本發(fā)明的主題是用于預(yù)測對象患糖尿病和/或代謝綜合征的風(fēng)險或用于診斷對象中的代謝綜合征的方法，其中所述對象未患糖尿病，所述方法包括以下步驟：●確定神經(jīng)降壓素原或其至少5個氨基酸的片段在從所述對象獲得的體液中的水平；和●將神經(jīng)降壓素原或其片段的所述水平與所述對象患糖尿病和/或代謝綜合征的風(fēng)險相關(guān)聯(lián)，其中水平升高預(yù)示患糖尿病和/或代謝綜合征的風(fēng)險增加，或者其中水平升高與對象中代謝綜合征的診斷相關(guān)，其中所述對象未患糖尿病。術(shù)語“水平升高”的意思是在一定的閾值水平之上的水平。
背景技術(shù)：
：：神經(jīng)降壓素是源自于前神經(jīng)降壓素原前體的13個氨基酸的神經(jīng)肽，并與穩(wěn)定的117個氨基酸的肽神經(jīng)降壓素原(P-NT)一起按化學(xué)計(jì)量比例釋放，成熟的激素與3種不同的受體結(jié)合，分別是神經(jīng)降壓素受體1和2(Ntsr1和Ntsr2)以及神經(jīng)降壓素受體3(Ntsr3)，其中神經(jīng)降壓素受體1和2是G蛋白偶聯(lián)受體，神經(jīng)降壓素受體3是非G蛋白偶聯(lián)受體并且也被稱為Sortillin-1(SORT1)。神經(jīng)降壓素由小腸在外周釋放，也由下丘腦在中央釋放。神經(jīng)降壓素的外周分泌受到食物攝取、尤其是脂肪的刺激，并且已知其能夠調(diào)節(jié)胃腸蠕動以及胰腺和膽汁的分泌。有趣的是，神經(jīng)降壓素作為抑制食欲的激素而參與食欲控制，因?yàn)樗?jīng)中央(腦室內(nèi))和外周(腹腔內(nèi))注入大鼠之后，能夠嚴(yán)重減少食物的攝取，這種效應(yīng)似乎主要是通過神經(jīng)降壓素-1受體(Ntsr1)介導(dǎo)的。在與正常體重人類對象相比而言的肥胖者中，在液體脂肪餐后，餐后血漿神經(jīng)降壓素濃度降低(Widen等，1992，RegPeptides；在改良的假飼(MSF)和液體試驗(yàn)餐后肥胖者中調(diào)節(jié)肽的血漿濃度(Plasmaconcentrationsofregulatorypeptidesinobseityfollowingmodifiedshamfeeding(MSF)andaliquidtestmeal))，這說明肥胖者中的神經(jīng)降壓素分泌調(diào)節(jié)失常。但是，還沒有大規(guī)模的研究探討過神經(jīng)降壓素是否以及如何與肥胖程度相關(guān)。有趣的是，P-NT在胃旁路手術(shù)(Roux-en-Y)后顯著增加，據(jù)顯示，這是在大多數(shù)肥胖的II型糖尿病患者中能導(dǎo)致血糖正常的手術(shù)，但是尚不知道神經(jīng)降壓素總的來說是否參與糖尿病的發(fā)展。此外，神經(jīng)降壓素系統(tǒng)參與冠狀動脈疾病和心肌梗死的發(fā)展，因?yàn)镹tsr3(SORT1)基因的變異是人類中已知的最強(qiáng)的冠狀動脈疾病常見易感基因之一。肥胖和癌癥之間在機(jī)制上的聯(lián)系基本上是未知的，但是，主流理論之一是過多的脂肪沉積會導(dǎo)致外周雄激素的芳構(gòu)化增加，并由此導(dǎo)致循環(huán)的雌激素水平升高。另外，據(jù)顯示，肥胖的特征之一高胰島素血癥會抑制肝臟產(chǎn)生性激素結(jié)合球蛋白(SHBG)，進(jìn)而使雌激素和雄激素兩者的可生物利用的水平升高，這揭示了肥胖使常見形式的由性激素引起的癌癥形式例如乳腺癌和前列腺癌的風(fēng)險增加的途徑。有趣的是，神經(jīng)降壓素和Nstr1兩者的表達(dá)在惡性乳腺導(dǎo)管癌腫瘤中都很常見，并且實(shí)驗(yàn)性地藥理阻斷或RNA沉默NTSR1能夠使小鼠中的腫瘤生長降低。乳腺癌細(xì)胞中神經(jīng)降壓素受體1(NTSR1)的表達(dá)水平已被用于確定患有乳腺癌的對象的預(yù)后(US2011/0305633)。另外，同一作者指出，當(dāng)前尚未描述出循環(huán)的神經(jīng)降壓素與胰腺、前列腺、或髓樣甲狀腺腫瘤的分期之間的明確的關(guān)聯(lián)性，這可能是由于肝臟對神經(jīng)降壓素的快速清除。有趣的是，已發(fā)現(xiàn)，在一組51名患侵襲性乳腺導(dǎo)管癌的患者中，所有腫瘤中有91％腫瘤的神經(jīng)降壓素受體1(NTSR1)為陽性，但所有腫瘤中只有31％腫瘤在所述組織中的神經(jīng)降壓素為陽性(Souaze等.CanerResearch2006；66；(12)pages6243-6249)。有一些證據(jù)可表明神經(jīng)降壓素和神經(jīng)降壓素受體參與了癌的生長，尤其是參與肺癌、胰腺癌和結(jié)腸癌的生長(Carraway等；Peptides27(2006)2445-2460)。據(jù)報(bào)道，胰腺癌患者血清中的NT水平顯著升高(Picheon等，AnticancerResearch1999；19；1445-50)。有趣的是，該組發(fā)現(xiàn)，對于胰腺癌和前列腺癌兩者而言，NT水平隨著疾病的進(jìn)展而降低。相反地，對此，Meggiato等；Tumori1996；82；592～5；發(fā)現(xiàn)NT的血漿水平在胰腺癌中是正常的，但在診斷為胰腺炎的病例中卻是升高的。和肽素用于預(yù)測糖尿病的應(yīng)用已經(jīng)被等，Circulation，2010；121：2102-2108報(bào)道。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的主題是研究用于預(yù)測對象患糖尿病和/或代謝綜合征的風(fēng)險或用于診斷對象中的代謝綜合征的NT的預(yù)測和診斷能力，其中所述對象未患糖尿病。為了解決這個問題，我們在所述瑞典前瞻性世代研究(馬爾默飲食與癌癥研究)中測定了空腹血漿中神經(jīng)降壓素原的穩(wěn)定的片段，并將該生物標(biāo)志物的基線水平與15年隨訪期間的糖尿病發(fā)生率相關(guān)聯(lián)。本發(fā)明的主題是用于預(yù)測對象患糖尿病和/或代謝綜合征的風(fēng)險或用于診斷對象中的代謝綜合征的方法，其中所述對象未患糖尿病，所述方法包括以下步驟：●確定神經(jīng)降壓素原或其至少5個氨基酸的片段在從所述對象獲得的體液中的水平；和●將神經(jīng)降壓素原或其片段的所述水平與所述對象患糖尿病和/或代謝綜合征的風(fēng)險相關(guān)聯(lián)，其中水平升高預(yù)示患糖尿病和/或代謝綜合征的風(fēng)險增加，或者其中水平升高與對象中代謝綜合征的診斷相關(guān)，其中所述對象未患糖尿病。附圖說明圖1示出了典型的P-NT劑量/信號曲線。圖2：糖尿病預(yù)測的KaplanMeier分析：2a)所有未患糖尿病的對象采用中位數(shù)截止值(cutoff)(104.6pmol/l)2b)所有未患糖尿病和前驅(qū)糖尿病(IFG)的對象，截止值，(104.6pmol/l)。具體實(shí)施方式此處使用的術(shù)語“對象”指有生命的人類或非人類的生物體。在本文中，優(yōu)選地，所述對象是人類對象。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述對象是雌性對象。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述對象是非IFG(非前驅(qū)糖尿病)的對象。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，神經(jīng)降壓素原或其至少5個氨基酸的片段在體液中的水平是神經(jīng)降壓素原或其至少5個氨基酸的片段的空腹水平?？崭顾降囊馑际遣扇⊙獦忧?2小時沒有攝取食物。體液可以選自血液、血清、血漿、尿液、腦脊液、和唾液。目前的數(shù)據(jù)表明，在神經(jīng)降壓素原或其片段的水平與糖尿病之間存在著強(qiáng)關(guān)聯(lián)性，尤其在是未患有普遍的糖尿病的對象中。目前的數(shù)據(jù)還表明，在高血壓對象中，在神經(jīng)降壓素原或其片段的水平與糖尿病之間存在著強(qiáng)關(guān)聯(lián)性，所述高血壓對象是心血管疾病和/或糖尿病的常見高危群體。體液中可能檢測到的神經(jīng)降壓素原片段可以為，例如：SEQIDNO：1(神經(jīng)降壓素原1-147)SESEEEMKALEADFLTNMHTSKISKAHVPSWKMTLLNVCSLVNNLNSPAEETGEVHEEELVARRKLPTALDFGSLEAMLTIYQLHKICHSRAFQHWELIQEDILDTGNDKNGKEEVIKRKIPYILKRQLYENKPRRRYILKRDSYYYSEQIDNO：2(神經(jīng)降壓素原1-125(大的神經(jīng)調(diào)節(jié)肽N))SDSEEEMKALEADFLTNMHTSKISKAHVPSWKMTLLNVCSLVNNLNSPAEETGEVHEEELVARRKLPTALDGFSLEAMLTIYQLHKICHSRAFQHWELIQEDILDTGNDKNGKEEVIKRKIPYILSEQIDNO：3(神經(jīng)調(diào)節(jié)肽N：)KIPYILSEQIDNO：4(神經(jīng)降壓素)pyroQLYENKPRRPYILSEQIDNO：5(神經(jīng)降壓素原1-117)SDSEEEMKALEADFLTNMHTSKISKAHVPSWKMTLLNVCSLVNNLNSPAEETGEVHEEELVARRKLPTALDGFSLEAMLTIYQLHKICHSRAFQHWELIQEDILDTGNDKNGKEEVISEQIDNO：6(神經(jīng)降壓素原1-132)SDSEEEMKALEADFLTNMHTSKISKAHVPSWKMTLLNVCSLVNNLNSPAEETGEVHEEELVARRKLPTALDGFSLEAMLTIYQLHKICHSRAFQHWELIQEDILDTGNDKNGKEEVIKRKIPYILKRQLYENSEQIDNO：7(神經(jīng)降壓素原1-125)SDSEEEMKALEADFLTNMHTSKISKAHVPSWKMTLLNVCSLVNNLNSPAEETGEVHEEELVARRKLPTALDGFSLEAMLTIYQLHKICHSRAFQHWELIQEDILDTGNDKNGKEEVIKRKIPYILSEQIDNO：8(神經(jīng)降壓素原120-140)KIPYILKRQLYENKPRRPYILSEQIDNO：9(神經(jīng)降壓素原120-147)KIPYILKRQLYENKPRRPYILKRDSYYYSEQIDNO：10(神經(jīng)降壓素原128-147)QLYENKPRRPYILKRDSYYY在本發(fā)明方法的更具體的實(shí)施方案中，確定神經(jīng)降壓素原1-117的水平。在具體的實(shí)施方案中，神經(jīng)降壓素原的水平是用免疫檢測法測定的。更具體地，免疫檢測法是按照Ernst等Peptides27(2006)1787-1793中的描述使用的。可用于確定神經(jīng)降壓素原或其至少5個氨基酸的片段的水平的免疫檢測法是基于本發(fā)明的結(jié)合物，所述結(jié)合物用于在雌性對象的離體體液中，選擇性測定針對根據(jù)SEQIDNO：1至SEQIDNO：10所述的任何神經(jīng)降壓素原序列中的至少一種的免疫反應(yīng)性。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，可用于確定神經(jīng)降壓素原或其至少5個氨基酸的片段的水平的免疫檢測法是基于本發(fā)明的兩種不同的結(jié)合物，所述結(jié)合物用于在雌性對象的離體體液中，選擇性測定針對根據(jù)SEQIDNO：1至SEQIDNO：10所述的任何神經(jīng)降壓素原序列中的兩種不同的部分序列的免疫反應(yīng)性。因此，在根據(jù)SEQIDNO：1至SEQIDNO：10中任一個所述的神經(jīng)降壓素原的同一部分中，兩種結(jié)合物靶向不同的序列。在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，免疫檢測法可用于確定神經(jīng)降壓素原或其至少5個氨基酸的片段的水平，其中兩種不同的結(jié)合物特異性地指向根據(jù)SEQIDNO：5所述的神經(jīng)降壓素原的N端部分1-117以選擇性測定針對該序列的免疫反應(yīng)性，所述免疫檢測法的特征在于所述免疫反應(yīng)性不是神經(jīng)降壓素(NT)(SEQIDNO：4)或神經(jīng)調(diào)節(jié)肽N(NMN)(SEQIDNO：3)的免疫反應(yīng)性。由此，通過使用兩種不同的結(jié)合物進(jìn)行的夾心免疫檢測法，免疫檢測法僅特異性地識別神經(jīng)降壓素原的N端肽，所述兩種不同的結(jié)合物與所述N端序列的不同的部分序列發(fā)生特異性結(jié)合，所述不同的部分序列含有完整的前神經(jīng)降壓素原的第67-85位氨基酸和第121-140位氨基酸兩者(如Ernst等(2006)中的圖1所示)。(對此，參見US2008/0280306——用于測定釋放進(jìn)入到循環(huán)中的神經(jīng)降壓素的免疫檢測法(Immunoassayfordeterminingthereleaseofneurotensinintothecirculation)；以及Ernst等，神經(jīng)降壓素原1-117：在人體循環(huán)中鑒定到的穩(wěn)定的神經(jīng)降壓素前體片段(Proneurotensin1-117，astableneurotensinprecursorfragmentidentifiedinhumancirculation)，Peptides(27)，1787-1793(2006))。在另一個具體實(shí)施方案中，上述免疫檢測法的特征還可以在于，在結(jié)合物是抗體的情況下，結(jié)合物是特異性的單抗隆抗體和/或親和純化的多克隆抗體。其中的一種抗體可以以與固相結(jié)合的形式使用，該固相優(yōu)選地是各自的試管壁，并且第二抗體是標(biāo)記的或可選擇性標(biāo)記的抗體?？梢杂梅派湫酝凰鼗蛲ㄟ^化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光、熒光、或通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的酶標(biāo)記進(jìn)行所述標(biāo)記。優(yōu)選地，所述第二抗體是通過化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的。由于標(biāo)記了兩種抗體中的至少一種，因此，在將兩種抗體結(jié)合到根據(jù)SEQIDNO：1至SEQIDNO：10中任一個所述的神經(jīng)降壓素原之后，產(chǎn)生了可測定的信號，這使得所產(chǎn)生的夾心復(fù)合物能夠在測定溶液中被檢測到。(對此，參見US2008/0280306——用于測定釋放進(jìn)入到循環(huán)中的神經(jīng)降壓素的免疫檢測法(Immunoassayfordeterminingthereleaseofneurotensinintothecirculation)；以及Ernst等，神經(jīng)降壓素原1-117：在人體循環(huán)中鑒定到的穩(wěn)定的神經(jīng)降壓素前體片段(Proneurotensin1-117，astableneurotensinprecursorfragmentidentifiedinhumancirculation)，Peptides(27)，1787-1793(2006))。上述免疫檢測法在實(shí)施例2中有更詳細(xì)的概述。應(yīng)當(dāng)根據(jù)實(shí)施例2所使用的測試和校準(zhǔn)來看待所有的閾值和值。本領(lǐng)域技術(shù)人員可能知道，閾值的絕對值可能受到所使用的校準(zhǔn)的影響。這意味著，應(yīng)當(dāng)在本文(實(shí)施例2)所使用的校準(zhǔn)的背景下理解本文中給出的所有值和閾值。人P-NT校準(zhǔn)品可得自ICI-Diagnostics，Berlin，Germany?；蛘?，該檢測法可以用合成或重組的P-NT1-117或其片段進(jìn)行校準(zhǔn)(同樣參見Ernst等，2006)。根據(jù)本發(fā)明的方法，用于確定對象患糖尿病和/或代謝綜合征的風(fēng)險或用于診斷對象中的代謝綜合征的閾值為高于78pmol/lPNT，優(yōu)選為100pmol/l，更優(yōu)選為150pmol/l，其中所述對象未患糖尿病。在具體實(shí)施方案中，所述閾值為約100pmol/l。這些閾值與上面提到的校準(zhǔn)方法相關(guān)。神經(jīng)降壓素原的值超過所述閾值，意味著該對象患糖尿病和/或代謝綜合征的風(fēng)險增加。糖尿病的定義如下：在基線檢查時具有內(nèi)科醫(yī)生診斷的病史、或在服用抗糖尿病藥物、或空腹全血血糖＞/＝6.1mmol/l(注意，這相當(dāng)于血漿中的7.0mmol/l)。前驅(qū)糖尿病，空腹血糖異常(IFG)：IFG＝空腹血漿葡萄糖為6.1-6.9mmol/l血壓正常/高血壓(HBP)的定義如下：HBP：收縮壓＞/＝140mmHg或舒張壓＞/＝90mmHg或在服用抗高血壓藥物。具有正常血壓(BP)的對象是所有其他對象，即收縮壓＜140mmHg或舒張壓＜90mmHg或沒有服用抗高血壓藥物的對象。在本發(fā)明方法的具體實(shí)施方案中，所述對象未患糖尿病且空腹血糖低于6.1mmol/l但高于5.4mmol/l。在本發(fā)明方法的具體實(shí)施方案中，所述對象的空腹血糖低于5.4mmol/l。在本發(fā)明方法的具體實(shí)施方案中，確定所述的對象患II型糖尿病的風(fēng)險。在本發(fā)明方法的具體實(shí)施方案中，通過另外確定并使用至少一種實(shí)驗(yàn)室參數(shù)或其他標(biāo)志物的水平來改進(jìn)對對象患糖尿病和/或代謝綜合征的風(fēng)險的預(yù)測或?qū)Υx綜合征的診斷，所述實(shí)驗(yàn)室參數(shù)或其他標(biāo)記物選自空腹血糖或空腹血漿葡萄糖、甘油三酯、HDL膽固醇或其亞組分、LDL膽固醇或其亞組分、胱抑素C、胰島素、CRP、血管升壓素或其前體或其片段、以及BNP或其前體或其片段。在本發(fā)明方法的具體實(shí)施方案中，另外確定了至少一種臨床參數(shù)，所述臨床參數(shù)選自年齡、性別、收縮壓、舒張壓、抗高血壓治療(AHT)、體質(zhì)指數(shù)、腰圍、腰臀比、目前為吸煙者、糖尿病遺傳性、以及先前的心血管疾病(CVD)。本發(fā)明的其他實(shí)施方案是根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的用于預(yù)測對象患糖尿病和/或代謝綜合征的風(fēng)險或用于診斷對象中的代謝綜合征的方法，其中所述對象未患糖尿病，其中神經(jīng)降壓素原或其片段的水平被單獨(dú)或與其他有預(yù)測用途的實(shí)驗(yàn)室或臨床參數(shù)聯(lián)合用于預(yù)測對象患糖尿病和/或代謝綜合征的風(fēng)險或用于診斷代謝綜合征，這是通過選自以下備選方案的方法實(shí)現(xiàn)的：-與明顯健康對象人群中全部預(yù)先確定的樣品中的神經(jīng)降壓素原或其片段水平的中位數(shù)進(jìn)行比較，-與明顯健康對象人群中全部預(yù)先確定的樣品中的神經(jīng)降壓素原或其片段水平的四分位數(shù)進(jìn)行比較，-基于Cox比例風(fēng)險分析進(jìn)行計(jì)算，或通過使用風(fēng)險指數(shù)計(jì)算例如NRI(凈重新分類指數(shù))或IDI(綜合鑒別指數(shù))進(jìn)行計(jì)算。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，樣品選自血液樣品、血清樣品、血漿樣品、腦脊液樣品、唾液樣品、和尿液樣品，或任一種前述樣品的提取物。在本發(fā)明方法的具體實(shí)施方案中，通過診斷檢測法、優(yōu)選通過免疫檢測法確定神經(jīng)降壓素原或其至少5個氨基酸長度的片段的水平。在本發(fā)明方法的具體實(shí)施方案中，所述方法被執(zhí)行超過一次，以便監(jiān)測患糖尿病和/或代謝綜合征的風(fēng)險，或以便監(jiān)測對象中的代謝綜合征的治療過程，其中所述對象未患糖尿病。在本發(fā)明方法的具體實(shí)施方案中，執(zhí)行所述監(jiān)測以便評估所述對象對所采取的預(yù)防性和/或治療性措施的響應(yīng)。在本發(fā)明方法的具體實(shí)施方案中，使用所述方法以便將所述對象分級成風(fēng)險組。本發(fā)明還包括用于執(zhí)行本發(fā)明的方法的裝置。因此，在該裝置中實(shí)施上文所述的檢測法。所述裝置是一種自動裝置，該裝置使得能夠測定所施加的生物發(fā)光和化學(xué)發(fā)光，正如上文中為本發(fā)明的檢測法所描述的。優(yōu)選地，所述裝置使得能夠進(jìn)行報(bào)告基因檢測、ATP監(jiān)測、發(fā)光免疫檢測(LIA)、酶測定、和細(xì)胞發(fā)光/氧化爆發(fā)。因此，按照本發(fā)明，該裝置可被稱為多模式光度計(jì)。該裝置的特征還在于，優(yōu)選被置于試管中的一種或多種樣品能夠以鏈?zhǔn)綔y定一次或連續(xù)測定多次，甚至能夠在很長的一段測試時間內(nèi)進(jìn)行測定。此外，本發(fā)明的裝置的特征在于珀?duì)柼鋮s檢測器、容積可變的注射器、管室中的溫度控制、以及還有控制所述裝置的軟件單元，所述軟件優(yōu)選地是TubeMaster。這樣的裝置的一個實(shí)例是AutolumatLB953多管光度計(jì)(BertholdTechnologiesGmbH&Co.KG，BadWildbad，Germany)。本發(fā)明還包括用于執(zhí)行本發(fā)明的方法的現(xiàn)場即時測試(poin-of-care)裝置。在所述現(xiàn)場即時測試裝置中實(shí)施如前所述的檢測法?，F(xiàn)場即時測試是通過使用可運(yùn)輸、便攜、且手持的儀器來完成的，所述儀器能夠執(zhí)行本發(fā)明的方法。因此，能夠在非常短的時間內(nèi)、在待檢查的對象所在位置處或附近進(jìn)行測定和各自的分析。本發(fā)明的現(xiàn)場即時測試裝置的特征在于免疫層析測量儀，該測量儀能夠檢測檢測法中所使用的結(jié)合物的至少一種可光學(xué)檢測的標(biāo)簽(標(biāo)記)。本發(fā)明還包括用于執(zhí)行本發(fā)明的方法的檢測法和/或試劑盒。檢測法如前所述，而用于執(zhí)行免疫檢測法的各自的試劑盒除了檢測法本身以外，還可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的慣用的輔助試劑例如緩沖液和洗滌液組成。在具體的實(shí)施方案中，除了本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的慣用的輔助試劑例如緩沖液和洗滌液以外，用于執(zhí)行本發(fā)明的檢測法的試劑盒還可以由以下成分組成，特別是i)第一免疫試劑，其包括被固定在固相(優(yōu)選為試管壁)上的針對人神經(jīng)降壓素原的部分序列的第一種特異性的結(jié)合物，在特定的實(shí)施方案中，所述第一種結(jié)合物是針對序列SEQIDNO：1至SEQIDNO：10中的任一個，ii)第二免疫試劑，其包括溶解和標(biāo)記形式(優(yōu)選地，第二抗體是通過化學(xué)發(fā)光標(biāo)記的)的針對人神經(jīng)降壓素原的部分序列的第二種特異性的結(jié)合物，在特定的實(shí)施方案中，所述第二種結(jié)合物是針對SEQIDNO：1至SEQIDNO：10中的任一個，條件是第二種結(jié)合物靶向與第一種結(jié)合物的靶向序列不同的序列，和iii)標(biāo)準(zhǔn)和校準(zhǔn)溶液，其含有確定的量的肽制品，所述肽制品具有所述第一和第二特異性抗體的結(jié)合位點(diǎn)。在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，用于執(zhí)行前述檢測法的裝置或試劑盒可以提供基于所述檢測法的現(xiàn)場即時測試，以預(yù)測患糖尿病和/或代謝綜合征的風(fēng)險或診斷對象中的代謝綜合征。本發(fā)明的主題也是神經(jīng)降壓素或神經(jīng)降壓素受體的結(jié)合物，所述結(jié)合物可用于預(yù)防或治療對象中的糖尿病和/或代謝綜合征。因此，在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了神經(jīng)降壓素或神經(jīng)降壓素受體的結(jié)合物，所述結(jié)合物可用于制備用于預(yù)防或治療對象中的糖尿病和/或代謝綜合征的藥物。在本發(fā)明的一個實(shí)施方案中，所述結(jié)合物使神經(jīng)降壓素的生物活性降低至70％或更低。根據(jù)本發(fā)明，神經(jīng)降壓素的結(jié)合物選自抗體例如典型的全長免疫球蛋白IgG、或包含至少重鏈和/或輕鏈的F可變結(jié)構(gòu)域的抗體片段例如化學(xué)偶聯(lián)的抗體(抗原結(jié)合片段)，包括但不限于Fab片段，包括Fab小型抗體、單鏈Fab抗體、帶有表位標(biāo)簽的單價Fab抗體例如Fab-V5Sx2；用CH3結(jié)構(gòu)域二聚化的雙價Fab(小型抗體)；雙價Fab或多價Fab，例如通過借助于異源結(jié)構(gòu)域多聚化而形成的，例如通過dHLX結(jié)構(gòu)域的二聚化而形成的，例如Fab-dHLX-FSx2；F(ab′)2片段，scFv片段，多聚化的多價或/和多特異性scFv片段，雙價和/或雙特異性雙抗體，(雙特異性T細(xì)胞橋聯(lián)抗體)，三官能抗體，多價抗體，例如來自與G不同的類型；單結(jié)構(gòu)域抗體，例如源自于駱駝或魚的免疫球蛋白的納米抗體。根據(jù)本發(fā)明，神經(jīng)降壓素受體的結(jié)合物選自抗體例如典型的全長免疫球蛋白IgG、或包含至少重鏈和/或輕鏈的F可變結(jié)構(gòu)域的抗體片段例如化學(xué)偶聯(lián)的抗體(抗原結(jié)合片段)，包括但不限于Fab片段，包括Fab小型抗體、單鏈Fab抗體、帶有表位標(biāo)簽的單價Fab抗體例如Fab-V5Sx2；用CH3結(jié)構(gòu)域二聚化的雙價Fab(小型抗體)；雙價Fab或多價Fab，例如通過借助于異源結(jié)構(gòu)域多聚化而形成的，例如通過dHLX結(jié)構(gòu)域的二聚化而形成的，例如Fab-dHLX-FSx2；F(ab′)2片段，scFv片段，多聚化的多價或/和多特異性scFv片段，雙價和/或雙特異性雙抗體，(雙特異性T細(xì)胞橋聯(lián)抗體)，三官能抗體，多價抗體，例如來自與G不同的類型；單結(jié)構(gòu)域抗體，例如源自于駱駝或魚的免疫球蛋白的納米抗體，或肽類拮抗劑例如[D-Trp11]-神經(jīng)降壓素、[Tyr(Me)11]-神經(jīng)降壓素(例如由Quiron等描述的)，或非肽類拮抗劑，例如左卡巴斯汀、SR-48692(NTS1選擇性)、SR-142948(非選擇性)、SR-142948A、CP96345、[3H]SR-48692、SR48692、SR-48527和SR-49711，或結(jié)合物骨架(scaffold)例如基于四連接素的非Ig骨架(例如US2010/0028995中所描述的)、纖連蛋白骨架(例如EP1266025中所描述的)、基于脂質(zhì)運(yùn)載蛋白的骨架(例如WO2011/154420中所描述的)、泛素骨架(例如WO2011/073214中所描述的)、轉(zhuǎn)移骨架(transferringscaffold)(例如US2004/0023334中所描述的)、蛋白A骨架(例如EP2231860中所描述的)、基于錨蛋白重復(fù)域的骨架(例如WO2010/060748中所描述的)、微量蛋白(microprotein)(優(yōu)選為形成半胱氨酸結(jié)的微量蛋白)骨架(例如EP2314308中所描述的)、基于FynSH3結(jié)構(gòu)域的骨架(例如WO2011/023685中所描述的)、基于EGFR-A結(jié)構(gòu)域的骨架(例如WO2005/040229中所描述的)和基于Kunitz結(jié)構(gòu)域的骨架(例如EP1941867中所描述的)。實(shí)施例實(shí)施例1抗體的制備用于免疫的肽/偶合物合成了用于免疫的肽(JPTTechnologies，Berlin，Germany)，所述肽具有額外的N端半胱氨酸殘基以將所述肽與牛血清白蛋白(BSA)偶合。通過使用Sulfo-SMCC(Perbio-science，Bonn，Germany)將所述肽與BSA共價偶聯(lián)。根據(jù)Perbio的手冊執(zhí)行偶聯(lián)步驟。標(biāo)記的抗體(LA)肽(P-NT1-19)：H-CSDSEEEMKALEADFLTNMH-NH2固相抗體(SPA)肽(P-NT44-62)：H-CNLNSPAEETGEVHEEELVA-NH2按照如下方法生成抗體：將BALB/c小鼠用100μg肽-BSA偶合物于第0天和第14天進(jìn)行免疫(被乳化在100μl完全弗氏佐劑中)，并用50μg于第21天和第28天進(jìn)行免疫(在100μl不完全弗氏佐劑中)。在執(zhí)行融合實(shí)驗(yàn)前3天，通過一次腹腔內(nèi)注射和一次靜脈內(nèi)注射給予，動物接受50μg溶解在100μl鹽水中的偶合物。用1mL50％聚乙二醇將來自免疫后小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞系SP2/0的細(xì)胞在37℃下融合30秒。在洗滌后，將細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。通過在HAT培養(yǎng)基(補(bǔ)充有20％胎牛血清和HAT補(bǔ)充物的RPMI1640培養(yǎng)基)中生長來選擇出雜交克隆。在兩周之后，HAT培養(yǎng)基被替換成HT培養(yǎng)基用于傳代3次，然后返回到正常的細(xì)胞培養(yǎng)基中。在融合后3周時，對細(xì)胞培養(yǎng)上清中的抗原特異性IgG抗體進(jìn)行初次篩選。測試為陽性的微量培養(yǎng)物被轉(zhuǎn)移到24孔板中進(jìn)行增殖。在再次測試之后，用有限稀釋技術(shù)將所選擇的培養(yǎng)物克隆化和再克隆化，并確定亞型。(Lane，R.D.“用于提高分泌單克隆體的雜交瘤的生產(chǎn)的短時間聚乙二醇融合技術(shù)(Ashort-durationpolyethyleneglycolfusiontechniqueforincreasingproductionofmonoclonalantibody-secretinghybridomas)”，J.Immuμnol.Meth.81：223-228；(1985)；Ziegler，B.等“通過細(xì)胞熒光計(jì)和單克隆GAD抗體的補(bǔ)體依賴性抗體介導(dǎo)的細(xì)胞毒性進(jìn)行檢驗(yàn)時，不能在大鼠胰島細(xì)胞的表面上檢測到谷氨酸脫羧酶(GAD)(Glutamatedecarboxylse(GAD)isnotdetectableonthesurfaceofratisletcellsexaminedbycytofluorometryandcomplement-dependentantibody-mediatedcytotoxicityofmonoclonalGADantibodies)”，Horm.Metab.Res.28：11-15，(1996))。單克隆抗體的產(chǎn)生通過標(biāo)準(zhǔn)抗體生產(chǎn)方法(Marx等，MonoclonalAntibodyProduction，ATLA25，121，1997)產(chǎn)生抗體，并通過蛋白質(zhì)A-層析法進(jìn)行純化。根據(jù)SDS凝膠電泳分析，抗體的純度為＞95％。實(shí)施例2用于定量人神經(jīng)降壓素原的免疫檢測法使用的技術(shù)是基于吖啶酯標(biāo)記的夾心包被管發(fā)光免疫檢測法。標(biāo)記的復(fù)合物(示蹤劑)：將100μg(100μl)LA(1mg/ml溶于PBS，pH7.4)與10μl吖啶NHS酯(1mg/ml溶于乙腈，InVentGmbH，Germany)(EP0353971)混合并在室溫下孵育20分鐘。將標(biāo)記的LA在Bio-SilSEC400-5(Bio-RadLaboratories，Inc.，USA)上通過凝膠過濾HPLC進(jìn)行純化。純化的LA被稀釋在(300mmol/l磷酸鉀、100mmol/lNaCl、10mmol/lNa-EDTA、5g/l牛血清白蛋白，pH7.0)中。終濃度約為每200μl含800.000相對光單位(RLU)的標(biāo)記的復(fù)合物(約20ng標(biāo)記的抗體)。用AutoLumatLB953(BertholdTechnologiesGmbH&Co.KG)測定吖啶酯化學(xué)發(fā)光。固相：用SPA(1.5μgSPA/0.3ml100mmol/lNaCl、50mmol/lTris-HCl，pH7.8)包被聚苯乙烯管(GreinerBio-OneInternationalAG，Austria)(室溫下18小時)。在用5％牛血清白蛋白封閉之后，將所述管用pH7.4的PBS洗滌并真空干燥。校準(zhǔn)用含P-NT的人血清稀釋液對檢測法進(jìn)行校準(zhǔn)。將所集中的具有高P-NT免疫反應(yīng)性的人血清(InVentDiagostika，Henningsdorf，Germany)用馬血清(BiochromAG，Deutschland)進(jìn)行稀釋(檢測標(biāo)準(zhǔn)品)。用人P-NT校準(zhǔn)品(ICI-Diagnostics，Berlin，Germany)對該標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行校準(zhǔn)?；蛘?，該檢測法可以用合成或重組的p-NT1-117或其片段進(jìn)行校準(zhǔn)(同樣參見Ernst等，2006)。P-NT免疫檢測法：用移液器將50μl樣品(或校準(zhǔn)品)吸到SPA包被的管中，在加入標(biāo)記的LA(200μl)之后，將所述管在18-25℃下孵育16-22小時。通過用洗滌液(20mMPBS，pH7.4，0.1％TritonX-100)洗滌5次(每次1ml)以去除未結(jié)合的示蹤劑。用LB953測定管結(jié)合的LA。圖1示出了典型的P-NT劑量/信號曲線。實(shí)施例3群體研究我們測定了來自4362名參與者(平均年齡58±6歲，女性占59％)的空腹血漿中的P-NT，這些參與者屬于于1991-1994年接受馬爾默飲食與癌癥研究的基線檢查的人群。我們用多變量調(diào)整(所有傳統(tǒng)的心血管危險因素，糖尿病危險因素，并且在癌癥分析中還有癌癥的遺傳性)后的Cox比例風(fēng)險模型來將基線P-NT(與log轉(zhuǎn)換后的P-NT每增加一個標(biāo)準(zhǔn)偏差對應(yīng)的風(fēng)險比率)與發(fā)生每個研究終點(diǎn)的第一次事件的時間相關(guān)聯(lián)，中位隨訪時間超過12年。終點(diǎn)是通過瑞典國家醫(yī)院出院登記處、瑞典心肌梗死登記處、馬爾默卒中登記處和瑞典癌癥登記處檢索到的。通過這些登記處檢索到的終點(diǎn)是經(jīng)過驗(yàn)證的并發(fā)現(xiàn)是準(zhǔn)確的。表1總研究人群的臨床特征描述性統(tǒng)計(jì)表2性別表3問卷+日記記錄：根據(jù)問卷或日記記錄本得到的基線時的抗高血壓治療(C02、C03、C07、C08、C09)表4糖尿病(空腹血糖＞6.0或者問卷調(diào)查后為糖尿病)表5目前為吸煙者表6研究中女性的臨床特征描述性統(tǒng)計(jì)表7問卷+日記記錄：根據(jù)問卷或日記記錄本得到的基線時的抗高血壓治療(C02、C03、C07、C08、C09)表8糖尿病(空腹血糖＞6.0或者問卷調(diào)查后為糖尿病)表9目前為吸煙者表10研究中男性的臨床特征描述性統(tǒng)計(jì)表11問卷+日記記錄：根據(jù)問卷或日記記錄本得到的基線時的抗高血壓治療(C02、C03、C07、C08、C09)表12糖尿病(空腹血糖＞6.0或者問卷調(diào)查后為糖尿病)表13目前為吸煙者表14所有人中PNT的四分位數(shù)：PNT(pmol/l)表15女性中PNT的四分位數(shù)：PNT(pmol/l)在示出的所有女性亞組分析中，四分位數(shù)濃度幾乎相同。表16男性中PNT的四分位數(shù)：PNT(pmol/l)在示出的所有男性亞組分析中，四分位數(shù)濃度幾乎相同。P-NT和糖尿病的預(yù)測在基線時未患有糖尿病的對象中，142人在平均隨訪時間為12.7±2.2年的過程中患上新發(fā)糖尿病。在調(diào)整了所有糖尿病危險因素(年齡，性別，抗高血壓治療，收縮壓，體質(zhì)指數(shù)，腰圍，吸煙，先前的心血管疾病，以及血液葡萄糖、甘油三酯、胰島素、HDL和LDL的空腹?jié)舛?的基線水平后，對于新發(fā)糖尿病的風(fēng)險而言，基線P-NT每增加一個標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)就賦予風(fēng)險比率(95％可信區(qū)間)1.28(1.09-1.50)(P＝0.003)。在未患前驅(qū)糖尿病(空腹血糖異常，IFG)的對象的亞組中，P-NT每增加1SD，糖尿病事件的風(fēng)險比率進(jìn)一步增加1.48(1.17-1.86)(P＝0.001)。P-NT獨(dú)立地與新發(fā)糖尿病相關(guān)。表17總?cè)巳?男性和女性)表18僅女性方程中的變量ba.由于常量或線性相關(guān)的協(xié)變量，自由度降低b.常量或線性相關(guān)的協(xié)變量性別＝2；在基線時沒有空腹血糖異常和糖尿病的對象中，68人在隨訪期間患上新發(fā)糖尿病，在全面調(diào)整了糖尿病危險因素后，對于在整個人群中的新發(fā)糖尿病風(fēng)險而言，P-NT每增加一個SD就伴有1.48(1.17-1.87)(P＝0.001)的風(fēng)險比率，在女性中為1.47(1.08-2.00)(P＝0.014)，而在男性中為1.56(1.08-2.27)(P＝0.019)。當(dāng)將所有糖尿病危險因素輸入到多變量Cox回歸模型中時，只有空腹血糖的基線水平具有比P-NT更強(qiáng)的與新發(fā)糖尿病的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性。圖2：糖尿病預(yù)測的KaplanMeier分析2a)所有未患糖尿病的對象采用中位數(shù)截止值(cutoff)(104.6pmol/l)2b)所有未患糖尿病和前驅(qū)糖尿病(IFG)的對象，截止值，(104.6pmol/l)亞組分析在方程中使用相同的變量，我們研究了用于預(yù)測糖尿病的不同的亞組，在基線時患有糖尿病的對象被排除。表19P-NT顯著地預(yù)示著糖尿病的發(fā)展。P-NT的預(yù)測能力在沒有IFG(前驅(qū)糖尿病)的對象中更強(qiáng)。當(dāng)前第1頁1 2 3 當(dāng)前第1頁1 2 3