含量的降低作用實(shí)驗(yàn)
[0074] 按照實(shí)施例4所述以羅非魚進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和分組，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死羅非魚進(jìn)行解 剖，取肝胰臟、腎臟、脾臟、鮑、腦、背部肌肉和性腺組織，放入微波消解爐中消解20min，得到 的消解液使用原子吸收光譜分析儀（SpectrAA220，Varian，USA)測定鉛含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如 表6所示。
[0075] 表6羅非魚臟器鉛含量
[0077] 注：_表示未檢測到；單位均為μ g/g組織濕重；標(biāo)有不同字母的組表示差異顯著 (Ρ〈0· 05) 〇
[0078] 對(duì)比Pb+5494組與Pb組可以發(fā)現(xiàn)，在肝胰臟、鰓、腦、性腺、背肌等組織中，兩者呈 現(xiàn)顯著性差異，在軀干腎和脾臟中差異性不大，但是其趨勢(shì)仍然是益生菌干預(yù)組要低于鉛 暴露組。這一數(shù)據(jù)說明CGMCC 5494能夠降低鉛暴露羅非魚體內(nèi)的鉛含量。
[0079] 實(shí)施例6植物乳桿菌CGMCC 5494緩解鉛暴露羅非魚氧化損傷實(shí)驗(yàn)
[0080] 以實(shí)施例4所述以羅非魚進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和分組，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死羅非魚進(jìn)行解 剖，取肝胰臟和腎臟，按照南京建成試劑測試盒的方法分別測定丙二醛（MDA)、還原性谷胱 甘肽（GSH)、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px)、總抗氧化能力（T-A0C)的水平。測試結(jié)果如附 圖5-8所示。
[0081] 如附圖5-8所示，CGMCC 5494緩解了因鉛暴露造成的GSH、GSH-Px和T-A0C的降 低，以及肝臟中MDA的升高。GSH是維持細(xì)胞生物功能的重要物質(zhì)，GSH-Px是體內(nèi)廣泛存 在的一種抗氧化酶，能將有毒的過氧化物催化成無毒物質(zhì)，兩者都是重金屬暴露的生物標(biāo) 志物；T-A0C是用于衡量抗氧化能力的綜合指標(biāo)，它的大小可以反映機(jī)體自身氧化代謝的 狀態(tài)，在鉛暴露下，會(huì)產(chǎn)生氧化損傷，導(dǎo)致T-A0C降低；而MDA是一種生物體內(nèi)的自由基與 脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物，是生物體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷的一種標(biāo)志酶。以上結(jié)果說明， CGMCC5494緩解了羅非魚鉛中毒引起的氧化應(yīng)激和氧化損傷。
[0082] 實(shí)施例7植物乳桿菌CGMCC 5494緩解鉛暴露羅非魚體內(nèi)氨基乙酰丙酸脫水酶 (ALAD)活性降低實(shí)驗(yàn)
[0083] 以實(shí)施例4所述以羅非魚進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和分組，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死羅非魚進(jìn)行解 剖，尾椎靜脈取羅非魚血液，按照上海川翔生物科技有限公司的試劑盒進(jìn)行測定，測定結(jié)果 如附圖9所示。
[0084] ALAD是血紅素原合成的關(guān)鍵酶之一，直接與造血系統(tǒng)有關(guān)，鉛中毒可以抑制血紅 素原合成的幾個(gè)關(guān)鍵酶，包括ALAD，是鉛中毒的作用靶點(diǎn)酶，ALAD的活性可以作為鉛中毒 的生物標(biāo)志物。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，鉛暴露組含量較其他各組顯著下降，說明鉛暴露抑制了 ALAD 活性，而Pb+5494顯著提高了 ALAD活性，說明CGMCC 5494能保護(hù)ALAD活性免受鉛中毒的 損傷。
[0085] 實(shí)施例8植物乳桿菌CGMCC 5494提高鉛暴露羅非魚體內(nèi)免疫水平實(shí)驗(yàn)
[0086] 以實(shí)施例4所述以羅非魚進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和分組，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死羅非魚進(jìn)行解 剖，尾椎靜脈取羅非魚血液，按照南京建成試劑盒進(jìn)行測定溶菌酶和髓過氧化物酶（ΜΡ0) 活性，測定結(jié)果如附圖10所示。
[0087] 溶菌酶和ΜΡ0是非特異性免疫的一部分，溶菌酶可以吞噬殺滅外源微生物，而ΜΡ0 也能殺滅吞噬于細(xì)胞的微生物。這兩個(gè)指標(biāo)一定程度上代表了非特異性免疫的強(qiáng)弱。由 附圖10可知，由于鉛暴露的影響，鉛組的溶菌酶含量和ΜΡ0活性平均值均低于對(duì)照組， Pb+5494組溶菌酶含量和ΜΡ0活性顯著高于Pb組；說明CGMCC 5494顯著提高了鉛暴露造 成的溶菌酶含量和ΜΡ0活性降低。
[0088] 實(shí)施例9植物乳桿菌CGMCC 5494緩解鉛暴露羅非魚細(xì)胞和遺傳毒性實(shí)驗(yàn)
[0089] 以實(shí)施例4所述以羅非魚進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和分組，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死羅非魚進(jìn)行解 剖，尾椎靜脈取羅非魚血液制作血液涂片，在顯微鏡下觀察，放大1000倍，隨機(jī)數(shù)1000個(gè)紅 細(xì)胞，統(tǒng)計(jì)不同分類異形核的數(shù)目（附圖11)。結(jié)果如表7所示。
[0090] 表7紅細(xì)胞異形核統(tǒng)計(jì)
[0092] 注：單位為個(gè)/1000個(gè)紅細(xì)胞；標(biāo)有不同字母的組表示差異顯著（P〈0. 05)
[0093] 表7列出了紅胞異形核的分類統(tǒng)計(jì)。對(duì)遺傳毒性的檢驗(yàn)?zāi)軌蚍从抄h(huán)境污染物的毒 性，而微核和核異形是對(duì)遺傳和細(xì)胞毒性極為敏感的指標(biāo)。由表7可知，鉛組在紅細(xì)胞腎狀 核、裂核雙葉核、微核上數(shù)目顯著高于空白組，而腎狀核是異形核出現(xiàn)數(shù)量最多的，由此可 以說明由于鉛暴露的原因?qū)α_非魚產(chǎn)生了遺傳毒性和細(xì)胞毒性。對(duì)照Pb組和Pb+5494組， 發(fā)現(xiàn)Pb+5494組的異形核數(shù)目在腎狀核、裂核、冒小泡核、空泡核、鉤狀核、雙葉核和微核的 出現(xiàn)頻率上顯著低于Pb組，說明CGMCC 5494作為益生菌添加劑降低了鉛暴露下的異形核 數(shù)目，能夠緩解羅非魚的鉛中毒造成的遺傳和細(xì)胞毒性。
[0094] 實(shí)施例10利用植物乳桿菌CGMCC 5494制作含該菌的顆粒飼料
[0095] 將植物乳桿菌CGMCC5494在培養(yǎng)基中培養(yǎng)18h，按照之前述及的方法得到新鮮濃 縮菌液、凍干菌粉和海藻酸鈉微膠囊菌劑，分別添加入粉狀預(yù)混飼料中充分混勻，以小型顆 粒飼料機(jī)進(jìn)行制粒，制粒溫度為70°C，得到含該菌的顆粒飼料；顆粒飼料成型后，將新鮮濃 縮菌液使用壓力噴嘴均勻混入顆粒飼料中，得到含該菌的顆粒飼料。所得顆粒飼料的活菌 數(shù)大于l〇sCFU/g成品飼料。
[0096] 雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種植物乳桿菌飼料，其特征在于，所述植物乳桿菌飼料是將植物乳桿菌CGMCC No. 5494以飼料添加劑的形式加入到水生動(dòng)物飼料的預(yù)混料中進(jìn)行制粒或者是預(yù)先制粒后 進(jìn)行以載體噴涂益生菌的方式制備含活菌的益生菌飼料，所述植物乳桿菌飼料中含有活菌 含量大于l〇sCFU/g的植物乳桿菌CGMCCNo. 5494。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌飼料，其特征在于，所述水生動(dòng)物飼料為羅非魚 基礎(chǔ)飼料，按質(zhì)量份數(shù)計(jì)，含有大豆柏40 %、米糠14 %、面粉22 %、魚粉10 %、棉籽柏5 %、菜 籽柏5 %、大豆油2 %、預(yù)混料2 %。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的植物乳桿菌飼料，其特征在于，所述飼料添加劑是CGMCC No. 5494以離心濃縮或者是冷凍干燥工藝獲得的菌劑，或是CGMCCNo. 5494的海藻酸鈉微 膠囊菌劑。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的植物乳桿菌飼料，其特征在于，所述載體是在飼料中可接受 的載體。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述在飼料中可接受的載體是一種或多 種在飼料中通常使用的粘合劑、潤滑劑或者是保護(hù)劑。6. 權(quán)利要求1-5任一所述的植物乳桿菌飼料在提高鉛暴露羅非魚的腸道消化酶活力 方面的應(yīng)用。7. 權(quán)利要求1-5任一所述的植物乳桿菌飼料在提高鉛暴露羅非魚的生長速率的應(yīng)用。8. 權(quán)利要求1-5任一所述的植物乳桿菌飼料在提高鉛暴露羅非魚體內(nèi)氨基乙酰丙酸 脫水酶的活性方面的應(yīng)用。9. 權(quán)利要求1-5任一所述的植物乳桿菌飼料在提高鉛暴露羅非魚的溶菌酶活性與髓 過氧化物酶活性方面的應(yīng)用。10. -種飼料添加劑，其特征在于，所述飼料添加劑是利用植物乳桿菌CGMCCNo. 5494 制備的菌劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種能夠緩解羅非魚鉛毒性的植物乳桿菌飼料，屬于飼料技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的飼料是將CGMCC？5494株菌以離心濃縮或者是冷凍干燥以及微膠囊包埋獲得的菌劑以飼料添加劑的形式加入到水生動(dòng)物飼料預(yù)混料中進(jìn)行制?；蛘呤穷A(yù)先制粒后進(jìn)行以載體噴涂益生菌的方式制備含活菌數(shù)大于108cfu/g成品飼料的益生菌顆粒飼料。以該方法獲得的飼料能夠提高羅非魚的生長速率；提高鉛暴露羅非魚的腸道消化酶活力；降低鉛暴露羅非魚體內(nèi)鉛含量；緩解鉛暴露羅非魚體內(nèi)氧化應(yīng)激損傷；提高鉛暴露羅非魚體內(nèi)氨基乙酰丙酸脫水酶的活性；提高鉛暴露羅非魚的溶菌酶活性與髓過氧化物酶活性；緩解鉛暴露羅非魚的細(xì)胞和遺傳毒性。非常具有應(yīng)用前景。
【IPC分類】A23K10/30, A23K50/80, A23K10/20, A23K10/16
【公開號(hào)】CN105285514
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510823741
【發(fā)明人】陳衛(wèi), 田豐偉, 翟齊嘯, 王汗成, 王剛, 趙建新, 劉小鳴, 張秋香, 張灝
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年11月24日