在一些實(shí)施例中，融合肽是式(i)的肽：蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域-myc多肽序列。在一些實(shí)施例中，本文公開的融合肽包括(a)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；(b)myc多肽序列；(c)一或多個連接蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和myc多肽序列的分子。在一些實(shí)施例中，融合肽是式(ii)的肽：蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域-x-myc多肽序列，其中-x-是連接蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域和myc多肽序列的分子。在一些實(shí)施例中，-x-是至少一個氨基酸。在一些實(shí)施例中，本文公開的融合肽包括(a)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；(b)myc多肽序列；(c)至少兩個蛋白質(zhì)標(biāo)簽；和(d)任選的連接子。在一些實(shí)施例中，融合肽是式(iii-vi)的肽：蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域-x-myc多肽序列-x-蛋白質(zhì)標(biāo)簽1-x-蛋白質(zhì)標(biāo)簽2(式(iii))，或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域-myc多肽序列-x-蛋白質(zhì)標(biāo)簽1-x-蛋白質(zhì)標(biāo)簽2(式(iv))，或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域-myc多肽序列-蛋白質(zhì)標(biāo)簽1-x-蛋白質(zhì)標(biāo)簽2(式(v))，或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域-myc多肽序列-蛋白質(zhì)標(biāo)簽1-蛋白質(zhì)標(biāo)簽2(式(vi))，其中-x-是連接子。在一些實(shí)施例中，-x-是一或多個氨基酸。在一些實(shí)施例中，本文公開的融合肽包括(a)蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域；(b)myc多肽序列；(c)6-組氨酸標(biāo)簽；(d)v5表位標(biāo)簽：和(e)任選的連接子。在一些實(shí)施例中，融合肽是式(vii-xiv)的肽：蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域-x-myc多肽序列-x-6-組氨酸標(biāo)簽-x-v5表位標(biāo)簽(式(vii))，或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域-myc多肽序列-x-6-組氨酸標(biāo)簽-x-v5表位標(biāo)簽(式(viii))，或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域-myc多肽序列-6-組氨酸標(biāo)簽-x-v5表位標(biāo)簽(式(ix))，或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域-myc多肽序列-6-組氨酸標(biāo)簽-v5表位標(biāo)簽(式(x))，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域-x-myc多肽序列-x-v5表位標(biāo)簽-x-6-組氨酸標(biāo)簽(式(xi))，或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域-myc多肽序列-x-v5表位標(biāo)簽-x-6-組氨酸標(biāo)簽(式(xii))，或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域-myc多肽序列-v5表位標(biāo)簽-x-6-組氨酸標(biāo)簽(式(xiii))，或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域-myc多肽序列-v5表位標(biāo)簽-6-組氨酸標(biāo)簽(式(xiv))，其中-x-是連接子。在一些實(shí)施例中，-x-是一或多個氨基酸。如上所述，在一些實(shí)施例中，myc融合蛋白包括一或多個連接子序列。連接子序列可以用于連接融合蛋白的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域、myc多肽序列、v5表位標(biāo)簽和/或6-組氨酸標(biāo)簽。在一些實(shí)施例中，連接子包括一或多個氨基酸。在一些實(shí)施例中，連接子的氨基酸序列包括kgelnskle(seqidno:11)。在一些實(shí)施例中，連接子包括氨基酸序列rtg。1.蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(ptd)在一些實(shí)施例中，myc融合蛋白包含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。肽轉(zhuǎn)運(yùn)提供了將小分子、蛋白質(zhì)或核酸跨細(xì)胞膜遞送到細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)區(qū)室的替代方案。一個非限制性實(shí)例和充分表征的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(ptd)是tat衍生肽。弗蘭克爾(frankel)等人(參見例如美國專利第5,804,604號、美國專利第5,747,641號、美國專利第5,674,980號、美國專利第5,670,617號和美國專利第5,652,122號)證明了通過將含有tat的氨基酸48-57的肽與貨物蛋白質(zhì)綴合來將貨物蛋白質(zhì)(β-半乳糖苷酶或辣根過氧化物酶)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中。在一些實(shí)施例中，tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括氨基酸序列mrkkrrqrrr(seqidno:7)。ptd的另一個非限制性實(shí)例是穿透蛋白(penetratin)。穿透蛋白可以跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)親水性大分子(德羅西(derossi)等人，細(xì)胞生物學(xué)趨勢(trendscellbiol.)，8:84–87(1998)，其通過引用整體并入本文)。穿透蛋白是16個氨基酸的肽，其對應(yīng)于觸角足(其是由培養(yǎng)物中的細(xì)胞內(nèi)化的果蠅轉(zhuǎn)錄因子)的同源域的氨基酸43-58。ptd的另一個非限制性實(shí)例是vp22。vp22是來自單純皰疹病毒1型(hsv-1)的皮層蛋白，具有跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)和核酸的能力(埃利奧特(elliot)等人，細(xì)胞(cell)，88:223–233,1997，其通過引用整體并入本文)。vp22的殘基267-300是必需的，但可能不足以進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)。因?yàn)樯形礃?biāo)識出負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)功能的區(qū)域，所以通常使用整個vp22蛋白來跨細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)貨物蛋白質(zhì)和核酸(施瓦策(schwarze)等人，藥理學(xué)趨勢(trendspharmacolsci)，21:45–48,2000)。在一些實(shí)施例中，myc融合多肽包含蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。作為實(shí)例而非限制，在一些實(shí)施例中，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括tat、穿透蛋白、vp22、vpr、eptd、r9、r15、vp16和觸角足中的一或多種的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括tat、穿透蛋白、vp22、vpr和eptd中的一或多種的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括tat、穿透蛋白、vp22、vpr、eptd、r9、r15、vp16和觸角足中的至少一種的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括合成蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(例如，聚精氨酸或ptd-5)。在特定實(shí)施例中，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域包括tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域與myc多肽共價連接。在一些實(shí)施例中，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域經(jīng)由肽鍵與myc多肽連接。在一些實(shí)施例中，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域經(jīng)由連接子序列與myc多肽連接。在一些實(shí)施例中，連接子包括短氨基酸序列。作為實(shí)例而非限制，在一些實(shí)施例中，連接子序列的長度為1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個氨基酸。本技術(shù)的myc融合蛋白可以以任何期望順序排列。例如，在一些實(shí)施例中，myc融合蛋白可以按以下順序排列：a)與myc多肽框內(nèi)連接的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，b)與v5結(jié)構(gòu)域框內(nèi)連接的myc多肽，和c)與6-組氨酸表位標(biāo)簽框內(nèi)連接的v5結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，myc融合蛋白具有以下順序的組分：a)與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域框內(nèi)連接的myc多肽，b)與v5結(jié)構(gòu)域框內(nèi)連接的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域，和c)與6-組氨酸表位標(biāo)簽框內(nèi)連接的v5結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，可以在每個序列之間包含另外的氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，可以在多肽序列的起始和/或末端處包含另外的氨基酸。在一些實(shí)施例中，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是tat[48-57]。在一些實(shí)施例中，蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域是tat[57-48]。2.蛋白質(zhì)標(biāo)簽結(jié)構(gòu)域在一些實(shí)施例中，myc融合蛋白包括蛋白質(zhì)標(biāo)簽結(jié)構(gòu)域，其包括有助于融合蛋白純化的一或多個氨基酸序列。在一些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)標(biāo)簽結(jié)構(gòu)域包括多組氨酸標(biāo)簽和表位標(biāo)簽中的一或多種。作為實(shí)例而非限制，示例性標(biāo)簽包含v5、組氨酸標(biāo)簽(例如，6-組氨酸標(biāo)簽)、ha(血凝素)標(biāo)簽、flag標(biāo)簽、cbp(鈣調(diào)蛋白結(jié)合肽)、cyd(共價但可解離的norpd肽)、strepll或hpc(蛋白c的重鏈)中的一或多種。在一些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)標(biāo)簽結(jié)構(gòu)域包括約10到20個氨基酸的長度。在一些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)標(biāo)簽結(jié)構(gòu)域包括2到40個氨基酸的長度，例如6-20個氨基酸的長度。在一些實(shí)施例中，以上列出的標(biāo)簽中的兩個(例如，v5和his-標(biāo)簽)一起使用以形成蛋白質(zhì)標(biāo)簽結(jié)構(gòu)域。在一些實(shí)施例中，組氨酸標(biāo)簽是6-組氨酸標(biāo)簽。在一些實(shí)施例中，組氨酸標(biāo)簽包括序列hhhhhh。在一些實(shí)施例中，本文公開的融合肽包括v5表位標(biāo)簽。在一些實(shí)施例中，v5標(biāo)簽包括氨基酸序列：gkpipnpllgldst。在一些實(shí)施例中，v5標(biāo)簽包括氨基酸序列ipnpllgld。可以通過任何合適的方法將蛋白質(zhì)標(biāo)簽加入到本文公開的融合蛋白中。作為實(shí)例而非限制，在一些實(shí)施例中，將tat-myc多肽序列克隆到編碼一或多種蛋白質(zhì)標(biāo)簽(例如，多his-標(biāo)簽和/或v5標(biāo)簽)的表達(dá)載體中。在一些實(shí)施例中，通過pcr加入多組氨酸標(biāo)簽和/或v5標(biāo)簽(即，pcr引物包括多組氨酸序列和/或v5序列)。c.myc融合肽的構(gòu)建本文公開的myc融合肽(例如，tat-myc融合肽)可以通過本領(lǐng)域熟知的方法構(gòu)建。作為實(shí)例而非限制，可以通過pcr生成編碼tat-myc融合肽的核苷酸序列。在一些實(shí)施例中，人myc序列的正向引物包括tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的框內(nèi)n-末端9-氨基酸序列(例如，rkkrrqrrr)。在一些實(shí)施例中，設(shè)計人myc序列的反向引物以去除終止密碼子。在一些實(shí)施例中，將pcr產(chǎn)物克隆到任何合適的表達(dá)載體中。在一些實(shí)施例中，表達(dá)載體包括多組氨酸標(biāo)簽和v5標(biāo)簽。在一些實(shí)施例中，本文公開的融合肽包括(a)tat和(b)c-myc。在一些實(shí)施例中，本文公開的融合肽包括(a)tat[48-57]和(b)c-myc。在一些實(shí)施例中，本文公開的融合肽包括(a)tat[57-48]和(b)c-myc。在一些實(shí)施例中，本文公開的融合肽包括(a)tat，(b)c-myc，(c)連接子，(d)v5標(biāo)簽和(e)6-組氨酸標(biāo)簽。在一些實(shí)施例中，本文公開的融合肽包括(a)tat[48-57]，(b)c-myc，(c)連接子，(d)v5標(biāo)簽和(e)6-組氨酸標(biāo)簽。在一些實(shí)施例中，本文公開的融合肽包括(a)tat[57-48]，(b)c-myc，(c)連接子，(d)v5標(biāo)簽和(e)6-組氨酸標(biāo)簽。在一些實(shí)施例中，myc融合肽的myc部分包括如本文所述的任何myc多肽。在一些實(shí)施例中，myc融合肽的myc部分包括myc多肽序列，所述myc多肽序列包括如下所示的序列：plnvsftnrnydldydsvqpyfycdeeenfyqqqqqselqppapsediwkkfellptpplspsrrsglcspsyvavtpfslrgdndggggsfstadqlemvtellggdmvnqsficdpddetfikniiiqdcmwsgfsaaaklvseklasyqaarkdsgspnparghsvcstsslylqdlsaaasecidpsvvfpyplndssspkscasqdssafspssdsllsstesspqgspeplvlheetppttssdseeeqedeeeidvvsvekrqapgkrsesgspsagghskpphsplvlkrchvsthqhnyaappstrkdypaakrvkldsvrvlrqisnnrkctsprssdteenvkrrthnvlerqrrnelkrsffalrdqipelennekapkvvilkkatayilsvqaeeqkliseedllrkrreqlkhkleqlr(seqidno:4)。在一些實(shí)施例中，myc融合肽包括seqidno:1。在一些實(shí)施例中，myc-融合肽是seqidno:1。mrkkrrqrrrplnvsftnrnydldydsvqpyfycdeeenfyqqqqqselqppapsediwkkfellptpplspsrrsglcspsyvavtpfslrgdndggggsfstadqlemvtellggdmvnqsficdpddetfikniiiqdcmwsgfsaaaklvseklasyqaarkdsgspnparghsvcstsslylqdlsaaasecidpsvvfpyplndssspkscasqdssafspssdsllsstesspqgspeplvlheetppttssdseeeqedeeeidvvsvekrqapgkrsesgspsagghskpphsplvlkrchvsthqhnyaappstrkdypaakrvkldsvrvlrqisnnrkctsprssdteenvkrrthnvlerqrrnelkrsffalrdqipelennekapkvvilkkatayilsvqaeeqkliseedllrkrreqlkhkleqlrkgelnsklegkpipnpllgldstrtghhhhhh(seqidno:1)。在一些實(shí)施例中，myc融合肽的myc部分包括myc多肽序列，所述myc多肽序列包括如下所示的序列：plnvsftnrnydldydsvqpyfycdeeenfyqqqqqselqppapsediwkkfellptpplspsrrsglcspsyvavtpfslrgdndggggsfstadqlemvtellggdmvnqsficdpddetfikniiiqdcmwsgfsaaaklvseklasyqaarkdsgspnparghsvcstsslylqdlsaaasecidpsvvfpyplndssspkscasqdssafspssdsllsstesspqaspeplvlheetppttssdseeeqedeeeidvvsvekrqapgkrsesgspsagghskpphsplvlkrchvsthqhnyaappstrkdypaakrvkldsvrvlrqisnnrkctsprssdteenvkrrthnvlerqrrnelkrsffalrdqipelennekapkvvilkkatayilsvqaeeqklisekdllrkrreqlkhkleqlr(seqidno:9)。在一些實(shí)施例中，myc融合肽包括seqidno:10；在一些實(shí)施例中，myc-融合肽是seqidno:10。mrkkrrqrrrplnvsftnrnydldydsvqpyfycdeeenfyqqqqqselqppapsediwkkfellptpplspsrrsglcspsyvavtpfslrgdndggggsfstadqlemvtellggdmvnqsficdpddetfikniiiqdcmwsgfsaaaklvseklasyqaarkdsgspnparghsvcstsslylqdlsaaasecidpsvvfpyplndssspkscasqdssafspssdsllsstesspqaspeplvlheetppttssdseeeqedeeeidvvsvekrqapgkrsesgspsagghskpphsplvlkrchvsthqhnyaappstrkdypaakrvkldsvrvlrqisnnrkctsprssdteenvkrrthnvlerqrrnelkrsffalrdqipelennekapkvvilkkatayilsvqaeeqklisekdllrkrreqlkhkleqlrkgelnsklegkpipnpllgldstrtghhhhhh(seqidno:10)?？梢栽诤铣善陂g或之后修飾融合蛋白以包含一或多個官能團(tuán)。作為實(shí)例而非限制，可以修飾蛋白質(zhì)以包含乙?；?、磷酸根、乙酸根、酰胺基、烷基和/或甲基基團(tuán)中的一或多種。本列表不是詳盡的，而僅是示例性的。在一些實(shí)施例中，蛋白質(zhì)包含至少一個乙?；鶊F(tuán)。iii.使用本技術(shù)調(diào)配物的方法本技術(shù)的組合物(例如，包括被配制成生物活性穩(wěn)定納米顆粒的含myc多肽的組合物)提供myc活性，因此可用于體內(nèi)(例如，作為佐劑、免疫系統(tǒng)增強(qiáng)劑等)和體外(例如，刺激干細(xì)胞(例如，造血干細(xì)胞(hsc))的生長和增殖，以調(diào)節(jié)hsc以在造血干細(xì)胞移植后增強(qiáng)植入，誘導(dǎo)或增強(qiáng)免疫細(xì)胞的活化、生長、增殖、活力或存活，和/或增強(qiáng)由培養(yǎng)物中免疫細(xì)胞進(jìn)行的抗體產(chǎn)生等)。僅作為實(shí)例而非限制，本技術(shù)的含myc納米顆粒組合物可以用于引發(fā)用于移植的供體hsc(例如，患者的分離的hsc或第三方供體的hsc)，例如用于患有免疫相關(guān)疾病或病癥(例如但不限于嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷)的患者。嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(scid)是一種危及生命的原發(fā)性免疫缺陷疾病，由損害t細(xì)胞和b細(xì)胞數(shù)量和功能的缺陷引起。患有scid的嬰兒受反復(fù)危及生命的感染之苦，其通常在三到六個月大之前進(jìn)行診斷。如果未治療，兒童會在2歲之前繼續(xù)經(jīng)歷嚴(yán)重的危及生命的感染和死亡。目前使用被涉及成重建正常免疫系統(tǒng)的hsct來治療患有scid的兒童。對于在患有嚴(yán)重感染之前進(jìn)行移植的最年幼的嬰兒(大多數(shù)這些嬰兒或是先證者的兄弟姐妹或通過新生兒篩查程序標(biāo)識出)和使用人白細(xì)胞抗原(hla)匹配的家屬供體的患者，這些移植的結(jié)果是最佳的。相比之下，對年齡較大的嬰兒進(jìn)行移植的結(jié)果和使用來自替代供體的細(xì)胞進(jìn)行移植的結(jié)果不太有利。在一些實(shí)施例中，對于使用技術(shù)的含myc納米微粒組合物的人，離體溫育(“引發(fā)”)t細(xì)胞和b細(xì)胞耗盡的供體造血細(xì)胞(包含造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞(hspc))。溫育后，洗滌引發(fā)的細(xì)胞并移植到患者體內(nèi)。供體細(xì)胞與本技術(shù)的組合物一起溫育增加了移植后長期自我更新的造血干細(xì)胞的增殖。在一些實(shí)施例中，從患者分離供體造血細(xì)胞。在一些實(shí)施例中，將供體造血細(xì)胞與本技術(shù)的納米顆粒含myc組合物一起溫育30分鐘、60分鐘、90分鐘或120分鐘。在一些實(shí)施例中，供體造血細(xì)胞與10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml、60μg/ml、70μg/ml、80μg/ml、90μg/ml或100μg/ml本技術(shù)的納米顆粒含myc組合物一起溫育。在一些實(shí)施例中，將細(xì)胞與50μg/ml納米顆粒含myc組合物一起溫育60分鐘。在一些實(shí)施例中，組合物的納米顆粒具有介于約80和150nm之間、介于約90和140nm之間、介于約100和120nm之間或介于約100和110nm之間的平均粒度，并且包括seqidno:1。在一些實(shí)施例中，組合物的納米顆粒具有介于約80和150nm之間、介于約90和140nm之間、介于約100和120nm之間或介于約100和110nm之間的平均粒度，并且包括seqidno:10。對于體內(nèi)使用，在一些實(shí)施例中，包含本文所述的納米顆粒含myc蛋白和任選的一或多種另外的治療性化合物和任選的一或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物調(diào)配物以任何方式施用于個體，所述方式包含多種施用途徑中的一或多種，例如，作為非限制性實(shí)例，口服、腸胃外(例如，靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi))，鼻內(nèi)、口腔、局部、直腸或透皮施用途徑。本文所述的藥物調(diào)配物包含但不限于水性液體分散體、自乳化分散體、固體溶液、脂質(zhì)體分散體、氣溶膠、固體劑型、粉末、速釋調(diào)配物、控釋調(diào)配物、快速熔融調(diào)配物、片劑、膠囊、丸劑、延釋調(diào)配物、緩釋調(diào)配物、脈沖釋放調(diào)配物、多顆粒調(diào)配物以及混合速釋和控釋調(diào)配物。藥物調(diào)配物的概述見于例如雷明頓：藥學(xué)的科學(xué)與實(shí)踐(remington:thescienceandpracticeofpharmacy)，第十九版(伊斯頓，賓夕法尼亞州：麥克出版公司(mackpublishingcompany)，1995年)；胡佛，約翰e.(hoover,johne.)，雷明頓藥學(xué)(remingtonispharmaceuticalsciences)，麥克出版公司，伊斯頓，賓夕法尼亞州，1975年；利伯曼，h.a.(liberman,h.a.)和拉赫曼，l.(lachman,l.)編輯，藥物劑型(pharmaceuticaldosageforms)，馬塞爾德克爾(marceldecker)，紐約，紐約州，1980年；和藥物劑型和藥物遞送系統(tǒng)(pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems)，第七版(利平科特威廉姆斯及威爾金斯(lippincottwilliams&wilkins)，1999年)中。在一些實(shí)施例中，本文提供的納米顆粒調(diào)配物包括合適的緩沖劑。示例性緩沖劑包含但不限于tris、磷酸鈉、磷酸鉀、組氨酸或檸檬酸鹽基緩沖劑。在一些實(shí)施例中，本文提供的調(diào)配物含有鎂。在一些實(shí)施例中，本文提供的調(diào)配物含有一或多種表面活性劑。如本文使用，術(shù)語“表面活性劑”可以包含藥學(xué)上可接受的賦形劑，其用于保護(hù)蛋白質(zhì)調(diào)配物免受機(jī)械應(yīng)力(如攪拌和剪切)的影響。藥學(xué)上可接受的表面活性劑的實(shí)例包含聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(tween)、聚氧乙烯烷基醚(brij)、烷基苯基聚氧乙烯醚(triton-x)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(poloxamer，pluronic)和十二烷基硫酸鈉(sds)。合適的表面活性劑包含聚氧乙烯山梨糖醇酐-脂肪酸酯，例如聚山梨醇酯20(以商標(biāo)tween銷售)和聚山梨醇酯80(以商標(biāo)tween銷售)。合適的聚乙烯-聚丙烯共聚物是以名稱f68或poloxamer銷售的那些。合適的聚氧乙烯烷基醚是以商標(biāo)銷售的那些。合適的烷基酚聚氧乙烯醚以商品名triton-x銷售。當(dāng)使用聚山梨醇酯20(tween)和聚山梨醇酯80(tween)時，它們通常以約0.001到約1％、約0.005到約0.2％和約0.01％到約0.1％w/v(重量/體積)的濃度范圍使用。在一些實(shí)施例中，本文提供的納米顆粒調(diào)配物包括穩(wěn)定劑。如本文使用，術(shù)語“穩(wěn)定劑”可以包含藥學(xué)上可接受的賦形劑，其在制造、儲存和應(yīng)用期間保護(hù)活性藥物成分和/或調(diào)配物免受化學(xué)和/或物理降解的影響。克萊蘭(cleland)等人，治療性藥物載劑系統(tǒng)的總要評論(crit.rev.ther.drugcarriersyst.)，70(4):307-77(1993)；王(wang)，國際藥劑學(xué)雜志(int.j.pharm.)，7s5(2):129-88(1999)；王，國際藥劑學(xué)雜志，203(1-2):1-60(2000)；和遲等人，藥物研究(pharm.res.)，20(9):1325-36(2003)綜述了蛋白質(zhì)藥物的化學(xué)和物理降解途徑。穩(wěn)定劑包含但不限于糖、氨基酸、多元醇、環(huán)糊精(例如，羥丙基-β-環(huán)糊精、磺丁基乙基-β-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精)、聚乙二醇(例如，peg3000、peg3350、peg4000、peg6000)、白蛋白、人血清白蛋白(hsa)、牛血清白蛋白(bsa)、鹽(例如，氯化鈉、氯化鎂、氯化鈣)、螯合劑(例如，下文定義的edta)。如上文所述，穩(wěn)定劑在調(diào)配物中的存在量可以為約10到約500mm，約10到約300mm或約100mm到約300mm。在一些實(shí)施例中，包含本文所述的融合肽納米顆粒的組合物的每日劑量為約0.001到1000.0mg/kg體重，例如約0.01到100.0mg/kg體重，例如約0.1到10.0mg/kg體重。上述范圍僅僅是提示性的，因?yàn)殛P(guān)于個體治療方案的變量的數(shù)量很大，并且與這些推薦值的極大偏差并不罕見。在一些實(shí)施例中，此些劑量任選地根據(jù)多個變量而改變，不限于所使用的本文所述的藥劑或組合物的活性、待治療的病癥或病狀、施用方式、個體受試者的要求、所治療的病癥或病狀的嚴(yán)重度以及從業(yè)者的判斷。在細(xì)胞培養(yǎng)物或?qū)嶒?yàn)動物中任選地確定此些治療方案的毒性和治療功效，包含但不限于ld50(對50％群體致死的劑量)和ed50(50％群體中治療有效的劑量)的確定。毒性和治療性效果之間的劑量比是治療指數(shù)，其被表示為ld50和ed50之比。優(yōu)選表現(xiàn)出高治療指數(shù)的本文所述的藥劑或組合物。從細(xì)胞培養(yǎng)測定和動物研究獲得的數(shù)據(jù)任選地用于配制用于人的一系列劑量。此本文所述的藥劑或組合物的劑量優(yōu)選地在包含具有最小毒性的ed50的循環(huán)濃度范圍內(nèi)。劑量任選地在本范圍內(nèi)變化，這取決于所使用的劑型和所利用的施用途徑。vii.實(shí)例以下實(shí)例僅用于說明目的，并且是非限制性實(shí)施例。鑒于上述教導(dǎo)，本公開的許多修改、等同物和變化是可能的，因此，應(yīng)當(dāng)理解，在所附權(quán)利要求的范圍內(nèi)，本公開可以不同于具體描述的方式實(shí)踐。實(shí)例1：本技術(shù)的tat-myc融合肽的構(gòu)建質(zhì)粒ptat-myc-v5-6xhis是通過使用正向引物和反向引物進(jìn)行人myc的編碼區(qū)域的pcr擴(kuò)增來制造的，所述正向引物含有hiv-1的tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域的框內(nèi)n-末端10-氨基酸序列(mrkkrrqrrr(seqidno:7)，并且所述反向引物去除終止密碼子。將pcr產(chǎn)物克隆到pet101/d-topo(invitrogen)載體中，其包含c末端v5表位標(biāo)簽和6-組氨酸蛋白質(zhì)標(biāo)簽。a.用于蛋白質(zhì)表達(dá)的細(xì)菌菌株通過用從bl21rosetta細(xì)胞(諾凡基(novagen))分離的prare(camr)轉(zhuǎn)化bl-21startm大腸桿菌菌株(英杰公司)來建立bl-21rare細(xì)胞，其表達(dá)agg、aga、aua、cua、ccc、gga密碼子的trna。b.蛋白質(zhì)誘導(dǎo)和純化為了制備發(fā)酵罐接種物，將tat-myc主細(xì)胞庫(mcb)的小瓶解凍，并用其接種含有l(wèi)b培養(yǎng)基且補(bǔ)充有抗生素(40μg/ml卡那霉素)的搖瓶，以用于選擇。將細(xì)胞在定軌搖床/培養(yǎng)箱中擴(kuò)增十四到十六小時。然后使用擴(kuò)增的培養(yǎng)物來接種發(fā)酵罐培養(yǎng)物。當(dāng)細(xì)胞處于對數(shù)生長期(od為約4.0)時，通過向培養(yǎng)物中加入iptg(～0.5-1mm)在37℃下誘導(dǎo)發(fā)酵。誘導(dǎo)細(xì)胞直至觀察到do(溶解氧)峰值，大約3-6個小時。誘導(dǎo)后，通過離心收獲細(xì)胞糊(paste)，并將其在-70℃或更低溫度下儲存直至進(jìn)一步處理。包涵體中含有的大部分蛋白質(zhì)是tat-myc。將細(xì)胞糊重懸于8m尿素、50mm磷酸鹽ph7.5中。將混懸液在室溫下混合直至均質(zhì)。然后將混懸液通過均質(zhì)器。然后調(diào)節(jié)經(jīng)均質(zhì)的混懸液以包含200mm亞硫酸鈉和10mm連四硫酸鈉。將溶液在室溫下混合直至均質(zhì)。將磺?；牧呀馕镌?-8℃下混合≥12小時。然后將磺?；牧呀馕镫x心一小時。收集上清液并棄去團(tuán)塊。將上清液通過0.22μm膜過濾器。使用ni-樹脂通過ni親和色譜純化磺?；膖at-myc溶液。將柱在6m尿素、50mm磷酸鹽、500mmnacl和10％甘油溶液中平衡。然后將磺?；统吻宓膖at-myc加載到柱上。用6m尿素、50mm磷酸鹽、10％甘油、500mmnacl(ph7.5)洗滌柱。然后用6m尿素、50mm磷酸鹽、10％甘油和2mnacl(ph7.5)洗滌柱，接著用6m尿素、50mm磷酸鹽、10％甘油、50mmnacl和30mm咪唑(ph7.5)進(jìn)行另一次洗滌。通過以100到300mm咪唑的梯度運(yùn)行含有6m尿素、50mm磷酸鹽、10％甘油和50mmnacl(ph7.5)的洗脫緩沖液并收集餾分來從柱洗脫產(chǎn)物。將待合并的含蛋白質(zhì)餾分通過0.22μm膜過濾，并使用uv280測量蛋白質(zhì)濃度。來自ni-瓊脂糖凝膠色譜步驟的合并級分使用q-瓊脂糖凝膠樹脂通過陰離子交換色譜進(jìn)一步純化。通過用來自ni瓊脂糖凝膠色譜步驟的第二洗滌緩沖液(6m尿素、50mm磷酸鹽、10％甘油、2mnacl，ph7.5)稀釋至q瓊脂糖凝膠緩沖液的電導(dǎo)率(17.52+/-1ms/cm)來制備合并物，以用于上樣到柱上。然后將稀釋的合并物上樣到柱上，接著使用6m尿素、50mm磷酸鹽、300mmnacl和10％甘油進(jìn)行兩個追加步驟，并且進(jìn)一步追加直至uv跡線達(dá)到基線。實(shí)例2.納米顆粒tat-myc組合物的制備利用ufdf(超濾/滲濾)膜使用基于切向流過濾的重折疊方法完成來自實(shí)例1的q-瓊脂糖凝膠流通合并物中的tat-myc蛋白的重折疊。重折疊過程包含一系列三個重折疊步驟。第一重折疊步驟涉及在約120分鐘的過程中更換重折疊緩沖液1(3m尿素、50mm磷酸鹽、500mmnacl、10％甘油、5mmgsh(還原型谷胱甘肽)、1mmgssg(氧化型谷胱甘肽))。第二重折疊步驟涉及在大約120分鐘的過程中更換重折疊緩沖液2(1.5m尿素、50mm磷酸鹽、500mmnacl、10％甘油、5mmgsh(還原型谷胱甘肽)、1mmgssg(氧化型谷胱甘肽))，然后是約120分鐘的再循環(huán)。第三重折疊步驟由在大約120分鐘的過程中更換重折疊緩沖液3(50mm磷酸鹽、500mmnacl、10％甘油、5mmgsh(還原型谷胱甘肽)、1mmgssg(氧化型谷胱甘肽))組成，然后是12小時的再循環(huán)。在第三重折疊步驟完成后，將重折疊3溶液通過0.2μm膜過濾，并調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)濃度。與牛血清白蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線相比，通過布拉德福德(bradford)蛋白質(zhì)測定(sigma)測量seqidno:1的tat-myc融合體的蛋白質(zhì)濃度。根據(jù)所述方法制備幾批重折疊的tat-myc。出于這些實(shí)例的目的，所提供的批次被稱為“f01”、“c2a”、“c2b”、“c6”、“c7”、“c12”、“c13”和“c14”。每個測試的批次含有50mm磷酸鹽、500mmnacl、10％甘油、5mmgsh(還原型谷胱甘肽)、1mmgssg(氧化型谷胱甘肽)，其在用重折疊緩沖液3進(jìn)行第三重折疊步驟之后獲得，c2a調(diào)配物除外，其另外含有精氨酸。重折疊的tat-myc對ph敏感，并且在ph7.5+/-ph0.3的調(diào)配物中是穩(wěn)定的。重折疊的tat-myc還對nacl濃度敏感，并且在約500mm+/-50mmnacl下穩(wěn)定。重折疊的tat-myc還穩(wěn)定至濃度為1.2mg/ml。重折疊的tat-myc在-80℃下穩(wěn)定長達(dá)或約2年。一旦解凍，它在4℃下儲存時保持活性長達(dá)或約一個月。實(shí)例3.納米顆粒tat-myc組合物的功能分析如下測試tat-myc組合物的活性。從c57bl/6j(jackson)小鼠收獲脾臟，并通過金屬絲網(wǎng)機(jī)械解離。去除紅細(xì)胞，使用市售的分離工藝(dynabead)分離cd4陽性t細(xì)胞，用1μg/ml抗cd3和抗cd28抗體活化t細(xì)胞。將細(xì)胞在1ml培養(yǎng)基中以每孔1.5x106個細(xì)胞接種于48孔簇培養(yǎng)皿中。24小時后，將tat-myc調(diào)配物加入細(xì)胞中(每孔總共12μg)并溫育24小時。加入蛋白質(zhì)24小時后，更換培養(yǎng)基并將細(xì)胞培養(yǎng)48小時。經(jīng)由流式細(xì)胞術(shù)(正向x側(cè)散射)在初始活化后96小時評估細(xì)胞的活力。c2a(根據(jù)實(shí)例2制備)的結(jié)果示出在圖1中。圖1a(左圖)示出了未治療的活化t細(xì)胞的增殖(12.8)。圖1b(右圖)示出了用6μgtat-myc調(diào)配物c2a治療24小時的活化t細(xì)胞的增殖。如圖所示，c2a治療的t細(xì)胞增殖不止翻倍。出于這些實(shí)例的目的，tat-myc的活性制劑、組合物、調(diào)配物或級分是與對照t細(xì)胞相比提供至少2倍的t細(xì)胞增殖增加的那種。表1tat-myc樣品治療：未治療之比陽性對照2.0r1471.1r1491.5c122.0c132.7實(shí)例4：納米顆粒調(diào)配物的表征如實(shí)例2中所述制備并如實(shí)例3所述測試生物活性的納米顆粒tat-myc蛋白的組合物使用幾種不同的技術(shù)表征，以證明(a)通過本技術(shù)的方法制備的tat-myc蛋白令人驚訝地并且意外地形成具有離散尺寸范圍的納米顆粒；(b)在本范圍內(nèi)只有一小部分納米顆粒具有生物活性，例如具有myc活性；(c)活性與粒度和一或多個翻譯后修飾有關(guān)。a.功能性調(diào)配物的穩(wěn)定性通過非對稱流場流分離(af4)和多角度激光散射(malls)在兩個不同溫度下評價兩種不同的tat-myc蛋白調(diào)配物(被稱為f01和f02)，以提供關(guān)于樣品中的所有組分的質(zhì)量和尺寸分布的信息。根據(jù)實(shí)例2重折疊f01。如下所討論制備f02。af4-malls分析示出了f01主要包含具有離散尺寸范圍的單個顆粒群，并且粒度隨時間且在不同溫度下是穩(wěn)定的。如上所述，根據(jù)實(shí)例2的方法制備f01。如實(shí)例1b中所述制備f02。重折疊后，將f02移至f01調(diào)配物，從50mm磷酸鹽、500mmnacl、10％甘油、5mmgsh(還原型谷胱甘肽)、1mmgssg(氧化型谷胱甘肽)，ph7.5變?yōu)?0mm磷酸鹽、250mmnacl、10％甘油，ph7.0的最終調(diào)配物。圖2a示出了f01的結(jié)果。圖2a中示出了四個不同的樣品：呈現(xiàn)了在25℃下運(yùn)行的2個f01樣品和在5℃下運(yùn)行的2個f01樣品。如圖2a種所示，對于所有樣品，在兩個溫度下，在約24到約32分鐘處觀察到幾乎相同的相對比例的單個主峰。這指示組合物包括穩(wěn)定的具有離散尺寸的顆粒群。圖2b提供了f02的結(jié)果。同樣，示出了四個不同的樣品：在25℃下運(yùn)行的2個f02樣品和在5℃下運(yùn)行的2個f02樣品。與f01結(jié)果相反，在不同時間點(diǎn)標(biāo)識出幾個峰，所有峰的相對比例都不同。對于出現(xiàn)在10和20分鐘之間的峰，頂部跡線和第三跡線表示在25℃下運(yùn)行的樣品的結(jié)果；第二和第四跡線表示在5℃下運(yùn)行的樣品。對于出現(xiàn)在24分鐘和32分鐘之間的峰，上面三條跡線包含兩個5℃樣品和25℃樣品中的一個，而本時間范圍中的最下面的跡線表示在25℃下運(yùn)行的另一個樣品。在40分鐘時間點(diǎn)處的峰將5℃樣品中的一個作為最下面的跡線示出，而將其余三條樣品跡線在上面示出。雖然f01在如實(shí)例3中所述的t細(xì)胞測定中表現(xiàn)出功能，但是f02沒有。因此，本技術(shù)的調(diào)配物包括穩(wěn)定的具有離散尺寸的tat-myc顆粒，并具有生物學(xué)功能。b.本技術(shù)的調(diào)配物的生物活性與粒度相關(guān)1.尺寸排阻色譜和高效液相色譜證實(shí)離散粒度存在于生物活性tat-myc制劑中為了驗(yàn)證tat-myc蛋白的功能與具有離散尺寸的納米顆粒相關(guān)，評價了三種不同的tat-myc制劑。兩種功能性制劑(被稱為“c12”和“c13”)和一種非功能性制劑(“r147”)如下經(jīng)由尺寸排阻色譜和隨后的高效液相色譜來表征。根據(jù)實(shí)例2中概述的程序制造功能性c12和c13。在運(yùn)行期間生成r147，其中加速了tff重折疊步驟以研究重折疊步驟耗費(fèi)120分鐘、120分鐘和14小時的必要性，如實(shí)例1b中詳述。相反，整個重折疊在60分鐘內(nèi)完成。用于分析tat-myc的sec-hplc程序在agilent1100系列上進(jìn)行。串聯(lián)配置了3個柱。設(shè)置如下：保護(hù)柱-2000a-500a-300a。流動相為50mm磷酸鈉、500mmnaclph7.0，流速為1.0ml/min，每次運(yùn)行的長度為40分鐘，并且蛋白質(zhì)以100μl注射體積被引入到柱上。三個樣品的跡線示出在圖3中。sec-hplc允許高分辨率的粒度分布，并在約13和16分鐘處示出了兩個不同的峰。雖然13分鐘處的峰具有活性顆粒，但24分鐘處的峰包含活性顆粒。注意，在22-24分鐘處觀察到的峰是重折疊緩沖液中賦形劑的結(jié)果。2.用于確定粒度的尺寸排阻色譜和多角度靜態(tài)光散射分析還使用sec-多角度靜態(tài)光散射(mals)來分析相同的三個樣品，以確認(rèn)粒度(分子量)以控制并消除任何意外的與柱的分子相互作用。結(jié)果示出在圖4a和4b中。圖4a是示出了在50mm磷酸鹽、500mmnacl、10％甘油、5mmgsh(還原型谷胱甘肽)、1mmgssg(氧化型谷胱甘肽)、250mmarg，ph7.5中配制的樣品c2a的折射率(影線)和分子量(實(shí)線)的圖。圖4b是c2a的sec跡線，其示出了具有谷胱甘肽但沒有arg的c2a重折疊緩沖液(活性樣品1)和具有arg但沒有谷胱甘肽的重折疊緩沖液(活性樣品2)的相對信號。圖4a和4b中示出的結(jié)果證實(shí)了大多數(shù)活性顆粒具有約107-109道爾頓的分子質(zhì)量(參見保留體積為約12.5ml的部分)。3.用于驗(yàn)證粒度的動態(tài)光散射分析測定生物活性調(diào)配物c2a和三種另外的調(diào)配物，c12、c13(二者皆為活性)和r149(非活性)以確定粒度。根據(jù)實(shí)例2中概述的程序制造功能性c12和c13。在類似于c12和c13的運(yùn)行期間生成r149，但是tff重折疊步驟由在6小時內(nèi)進(jìn)行的透析代替。根據(jù)段落a、段落b和段落c中概述的程序制造功能性c2a，但最終調(diào)配物緩沖液包含250mmarg。使用動態(tài)光散射(dls)評價樣品，動態(tài)光散射是一種可以用于確定混懸液中的小顆?；蛉芤褐械木酆衔锏某叽绶植记€的技術(shù)。dls測量在布朗運(yùn)動下運(yùn)動的顆粒的擴(kuò)散，并使用斯托克斯-愛因斯坦關(guān)系將擴(kuò)散系數(shù)轉(zhuǎn)換為流體動力學(xué)直徑：其中dh＝流體動力學(xué)直徑，kb＝玻爾茲曼常數(shù)，η＝動態(tài)粘度，d＝平移擴(kuò)散系數(shù)，t＝熱力學(xué)溫度。在malvernzetasizernano上分析樣品和標(biāo)準(zhǔn)品。在分析之前，將測試樣品和對照在調(diào)配物緩沖液中稀釋至0.5mg/ml的濃度。分析樣品，并通過強(qiáng)度、數(shù)量計數(shù)和體積分布評價尺寸。分析的報告值由強(qiáng)度z-ave(d.nm)值獲得。結(jié)果示出在圖5a-5d中。圖5a示出了c2a的dls跡線；平均粒度(直徑)為106.2nm。圖5b-5d分別示出了制劑r149(非活性)、c12(活性)和c13(活性)的dls跡線數(shù)據(jù)。非活性制劑的平均粒度為63nm，而制劑c12和c13的平均粒度分別為106和103nm。4.用于驗(yàn)證溶液中生物活性tat-myc顆粒的尺寸分布的納米顆粒跟蹤分析納米顆粒跟蹤分析(nta)是一種用于可視化和分析液體中的顆粒的方法，其使布朗運(yùn)動的速率與粒度相關(guān)。移動速率僅與液體的粘度和溫度相關(guān)；它不受顆粒密度或折射率的影響。nta允許確定液體混懸液中直徑大約為10-1000納米(nm)的小顆粒的尺寸分布曲線。納米顆粒尺寸和濃度使用配備有488nm激光和nta2.3軟件的ns300儀器(莫爾文，沃切斯特，英國)通過納米顆粒跟蹤分析(nta)來測量。在數(shù)據(jù)采集之前，將樣品以1:200-1:400稀釋，最終體積為400μl，并加載到流動池中。在室溫下捕捉視頻60秒。較小的尺寸檢測限制由軟件自動設(shè)定。結(jié)果示出在圖6a和6b中。用活性c2a制劑一式三份進(jìn)行nta分析。圖6a指示了樣品中的大部分顆粒的尺寸為約100nm。圖6b示出了平均濃度和尺寸。下表中提供了樣品中粒度的統(tǒng)計分析。合并數(shù)據(jù)粒度均值+/-標(biāo)準(zhǔn)誤差粒度均值116.0nm均值116.9+/-4.7nm方式98.5nm方式101.5+/-4.9nmsd48.7nmsd48.5+/-3.5nmd1071.7nmd1072.4+/-2.7nmd5098.6nmd50100.1+/-4.1nmd90171.2nmd90174.4+/-9.0nm5.用于視覺驗(yàn)證生物活性納米顆粒tat-myc的均勻性和尺寸的電子顯微鏡檢查通過電子顯微鏡檢查進(jìn)一步證實(shí)了上述生化結(jié)果。在實(shí)例3的t細(xì)胞測定中測試如實(shí)例2中所述制備并被稱為“c2b”的tat-myc調(diào)配物，以驗(yàn)證生物活性。如下經(jīng)由電子顯微鏡檢查使c2b可視化。將五十微升滴注tat-myc納米顆粒調(diào)配物點(diǎn)在石蠟?zāi)ど希缓笪盏捷x光放電的碳和聚乙烯醇縮甲醛涂層銅透射電子顯微鏡(tem)網(wǎng)格(g400銅；emscience)。將網(wǎng)格在kimwipe(kimberly-clark)上吸干，然后用乙酸雙氧鈾(2％[wt/vol])和tem(philipscm10)在80kv下染色。在x4,800放大倍數(shù)下觀察顆粒。結(jié)果示出在圖7中。圖7示出了100nm尺寸范圍內(nèi)的離散顆粒(黑球)。顆粒的形狀是均勻的，雖然在顯微照片中注意到一些尺寸變化，但是b-e部分中的數(shù)據(jù)證實(shí)了活性顆粒的尺寸范圍與顯微照片中示出的尺寸范圍一致。c.本技術(shù)的tat-myc調(diào)配物的生物學(xué)功能為了進(jìn)一步區(qū)分活性與非活性tat-myc制劑，進(jìn)行了肽圖譜分析。肽圖譜，也被稱為肽指紋圖譜，是一種通過蛋白質(zhì)的部分水解然后進(jìn)行電泳和色譜(在紙上或凝膠上)形成肽的二維圖案的技術(shù)。產(chǎn)生的肽圖案(或指紋)是特定蛋白質(zhì)的特性，并且可以使用所述技術(shù)來分離肽的混合物。用內(nèi)切蛋白酶aspn消化六種不同的tat-myc調(diào)配物。根據(jù)實(shí)例2制備三個樣品c2b、c6和c7，并且其在實(shí)例3的t細(xì)胞測定中表現(xiàn)出生物活性。如下制備三個樣品c4、147和149。在類似于c12和c13的運(yùn)行期間生成r149，但是tff重折疊步驟由在6小時內(nèi)進(jìn)行的透析代替。在運(yùn)行期間生成r147，其中加速了tff重折疊步驟以研究重折疊步驟耗費(fèi)120分鐘、120分鐘和14小時的必要性，如實(shí)例2中詳述。相反，整個重折疊在60分鐘內(nèi)完成。雖然根據(jù)實(shí)例1b中概述的程序制造c4，但然后調(diào)節(jié)q載荷的鹽和電導(dǎo)率以使其流過，將本q柱作為結(jié)合物運(yùn)行并且然后在鹽梯度上洗脫。這些樣品中沒有一個在實(shí)例3t細(xì)胞測定中表現(xiàn)出生物活性。蛋白質(zhì)消化如下進(jìn)行。tat-myc被鹽酸胍變性，被tcep(三2-羧乙基膦)還原，被碘乙酰胺烷基化并被胞內(nèi)蛋白酶asp-n消化，其在天冬氨酸殘基的n-末端進(jìn)行切割。所得肽通過反相hplc分離，并用215nm吸光度監(jiān)測。通過質(zhì)譜確定峰洗脫曲線中的肽同一性。對于常規(guī)蛋白質(zhì)分析，可以通過樣品與參考樣品的uv色譜圖中的峰曲線的視覺比較來建立同一性。通過hplc分析蛋白質(zhì)片段。結(jié)果示出在圖8中。圖8的上面三條跡線表示生物活性樣品。下面三條跡線表示非活性樣品。如圖12中所示，在所有三個活性樣品中存在12和12.5分鐘時間點(diǎn)之間的峰，緊鄰標(biāo)記為a1、a1-2的峰的右側(cè)，但在非活性樣品中不存在或最低限度可見。不希望受理論束縛，可能在活性樣品中乙酰化一或多個天冬氨酸殘基。實(shí)例5：含myc納米顆粒調(diào)配物的結(jié)構(gòu)表征使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)利用下表中概述的一系列生物化學(xué)、生物物理和功能表征技術(shù)來評價含myc納米顆粒調(diào)配物的一級、二級、三級和四級結(jié)構(gòu)。含myc納米顆粒結(jié)構(gòu)和功能說明策略綜述納米顆粒調(diào)配物c13用于本實(shí)例中呈現(xiàn)的大多數(shù)表征分析。在一些情況下，本文呈現(xiàn)了來自替代納米顆粒調(diào)配物(c2b或c14)的數(shù)據(jù)。根據(jù)與納米顆粒調(diào)配物c13所使用基本相同的工藝，還以類似的制造規(guī)模產(chǎn)生了納米顆粒調(diào)配物c14。a.通過液相色譜-質(zhì)譜(lc/ms)進(jìn)行肽譜分析含myc納米顆粒調(diào)配物如上表所述進(jìn)行分析，加入了質(zhì)譜、電噴霧離子化(esi)和飛行時間(tof)分析儀。因?yàn)樵趍s運(yùn)行期間沒有uv檢測，所以進(jìn)行ms總離子色譜圖(tic)和uv色譜圖的視覺對準(zhǔn)以將觀察到的質(zhì)量分配給相應(yīng)的uv峰。質(zhì)譜分析基于預(yù)期的肽序列證實(shí)了100％的肽覆蓋率。圖9示出了標(biāo)識出肽峰的myc肽的代表性肽圖譜。每個峰的肽的分配在下表中提供。理論tat-mycasp-n肽b.反相高效液相色譜(rp-hplc)采用反相hplc(rp-hplc)方法來定量翻譯后修飾和產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)。將測試樣品在變性緩沖液(7.5m鹽酸胍、0.0625mtrishclph7.3)中稀釋，并使用agilentadvancebiorp-mabc4柱(2.1x150mm，實(shí)芯磁珠3.5μm，)分離。將柱在50℃的溫度下平衡。通過施加0.5ml/min的流速和100％h2o(洗脫液a)中0.1％tfa(w/v)和100％acn(洗脫液b)中0.1％(w/v)tfa的線性梯度實(shí)現(xiàn)洗脫，如下表所示。檢測在280nm處進(jìn)行。rp-hplc梯度曲線時間(分鐘)％洗脫液b0.0023.015.0037.035.0045.036.0070.037.0070.038.0023.045.0023.0納米顆粒調(diào)配物c13的分析表明存在主峰和一些次峰，如圖10中所示。在本特定實(shí)例中未進(jìn)行雜質(zhì)峰的標(biāo)識。c.圓二色性光譜在“遠(yuǎn)uv”光譜區(qū)域(190-250nm)和“近uv”光譜區(qū)域(250-350nm)中使用圓二色性光譜(cd)來評價納米顆粒調(diào)配物c13的結(jié)構(gòu)。在遠(yuǎn)uv區(qū)域，發(fā)色團(tuán)是肽鍵，當(dāng)它位于規(guī)則的折疊環(huán)境中時產(chǎn)生信號。近uv區(qū)域可能對三級結(jié)構(gòu)的某些方面敏感。在這些波長處，發(fā)色團(tuán)是芳香族氨基酸和二硫鍵，它們產(chǎn)生的cd信號對蛋白質(zhì)的整體三級結(jié)構(gòu)敏感。將納米顆粒調(diào)配物c13稀釋至近uv280nm處0.75au的吸光度以及遠(yuǎn)uv195nm處1.1au的吸光度。谷胱甘肽對uv中的樣品吸光度有顯著影響。因此，為了增加蛋白質(zhì)的信號貢獻(xiàn)，將樣品緩沖液更換為還原型谷胱甘肽和谷胱甘肽游離緩沖液。樣品的測試參數(shù)如下表所示。通過cd光譜表征納米顆粒調(diào)配物的測試參數(shù)1對所有讀數(shù)求平均以產(chǎn)生每個樣品的報告光譜對于遠(yuǎn)uv和近uvcd光譜，將平均光譜減去緩沖液并歸一化至平均殘基摩爾橢圓率(mrme)。使用加權(quán)光譜差(wsd)算法進(jìn)行光譜相似性的定量分析。圖11中提供的所得遠(yuǎn)uv光譜表明蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)主要由β-折疊組成。幾乎沒有證據(jù)表明存在α-螺旋結(jié)構(gòu)。圖12中提供的近uv光譜表明弱色氨酸、高酪氨酸和非常高的二硫鍵特征。本結(jié)果與分子中色氨酸、酪氨酸和二硫鍵殘基的數(shù)量一致，如下表所示。含myc納米顆粒調(diào)配物中的色氨酸、酪氨酸和二硫鍵氨基酸殘基每分子的數(shù)量色氨酸2個酪氨酸12個二硫鍵4個(9個半胱氨酸)d.傅里葉變換紅外光譜(ftir)波數(shù)1700-1500cm-1的傅里葉變換紅外光譜(ftir)光譜可以用于確定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)性質(zhì)。在本光譜區(qū)域中的分析產(chǎn)生兩個吸收帶，通常被稱為酰胺i和酰胺ii，并且分別位于波數(shù)1700-1600cm-1和1600-1500cm-1之間。酰胺1帶是由于肽鍵的c＝o伸展振動，其由二級結(jié)構(gòu)(α-螺旋、β-折疊等)調(diào)節(jié)。通過將測量光譜與具有已知二級結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)獲得的光譜進(jìn)行比較，可以獲得二級結(jié)構(gòu)含量。使用brukeropticsvertex70，利用mct檢測器和bioatrcellii進(jìn)行納米顆粒調(diào)配物c14的ftir光譜。在分析之前，樣品不需要準(zhǔn)備。分析的測試參數(shù)如下表所示。ftir測試參數(shù)參數(shù)值溫度25℃濃度無溶劑檢測器mct孔徑設(shè)置6mm分辨率4cm-1分束器設(shè)置kbr高通濾波器打開低通濾波器10khz波數(shù)范圍*6000–950cm-1掃描儀速度20khz掃描次數(shù)128*建議使用波數(shù)范圍。減去緩沖液通常在2800-1000cm-1之間進(jìn)行，二次結(jié)構(gòu)光譜分析在1700-1600cm-1之間進(jìn)行。所得ftir光譜減去緩沖液，min-max在1600到1700cm-1范圍內(nèi)歸一化。應(yīng)用九點(diǎn)平滑以最小化白噪聲以確定二階導(dǎo)數(shù)。使用加權(quán)光譜差(wsd)算法進(jìn)行光譜相似性的定量分析。納米顆粒調(diào)配物c14表現(xiàn)出顯著的β結(jié)構(gòu)，包括折疊和轉(zhuǎn)角。在1649-1655附近的峰是無規(guī)卷曲。這些光譜特征與遠(yuǎn)uvcd數(shù)據(jù)的定性分析一致：即主要是β結(jié)構(gòu)和無規(guī)卷曲，并且存在很少甚至沒有α-螺旋。e.分析超速離心通過沉降速度分析超速離心(sv-auc)，基于蛋白質(zhì)在溶液中的沉降行為來研究納米顆粒調(diào)配物c13的高序結(jié)構(gòu)。sv-auc測量分子響應(yīng)離心力而沉降的速率。本沉降速率提供了關(guān)于樣品中存在的分子的分子量的信息。利用beckman-coulterxli，使用吸光度光學(xué)器件進(jìn)行sv-auc。在分析之前，樣品不需要另外的制備。測試參數(shù)如下表所示。利用如下表中所示的參數(shù)，使用sedfit15.01b進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。auc數(shù)據(jù)如圖14中所示。auc測試參數(shù)auc數(shù)據(jù)分析參數(shù)參數(shù)值彎月面從樣品側(cè)峰值的max浮動底部7.2cm底部裝配限制6.7cm摩擦比從2.2浮動緩沖液密度1.05507g/l緩沖液粘度0.01628泊部分比容0.73沉降系數(shù)范圍0.11–500s正則化方法吉洪諾夫-菲利普斯時間獨(dú)立性噪聲啟用徑向獨(dú)立性噪聲禁用1使用了對數(shù)間隔的網(wǎng)格，因此所有值必須大于零納米顆粒調(diào)配物c13表現(xiàn)出大的分子量分布。使用已知的緩沖液性質(zhì)確定近似分子量。分布在約4mda(20.6s)處急劇開始，并且在約10mda(40s)處具有頂點(diǎn)。主群分布延伸到約120mda(185s)。少量較大的物種延伸超過400s，但是這些物種低于方法的定量限制，無法準(zhǔn)確地定量。f.變性尺寸排阻色譜-hplc通過變性尺寸排阻色譜-hplc(dsec-hplc)分析納米顆粒調(diào)配物c13。使用tskgelg3000swxl；5μm，在變性條件(還原和非還原條件)下運(yùn)行樣品；使用不銹鋼7.8mmx30cm柱來實(shí)現(xiàn)樣品內(nèi)單體與較大分子量物質(zhì)的基于尺寸的分離。為了在非還原條件下分析樣品，使用7.5mgdnhcl、0.01m乙酸鈉ph4.7作為流動相，以等度配置實(shí)現(xiàn)洗脫。將樣品在流動相中稀釋1/10并渦旋10秒以混合。然后將樣品在37℃下溫育30分鐘，隨后再在4℃下放入自動取樣器中。為了在還原條件下分析樣品，使用7.5mgdnhcl、0.0625mtrishclph7.3作為流動相，以等度配置實(shí)現(xiàn)洗脫。將樣品在流動相中稀釋1/10，并加入1mltcep，隨后再渦旋10秒以混合。然后將樣品在37℃下溫育15分鐘，隨后再在4℃下放入自動取樣器中。使用熒光進(jìn)行峰定量來進(jìn)行還原和非還原條件的檢測。使用多角度激光散射(malls)實(shí)現(xiàn)跨峰的尺寸分布的估計。納米顆粒調(diào)配物c13的sec-hplc分析的所得色譜圖如圖15中所示。每個色譜圖上的重疊跡線表示對于儲存在2-8℃下的樣品，間隔大約1個月進(jìn)行的測試，證明了所述方法在加速溫度下儲存時識別變化的能力。g.電子顯微鏡檢查進(jìn)行電子顯微鏡檢查以收集納米顆粒調(diào)配物c2b的三維結(jié)構(gòu)的圖像。將五十微升滴注納米顆粒調(diào)配物(100ug/ml)點(diǎn)在石蠟?zāi)ど?，然后吸收到輝光放電的碳和聚乙烯醇縮甲醛涂層銅透射電子顯微鏡(tem)網(wǎng)格(g400銅；emscience)。將網(wǎng)格在kimwipe(kimberly-clark)上吸干，然后用乙酸雙氧鈾(2％[wt/vol])和tem(philipscm10)在80kv下染色。在x4,800放大倍速下成像大量100nm顆粒。所得圖像確認(rèn)了自組裝球體的高度有序復(fù)合物，如圖7中所示。實(shí)例6：突變tat-myc肽調(diào)配物的表征在本實(shí)例中，檢查myc在myc功能中起作用的位點(diǎn)的點(diǎn)突變，以確定突變是否影響tat-myc納米顆粒調(diào)配物的穩(wěn)定性。如上所述，具有seqidno:1所示序列的tat-myc融合蛋白是將框架內(nèi)融合的hiv-1tat的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(ptd)與野生型人myc蛋白組合的融合蛋白(c-myc)，后面是兩個標(biāo)簽：v5和6xhis。tat-3amyc與tat-myc相同，只是它含有3個氨基酸取代：t358a、s373a和t400a。最初選擇這三種氨基酸進(jìn)行突變，因?yàn)橐驯砻魉腥齻€殘基處的磷酸化通過阻斷max結(jié)合或直接干擾與dna的結(jié)合來抑制myc與dna的締合從而降低myc功能(黃(huang)等人，分子細(xì)胞生物學(xué)(molcellbiol.)，24(4):1582–1594(2004))。如下所述，tat-3amyc的點(diǎn)突變似乎使形成的復(fù)合物不穩(wěn)定，使得融合蛋白制劑是非功能性的。tat-myc和tat-3amyc融合蛋白的制備如上文實(shí)例1和2中所述制備tat-myc和tat-3amyc蛋白。融合蛋白在變性條件下增溶，然后重折疊成含有鹽、甘油和還原劑的最終調(diào)配物(即50mm磷酸鹽、500mmnacl、10％甘油、5mmgsh(還原型谷胱甘肽)、1mmgssg(氧化型谷胱甘肽)。尺寸排阻色譜hplc(sec-hplc)然后使用尺寸排阻色譜hplc(sec-hplc)分析包括tat-myc和tat-3amyc的納米顆粒調(diào)配物的分子量曲線。在尺寸排阻柱上用等度流動相(4mgdnhcl、10mmnaoac，ph4.65)分離尺寸變體，并在二極管陣列檢測器上用280nm處的紫外(uv)檢測進(jìn)行監(jiān)測。使用的參數(shù)如下：流速：0.75ml/min；最大壓力限制：70.0巴；運(yùn)行時間：30分鐘；注射體積：20μl)。圖16a示出了tat-myc蛋白制劑的色譜圖。蛋白質(zhì)復(fù)合物在6分鐘和7分鐘之間洗脫?？梢钥吹捷^小的蛋白質(zhì)多聚體和賦形劑峰在8分鐘和15分鐘之間洗脫。圖16b示出了tat-3amyc與tat-myc蛋白制劑相比的色譜圖。tat-3amyc具有顯著較少的蛋白質(zhì)復(fù)合物，其在6分鐘和7分鐘之間洗脫。大部分蛋白質(zhì)制劑包含較小的蛋白質(zhì)多聚體，并且可以看到在8分鐘和17分鐘之間洗脫的賦形劑峰。這表明t358、s373和t400突變?yōu)楸彼嶙阋云茐脑趕ec柱上在6分鐘和7分鐘之間洗脫的納米顆粒復(fù)合物的形成。效力測定還通過測試它們拯救活化的cd4+t細(xì)胞免于凋亡，保持爆炸(blasting)表型和在抗原刺激后繼續(xù)增殖的能力來評估tat-myc和tat-3amyc融合蛋白的效力。通過從小鼠收獲脾臟和淋巴結(jié)獲得用于測定的t細(xì)胞。通過網(wǎng)篩研磨脾和淋巴結(jié)以在c10培養(yǎng)基中生成單細(xì)胞混懸液。將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到錐形管中，并使細(xì)胞通過以1200rpm的速度離心5分鐘形成團(tuán)塊。將細(xì)胞重懸于5ml無菌tac緩沖液(135mmnh4cl、17mmtrisph7.65)中，并使其在tac緩沖液中靜置1-2分鐘以裂解紅細(xì)胞。將細(xì)胞以1200rpm的速度離心5分鐘，用10mlc10培養(yǎng)基洗滌，并重懸于4mlc10培養(yǎng)基中。根據(jù)制造商的說明書(invitrogencat#11445d)，使用抗cd4dynabeads從重懸的rbc耗盡的細(xì)胞混合物中分離t細(xì)胞。簡而言之，將4ml重懸的細(xì)胞團(tuán)塊加入到具有50μl洗滌的cd4dynabeads(x4)的彈扣蓋管中，并在4℃下在360°章動器上溫育1小時。溫育后，將管置于dynal磁體上，允許磁珠和細(xì)胞在管的側(cè)面聚集兩分鐘。去除上清液(cd4陰性細(xì)胞)。將磁珠和結(jié)合的細(xì)胞重懸于4mlc10培養(yǎng)基中，并放回磁體上以進(jìn)行分離。重復(fù)本洗滌。洗滌后，將磁珠和結(jié)合的細(xì)胞重懸于4mlc10中，并向每個管中加入50μlcd4detachabead(invitrogencat#12406d)，并在22℃下在360°章動器上溫育1小時。溫育后，將管置于dynal磁體上，允許磁珠在管的側(cè)面聚集兩分鐘。將含有cd4+細(xì)胞的上清液收集在50ml錐形管中。將剩余的磁珠重懸于10mlc10培養(yǎng)基中，在dynal磁體上分離并收集。然后重復(fù)本步驟并合并上清液。將合并的分離的cd4+細(xì)胞以1200rpm的速度離心5分鐘。去除上清液，將細(xì)胞以大約1.5x106個細(xì)胞/ml重懸于20ml(5ml/小鼠)中。將20ul市售抗cd3(ebiosciencescat#16-0031-86)和20ul抗-cd28抗體(克隆37n1)以1ul/ml加入管中以活化t細(xì)胞，并將細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)皿的20個孔中，每孔1ml培養(yǎng)基并在36℃下溫育72小時。在用抗cd3和抗cd28活化后72小時，使用培養(yǎng)基從24孔培養(yǎng)皿中的每個孔中去除培養(yǎng)基和細(xì)胞，以從每個孔的底部洗滌細(xì)胞。使細(xì)胞以1200rpm的速度形成團(tuán)塊五分鐘，重懸于5mlc10培養(yǎng)基中并轉(zhuǎn)移到15ml錐形管中。將5ml菲科-帕克(ficoll-paque)置于細(xì)胞下，并以1200rpm的速度旋轉(zhuǎn)五分鐘。使用4ml玻璃移液管去除血沉棕黃層并轉(zhuǎn)移到新的15ml錐形管中。加入10mlc10培養(yǎng)基來洗滌細(xì)胞。使細(xì)胞以1200rpm的速度形成團(tuán)塊五分鐘，以1x106個細(xì)胞/ml重懸，24孔板的每孔接種1ml。然后用tat-myc或tat-3amyc融合蛋白治療細(xì)胞。在使用流式細(xì)胞術(shù)用融合蛋白治療后48小時測定活力。圖17示出了活化的t細(xì)胞效力測定的圖示，其評價了tat-myc和tat-3amyc在細(xì)胞因子戒斷后拯救活化的t細(xì)胞免于凋亡的能力。與未治療(nt)相比，tat-myc在細(xì)胞因子戒斷后表現(xiàn)出活t細(xì)胞群增加了3倍。然而，與未治療(nt)相比，tat-3amyc表現(xiàn)出活體群t細(xì)胞群沒有增加。本結(jié)果與色譜數(shù)據(jù)一致，其示出了大多數(shù)tat-3amyc不形成類似于tat-myc的復(fù)合物，如圖16b中所示。總之，tat-myc形成納米顆粒復(fù)合物，其可以通過sec-hplc測量并在6分鐘和7分鐘之間洗脫。tat-3amyc不形成與tat-myc相同的納米顆粒復(fù)合物。t358、s373和t400突變?yōu)楸彼嶙阋云茐脑趕ec柱上在6分鐘和7分鐘之間洗脫的復(fù)合物的形成。此外，在t細(xì)胞效力測定中觀察到的tat-myc的功能似乎與本復(fù)合物的形成相關(guān)。實(shí)例7：源自綠猴(綠猴)myc蛋白的tat-myc融合肽的構(gòu)建和表征綠猴tat-myc的構(gòu)建和純化通過pcr擴(kuò)增綠猴(綠猴)myc的編碼區(qū)并用編碼seqidno:8的綠猴myc序列的一部分替換編碼實(shí)例1的人tat-myc載體中人myc序列的核酸來制造質(zhì)粒ptat-myc(綠猴)-v5-6xhis，所述綠猴myc序列與人myc序列相差兩個氨基酸。如實(shí)例1中所述進(jìn)行蛋白質(zhì)產(chǎn)生和純化。如實(shí)例2中所述進(jìn)行納米顆粒tat-myc組合物的制備。用于驗(yàn)證粒度的動態(tài)光散射(dls)如實(shí)例4(b)(3)所述，通過動態(tài)光散射(dls)技術(shù)評估重折疊的納米顆粒組合物的納米顆粒尺寸分布。結(jié)果示出在圖18中，其示出了綠猴tat-myc納米顆粒組合物的dls跡線。綠猴tat-myc的平均粒度(直徑)為約80nm。反相高效液相色譜(rp-hplc)采用反相hplc(rp-hplc)方法定量綠猴tat-myc納米顆粒組合物中的翻譯后修飾和產(chǎn)物相關(guān)雜質(zhì)。將測試樣品在變性緩沖液(7.5m鹽酸胍、0.0625mtrishclph7.3)中稀釋至1mg/ml。向樣品中加入2μl0.5mtcep((三(2-羧乙基)膦)，在37℃下溫育30分鐘，然后冷卻至2-8℃。將樣品在2-8℃下儲存長達(dá)5天，隨后再進(jìn)行分析。將樣品(50μl(約5μg)使用agilentadvancebiorp-mabc4柱分離(2.1x150mm，實(shí)芯磁珠3.5μm，)。柱在50℃的溫度下平衡。通過施加0.5ml/min的流速和100％h2o(洗脫液a)中0.1％tfa(w/v)和100％acn(洗脫液b)中0.1％(w/v)tfa的線性梯度實(shí)現(xiàn)洗脫，如下表所示。檢測在215nm處進(jìn)行。與參考人tat-myc納米顆粒組合物相比的綠猴tat-myc納米顆粒組合物的結(jié)果示出在圖19中。尺寸排阻色譜和高效液相色譜(sec-hplc)綠猴tat-myc納米顆粒組合物也經(jīng)由尺寸排阻色譜和隨后的高效液相色譜表征。使用tskgelg3000swxl；5μm，在變性非還原條件下運(yùn)行樣品；使用不銹鋼7.8mmx30cm柱來實(shí)現(xiàn)樣品內(nèi)單體與較大分子量物質(zhì)的基于尺寸的分離。使用4mgdnhcl、0.1m乙酸鈉ph4.65作為流動相，以等度配置實(shí)現(xiàn)洗脫。將樣品在流動相中稀釋1/10并渦旋10秒以混合。然后將樣品在37℃下溫育30分鐘，隨后再在4℃下放入自動取樣器中。與參考人tat-myc納米顆粒組合物相比的綠猴tat-myc納米顆粒組合物的sec-hplc分析的所得色譜圖示出在圖20中。效力測定還通過測試它們拯救活化的cd4+t細(xì)胞免于凋亡，保持爆炸表型和在抗原刺激后繼續(xù)增殖的能力來評估綠猴tat-myc納米顆粒組合物和參考人tat-myc納米顆粒組合物的效力。根據(jù)實(shí)例6中描述的效力測定來測定組合物的生物活性。圖21示出了活化的t細(xì)胞效力測定的圖示，其評價了不同劑量的綠猴tat-myc和人tat-myc相較于未治療對照增加具有爆破表型的活化t細(xì)胞的量的能力。盡管本文已經(jīng)示出并描述了本公開的優(yōu)選實(shí)施例，但是對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，此些實(shí)施例僅作為實(shí)例提供。在不脫離本公開的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員現(xiàn)在將想到多種變化、改變和替換。應(yīng)當(dāng)理解，可以在實(shí)踐本公開時采用本文描述的本公開的實(shí)施例的各種替代方案。本文旨在表示，以下權(quán)利要求限定本公開的范圍，并且因此涵蓋這些權(quán)利要求及其等同物的范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)。本文提及或引用的所有專利、專利申請、臨時申請和出版物均通過引用整體并入，包含所有附圖和表格，只要它們與本說明書的明確教導(dǎo)不矛盾。在以下權(quán)利要求中闡述了其它實(shí)施例。當(dāng)前第1頁12