本發(fā)明涉及非線性顯微鏡及非線性觀察方法。

背景技術(shù)：
近年，生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的勢頭迅猛，特別是以生物試樣作為觀察對(duì)象的3維分解顯微鏡的需求持續(xù)提高。其中，空間分辨率高的共焦顯微鏡迄今為止被廣泛使用。傳統(tǒng)的共焦顯微鏡觀測生物試樣所包含的熒光分子相對(duì)于照射光的強(qiáng)度以線性強(qiáng)度發(fā)出的熒光（在線性光學(xué)過程中發(fā)出的信號(hào)），但是，近年來，觀測生物試樣所包含的特定種類的分子相對(duì)于照射光的強(qiáng)度以非線性強(qiáng)度發(fā)出的光（在非線性光學(xué)過程中發(fā)出的信號(hào)）的非線性顯微鏡持續(xù)受到關(guān)注。非線性顯微鏡采用長波比較長的光（例如近紅外線）作為照射光，因此，能夠觀察到試樣的深部。另外，上述非線性過程僅僅在物鏡的焦點(diǎn)附近的微小區(qū)域發(fā)生，因此，非線性顯微鏡獲取的圖像成為極薄層圖像（切片圖像），在這樣的非線性顯微鏡之一中，有利用相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）作為非線性過程的CARS顯微鏡（參照專利文獻(xiàn)1等）。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1：特開2009-47435號(hào)公報(bào)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
發(fā)明要解決的課題但是，傳統(tǒng)的CARS顯微鏡中，存在光軸方向（z方向）的分辨率比與光軸垂直的面內(nèi)方向（xy方向）的分辨率低的問題。因而，本發(fā)明目的是提供能夠提高光軸方向的分辨率的非線性顯微鏡及非線性觀察方法。用于解決課題的技術(shù)方案本發(fā)明的非線性顯微鏡的一個(gè)形態(tài)，具備：照明單元，將從光源供給的照明光會(huì)聚在被觀察物上，在該會(huì)聚點(diǎn)發(fā)生相干的非線性光學(xué)過程；檢測單元，接受上述會(huì)聚點(diǎn)處的在上述非線性光學(xué)過程中發(fā)生的相干的物體光，生成表示該受光部中的光強(qiáng)度的信號(hào)；以及控制單元，一邊在上述會(huì)聚點(diǎn)掃描上述被觀察物中的被觀察面，一邊反復(fù)獲取上述檢測單元生成的信號(hào)，計(jì)測上述被觀察面上的上述信號(hào)的分布；從上述光源朝向上述被觀察物的上述照明光的光程和從上述被觀察物朝向上述受光部的上述物體光的光程的至少一方被雙重化為一對(duì)光程，這一對(duì)光程的關(guān)系設(shè)定成相對(duì)于上述被觀察面對(duì)稱關(guān)系。另外，本發(fā)明的非線性顯微鏡的一個(gè)形態(tài)，具備：光束分離器，將從光源供給的照明光的光程分支為一對(duì)光程；一對(duì)偏轉(zhuǎn)鏡，使上述一對(duì)光程向被觀察物中的被觀察面的相互相反側(cè)分別偏轉(zhuǎn)；一對(duì)物鏡，對(duì)上述一對(duì)光程分別配置，將焦點(diǎn)配置在上述被觀察面的共同位置；分色鏡，配置在上述一對(duì)光程的共同部分，使上述一對(duì)物鏡的會(huì)聚點(diǎn)處的在非線性光學(xué)過程中發(fā)生的相干的物體光從上述照明光分離；檢測單元，接受由上述分色鏡分離的上述物體光，生成表示該受光部處的光強(qiáng)度的信號(hào)；以及控制單元，一邊在上述會(huì)聚點(diǎn)掃描上述被觀察面，一邊反復(fù)獲取上述檢測單元生成的信號(hào)，計(jì)測上述被觀察面上的上述信號(hào)的分布。另外，本發(fā)明的非線性觀察方法的一個(gè)形態(tài)，包含：照明步驟，將從光源供給的照明光會(huì)聚在被觀察物上，在該會(huì)聚點(diǎn)發(fā)生相干的非線性光學(xué)過程；檢測步驟，接受上述會(huì)聚點(diǎn)處的在上述非線性光學(xué)過程中發(fā)生的相干的物體光，生成表示該受光部處的光強(qiáng)度的信號(hào)；以及控制步驟，一邊在上述會(huì)聚點(diǎn)掃描上述被觀察物中的被觀察面，一邊反復(fù)獲取上述檢測步驟生成的信號(hào)，計(jì)測上述被觀察面上的上述信號(hào)的分布；從上述光源朝向上述被觀察物的上述照明光的光程和從上述被觀察物朝向上述受光部的上述物體光的光程的至少一方被雙重化為一對(duì)光程，這一對(duì)光程的關(guān)系設(shè)定成相對(duì)于上述被觀察面對(duì)稱關(guān)系。發(fā)明的效果根據(jù)本發(fā)明，可實(shí)現(xiàn)能夠提高光軸方向的分辨率的非線性顯微鏡及非線性觀察方法。附圖說明圖1是本實(shí)施例的CARS顯微鏡的構(gòu)成圖（兩側(cè)激勵(lì)·兩側(cè)檢測模式）。圖2是說明CARS過程及非共振過程的圖。圖3是說明兩側(cè)激勵(lì)·單側(cè)檢測模式的圖。圖4是說明單側(cè)激勵(lì)·兩側(cè)檢測模式的圖。圖5是說明透射觀察模式的圖。圖6是說明反射觀察模式的圖。圖7是對(duì)每個(gè)模式表示能夠從觀察對(duì)象物向頻譜檢測器27側(cè)傳遞的構(gòu)造的空間頻率域（傳遞域）的圖。具體實(shí)施方式[第1實(shí)施例]以下，說明本發(fā)明的第1實(shí)施例。本實(shí)施例是CARS顯微鏡的實(shí)施例。圖1是本實(shí)施例的CARS顯微鏡的構(gòu)成圖。圖1的上部是表示CARS顯微鏡的光源側(cè)的構(gòu)成的圖，圖1的下部是表示CARS顯微鏡的試樣側(cè)的構(gòu)成的圖。如圖1的上部所示，在本實(shí)施例的CARS顯微鏡上，具備激光源11和激勵(lì)脈沖光生成部12。另外，如圖1的下部所示，在本實(shí)施例的CARS顯微鏡上，還具備：分色鏡14；光掃描器15；中繼光學(xué)系統(tǒng)（透鏡16A，16B）；可動(dòng)的光束分離器17；可動(dòng)的波長選擇濾波器22r；全反射鏡18；物鏡19；透明培養(yǎng)容器10；物鏡20；可動(dòng)的全反射鏡21；可動(dòng)的波長選擇濾波器22t；光束分離器23A；拍攝元件23B；會(huì)聚透鏡25；分光器26；頻譜檢測器27；和控制部28。另外，培養(yǎng)容器10是由透射型的試樣臺(tái)（未圖示）支撐的透明容器，在培養(yǎng)容器10的內(nèi)部容納有包含生物細(xì)胞的透明培養(yǎng)液。該生物細(xì)胞所包含的分子（蛋白質(zhì)、脂肪等）成為CARS顯微鏡的觀察對(duì)象。以下，這些分子稱為“觀察對(duì)象分子”。激光源11是振蕩脈沖激光的脈沖激光源，激光源振蕩的脈沖激光的脈沖形狀設(shè)定成適當(dāng)?shù)男螤睢Ｍㄟ^該設(shè)定，后述的光斑S1的中心部分（高密度光斑）的能量密度成為適合于在觀察對(duì)象分子發(fā)生CARS信號(hào)的能量密度。從該激光源11出射的脈沖激光向激勵(lì)脈沖光生成部12入射。在激勵(lì)脈沖光生成部12中，具備：透鏡12A；光束分離器12B；可動(dòng)的全反射鏡12C；可動(dòng)的全反射鏡12D；透鏡12F；光子晶體光纖12G；透鏡12H；波長選擇濾波器12J；光束分離器12E。向激勵(lì)脈沖光生成部12入射的脈沖激光，通過穿過透鏡12A而成為粗徑的平行光束，向光束分離器12B入射，分支為透射過光束分離器12B的脈沖激光L1和由光束分離器12B反射的脈沖激光L1（另外，圖1中，對(duì)具有相互相同光頻率的光附加相互相同的符號(hào)。首先，透射過了光束分離器12B的脈沖激光L1經(jīng)由透鏡12F向光子晶體光纖12G的一端入射。在光子晶體光纖12G內(nèi)，在脈沖激光L1的傳播過程中引起自相位調(diào)制等的非線性現(xiàn)象，從而，脈沖激光L1因相干而變換為光頻率帶域廣的脈沖激光。從而，從光子晶體光纖12G的另一端出射白色相干脈沖光L2。該白色相干脈沖光L2通過在透鏡12H穿過而成為粗徑的平行光束，經(jīng)由波長選擇濾波器12J向光束分離器12E入射。另一方面，由光束分離器12B反射的脈沖激光L1順序由全反射鏡12C、全反射鏡12D反射后向光束分離器12E入射，在該光束分離器12E上，與白色相干脈沖光L2合成為同軸。另外，全反射鏡12C、12D的全體能夠向圖1的箭頭的方向移動(dòng)，通過該移動(dòng)，調(diào)節(jié)向光束分離器12E入射的脈沖激光L1的光程長和向光束分離器12E入射的白色相干脈沖光L2的光程長的差。通過該調(diào)節(jié)，使脈沖激光L1向光束分離器12E入射的定時(shí)和白色相干脈沖光L2向光束分離器12E入射的定時(shí)一致。另外，向白色相干脈沖光L2的單獨(dú)光程配置的波長選擇濾波器12J的特性設(shè)定成，在白色相干脈沖光L2所包含的多個(gè)光頻率分量中僅僅使光頻率比脈沖激光L1低的分量通過的特性。因此，向光束分離器12E入射的白色相干脈沖光L2所包含的全部的光頻率分量的光頻率設(shè)定為比向光束分離器12E入射的脈沖激光L1的光頻率低。這樣，光程及定時(shí)一致且在光頻率上設(shè)有差異的脈沖激光L1及白色相干脈沖光L2被用作CARS顯微鏡的激勵(lì)光。以下，將這樣的脈沖激光L1及白色相干脈沖光L2合稱為“激勵(lì)脈沖光L1、L2”。從圖1上部的光束分離器12E出射的激勵(lì)脈沖光L1、L2透射過圖1的下部所示的分色鏡14，經(jīng)由光掃描器15向透鏡16A入射。向透鏡16A入射的激勵(lì)脈沖光L1、L2由透鏡16A會(huì)聚后再次發(fā)散，在透射過光束分離器23A后向透鏡16B入射。該激勵(lì)脈沖光L1、L2由透鏡16B形成平行光束，向光束分離器17入射。另外，透鏡16A和透鏡16B之間的激勵(lì)脈沖光L1、L2的會(huì)聚面（虛線）是后述觀察對(duì)象面10A的共軛面。這里，比光束分離器17更靠試樣側(cè)的部分構(gòu)成為可切換，通過該切換，本實(shí)施例的CARS顯微鏡的模式在以下的5個(gè)模式間切換。（a）兩側(cè)激勵(lì)·兩側(cè)檢測模式：從培養(yǎng)容器10的兩側(cè)向培養(yǎng)容器10照射激勵(lì)脈沖光、且檢測向培養(yǎng)容器10的兩側(cè)出射的白色CARS信號(hào)彼此的干涉強(qiáng)度的模式。（b）兩側(cè)激勵(lì)·單側(cè)檢測模式：從培養(yǎng)容器10的兩側(cè)向培養(yǎng)容器10照射激勵(lì)脈沖光、且檢測向培養(yǎng)容器10的單側(cè)出射的白色CARS信號(hào)的模式。（c）單側(cè)激勵(lì)·兩側(cè)檢測模式：從培養(yǎng)容器10的單側(cè)向培養(yǎng)容器10照射激勵(lì)脈沖光、且檢測向培養(yǎng)容器10的兩側(cè)出射的白色CARS信號(hào)彼此的干涉強(qiáng)度的模式。（d）透射觀察模式：從培養(yǎng)容器10的一側(cè)向培養(yǎng)容器10照射激勵(lì)脈沖光、且檢測向培養(yǎng)容器10的另一側(cè)出射的白色CARS信號(hào)的模式。（e）反射觀察模式：從培養(yǎng)容器10的一側(cè)向培養(yǎng)容器10照射激勵(lì)脈沖光、且檢測向培養(yǎng)容器10的同側(cè)出射的白色CARS信號(hào)的模式。（兩側(cè)激勵(lì)·兩側(cè)檢測模式）首先，說明兩側(cè)激勵(lì)·兩側(cè)檢測模式。該模式中，如圖1的下部所示，波長選擇濾波器22t、波長選擇濾波器22r離開光程，光束分離器17被插入光程。因此，向光束分離器17入射的激勵(lì)脈沖光L1、L2分支為透射過光束分離器17的激勵(lì)脈沖光L1、L2和由光束分離器17反射的激勵(lì)脈沖光L1、L2。首先，透射過了光束分離器17的激勵(lì)脈沖光L1、L2，在由全反射鏡18反射后向物鏡19入射時(shí)，受到物鏡19的會(huì)聚作用，向物鏡19的焦點(diǎn)會(huì)聚。另一方面，由光束分離器17反射的激勵(lì)脈沖光，在由全反射鏡21反射后向物鏡20入射時(shí)，受到物鏡20的會(huì)聚作用，向物鏡20的焦點(diǎn)會(huì)聚。這里，物鏡19和物鏡20具有相互相同焦距、相互相同NA。另外，物鏡19的焦平面和物鏡20的焦平面與培養(yǎng)容器10的深部中的觀察對(duì)象面10A一致。另外，物鏡19的觀察對(duì)象面10A上的會(huì)聚點(diǎn)和物鏡20的觀察對(duì)象面10A上的焦點(diǎn)一致。從而，從物鏡19側(cè)朝向培養(yǎng)容器10的激勵(lì)脈沖光L1、L2和從物鏡20側(cè)朝向培養(yǎng)容器10的激勵(lì)脈沖光L1、L2在觀察對(duì)象面10A上的相同位置形成光斑S18。而且，從光束分離器17經(jīng)由全反射鏡21及物鏡20朝向觀察對(duì)象面10A的激勵(lì)脈沖光L1、L2的光程長和從光束分離器17經(jīng)由全反射鏡18及物鏡19朝向觀察對(duì)象面10A的激勵(lì)脈沖光L1、L2的光程長一致。即，該模式中，朝向培養(yǎng)容器10的激勵(lì)脈沖光L1、L2的光程雙重化為一對(duì)光程，這一對(duì)光程的關(guān)系設(shè)定成相對(duì)于觀察對(duì)象面10A為對(duì)稱的關(guān)系。因此，該模式中，觀察對(duì)象面10A的1點(diǎn)（光斑S1的形成部位）從觀察對(duì)象面10A的兩側(cè)由激勵(lì)脈沖光L1、L2同時(shí)照射。光斑S1的中心部分（高密度光斑）中，發(fā)生白色CARS信號(hào)Lr。該白色CARS信號(hào)Lr有向物鏡19側(cè)出射的白色CARS信號(hào)Lr和向物鏡20側(cè)出射的白色CARS信號(hào)Lr。從高密度光斑朝向物鏡20的白色CARS信號(hào)Lr穿過物鏡20，由全反射鏡21反射后，向光束分離器17入射。另一方面，從高密度光斑朝向物鏡19的白色CARS信號(hào)Lr穿過物鏡19，由全反射鏡18反射后，向光束分離器17入射，與從物鏡20側(cè)到達(dá)的白色CARS信號(hào)Lr合成為同軸。這里，該模式中，從培養(yǎng)容器10出射的白色CARS信號(hào)Lr的光程被雙重化為一對(duì)光程，這一對(duì)光程的關(guān)系設(shè)定成相對(duì)于觀察對(duì)象面10A為對(duì)稱關(guān)系。另外，在這一對(duì)光程中分別行進(jìn)的一對(duì)白色CARS信號(hào)Lr為可干涉。因此，該模式中，從觀察對(duì)象面10A的1點(diǎn)（光斑S1的形成部位）向兩側(cè)出射的一對(duì)白色CARS信號(hào)Lr由光束分離器17合成，相互干涉。向光束分離器17入射的一對(duì)白色CARS信號(hào)Lr（以下，簡稱白色CARS信號(hào)Lr。）經(jīng)由透鏡16B、光束分離器23A、透鏡16A、光掃描器15，向分色鏡14入射。分色鏡14的特性設(shè)定成反射白色CARS信號(hào)Lr且使激勵(lì)脈沖光L1、L2透射的特性。因此，向分色鏡14入射的白色CARS信號(hào)Lr由分色鏡14反射。另外，從光斑S1出射的能夠到達(dá)分色鏡14的光中，不僅是這些白色CARS信號(hào)Lr，也包含透射過培養(yǎng)容器10或者由培養(yǎng)容器10反射的激勵(lì)脈沖光L1、L2。但是，該激勵(lì)脈沖光L1、L2不同于白色CARS信號(hào)Lr，透射過分色鏡14。因此，由分色鏡14反射的白色CARS信號(hào)Lr不與激勵(lì)脈沖光L1、L2混合，由會(huì)聚透鏡25會(huì)聚，向分光器26入射。另外，在分光器26的入射口（狹縫）前的白色CARS信號(hào)Lr的會(huì)聚點(diǎn)，設(shè)置有針孔。向分光器26的內(nèi)部入射的白色CARS信號(hào)Lr由未圖示的衍射光柵分離為多個(gè)波長分量（多個(gè)光頻率分量），這些波長分量向由線性傳感器等組成的頻譜檢測器27的各傳感器部分別入射。因此，向分光器26的內(nèi)部入射的白色CARS信號(hào)Lr由分光器26及頻譜檢測器27變換為頻譜信號(hào)。由頻譜檢測器27生成的頻譜信號(hào)被獲取到控制部28。這里，光掃描器15是配置了一對(duì)檢流計(jì)反射鏡等的光掃描器，驅(qū)動(dòng)光掃描器15時(shí)，前述的光斑S110在觀察對(duì)象面10A上移動(dòng)。因此，控制部28通過驅(qū)動(dòng)光掃描器15，由光斑S1在觀察對(duì)象面10A上進(jìn)行二維掃描，同時(shí)通過在光斑S1處于各掃描位置時(shí)從頻譜檢測器27獲取輸出信號(hào)，獲取觀察對(duì)象面10A的各位置處的白色CARS信號(hào)的頻譜，即CARS頻譜分布。該CARS頻譜分布表示觀察對(duì)象物（觀察對(duì)象位置）的振動(dòng)模式分布。這里，詳細(xì)說明在高密度光斑發(fā)生白色CARS信號(hào)的原理。說明時(shí)，將激勵(lì)脈沖光L1、L2的一方即脈沖激光L1的光頻率設(shè)為ω1，將激勵(lì)脈沖光L1、L2的另一方即白色相干脈沖光L2所包含的各光頻率分量L21、L22、L23、L24、…的光頻率設(shè)為ω21、ω22、ω23、ω24、…。此時(shí)，存在于高密度光斑的觀察對(duì)象分子中，具有滿足ωv1=ω1-ω21的式的固有頻率ωv1的部分，發(fā)生具有光頻率ωr1=2ω1-ω21的CARS信號(hào)。另外，具有滿足ωv2=ω1-ω22的式的固有頻率ωv2的部分，發(fā)生具有光頻率ωr2=2ω1-ω22的CARS信號(hào)。另外，具有滿足ωv3=ω1-ω23的式的固有頻率ωv3的部分，發(fā)生具有光頻率ωr3=2ω1-ω23的CARS信號(hào)。另外，具有滿足ωv4=ω1-ω24的式的固有頻率ωv4的部分，發(fā)生具有光頻率ωr4=2ω1-ω24的CARS信號(hào)。即，本實(shí)施例的CARS顯微鏡中，激勵(lì)脈沖光L1、L2的一方采用白色相干脈沖光L2，因此，由高密度光斑發(fā)生的CARS信號(hào)成為光頻率不同的多個(gè)CARS信號(hào)，即白色CARS信號(hào)。這里，關(guān)注白色相干脈沖L2所包含的一個(gè)光頻率分量L2i，詳細(xì)說明利用該光頻率分量L2i的CARS過程。如圖2的左側(cè)所示，具有光頻率ω1的脈沖激光L1和具有光頻率ω2i的光頻率分量L2i發(fā)生具有光頻率（ω1-ω2i）的節(jié)拍，但是觀察對(duì)象分子的某些部分的固有頻率ωvi等于該節(jié)拍的光頻率（ω1-ω2i），因此，該部分與節(jié)拍共振，轉(zhuǎn)移到激勵(lì)狀態(tài)。然后，在對(duì)成為激勵(lì)狀態(tài)的部分照射具有光頻率ω1的脈沖激光L1時(shí)，該部分向具有與（ωvi+ω1）相當(dāng)?shù)哪芰康闹虚g狀態(tài)轉(zhuǎn)移。然后，中間狀態(tài)的部分向基態(tài)轉(zhuǎn)移時(shí)，發(fā)生具有光頻率ωri=2ω1-ω2i的CARS信號(hào)。順便說一下，根據(jù)該CARS過程，在高密度光斑可發(fā)生的CARS信號(hào)的振幅分布（=觀察對(duì)象分子的密度均勻時(shí)CARS信號(hào)在觀察對(duì)象面上形成的振幅分布）用以下的式表達(dá)。其中，該式中的是脈沖激光L1在觀察對(duì)象面上形成的點(diǎn)像振幅分布，是光頻率分量L2i在觀察對(duì)象面上形成的點(diǎn)像振幅分布。這里，說明背景噪聲。高密度光斑中，不僅共振過程的1種即CARS過程，還可發(fā)生非共振過程。該非共振過程往往由培養(yǎng)液中及細(xì)胞中的水分子引起，是成為背景噪聲的原因的過程。由水分子引起的非共振過程如下發(fā)生。即，如圖2的右側(cè)所示，水分子由具有光頻率ω1的脈沖激光L1激勵(lì)為2個(gè)光子，可能向具有與2×ω1相當(dāng)?shù)哪芰康闹虚g狀態(tài)轉(zhuǎn)移。然后，中間狀態(tài)的水分子向基態(tài)轉(zhuǎn)移時(shí)，出射被光頻率分量L2i感應(yīng)而具有與光頻率分量L2i相同光頻率ω2i的光和具有與由脈沖激光L1及光頻率分量L2i引起的CARS信號(hào)相同光頻率ωri的光。這些光從培養(yǎng)容器10出射后，能夠到達(dá)分色鏡14為止。其中，具有光頻率ω2i的光不由分色鏡14反射，因此不入射到頻譜檢測器27，而具有光頻率ωri的光由分色鏡14反射，入射到頻譜檢測器27。而且，以上的現(xiàn)象可在光頻率ω2i不同的多個(gè)光頻率分量L2i（i=1，2，3，…）的各處發(fā)生。因而，可認(rèn)為在控制部28獲取的CARS頻譜分布上重疊了各種光頻率的背景噪聲。但是，由于非共振過程和CARS過程的差異，有在背景噪聲和CARS信號(hào)之間必然錯(cuò)開相位π/2的特征。從而，控制部28通過對(duì)前述CARS頻譜分布實(shí)施基于該特征的運(yùn)算，能夠從該CARS頻譜分布除去各種光頻率的背景噪聲。因此，控制部28能夠獲取不含背景噪聲的CARS頻譜分布。以上，本實(shí)施例的CARS顯微鏡中，朝向培養(yǎng)容器10的激勵(lì)脈沖光L1、L2的光程和從培養(yǎng)容器10出射的白色CARS信號(hào)Lr的光程的雙方雙重化為一對(duì)光程，這一對(duì)光程的關(guān)系設(shè)定成相對(duì)于觀察對(duì)象面10A對(duì)稱關(guān)系。因此，本實(shí)施例的CARS顯微鏡能夠設(shè)定成兩側(cè)激勵(lì)·兩側(cè)檢測模式。另外，本實(shí)施例的CARS顯微鏡中，光束分離器17的姿勢可變。通過該姿勢調(diào)節(jié)，能夠相對(duì)地調(diào)節(jié)激勵(lì)脈沖光相對(duì)于物鏡20的瞳孔的入射位置和激勵(lì)脈沖光相對(duì)于物鏡19的瞳孔的入射位置。因此，通過該調(diào)節(jié)，能夠使物鏡20形成的光斑S1的位置和物鏡19形成的光斑S1的位置沿著xy方向相對(duì)移動(dòng)。通過該相對(duì)移動(dòng)，能夠使物鏡20形成的光斑S1的xy方向的位置13和物鏡19形成的光斑S1的xy方向的位置一致。另外，本實(shí)施例的CARS顯微鏡中，物鏡20的z方向的位置可變，通過該位置調(diào)節(jié)，能夠使物鏡20的焦平面和物鏡19的焦平面一致。另外，本實(shí)施例的CARS顯微鏡中，未圖示的試樣臺(tái)能夠調(diào)節(jié)培養(yǎng)容器10的z方向的位置，通過該位置調(diào)節(jié)，能夠使物鏡19、20的焦平面與期望的觀察對(duì)象面10A一致。另外，本實(shí)施例的CARS顯微鏡中，全反射鏡21能夠在保持其姿勢的狀態(tài)下，向與其反射面垂直的方向移動(dòng)。通過全反射鏡21的位置調(diào)節(jié)，能夠調(diào)節(jié)從物鏡20側(cè)朝向光斑S1的激勵(lì)脈沖光L1、L2的光程長和從物鏡19側(cè)朝向光斑S1的激勵(lì)脈沖光L1、L2的光程長的差。通過該調(diào)節(jié)，能夠使激勵(lì)脈沖光L1、L2從一側(cè)向觀察對(duì)象面10A入射的定時(shí)和激勵(lì)脈沖光L1、L2從另一側(cè)向觀察對(duì)象面10A入射的定時(shí)一致。另外，通過全反射鏡21的位置調(diào)節(jié)，能夠調(diào)節(jié)從光斑S1向物鏡20側(cè)出射的白色CARS信號(hào)Lr的光程長和從光斑S1向物鏡19側(cè)出射的白色CARS信號(hào)Lr的光程長的差。通過該調(diào)節(jié)，能夠使向觀察對(duì)象面10A的一側(cè)出射的白色CARS信號(hào)Lr向光束分離器17入射的定時(shí)和向觀察對(duì)象面10A的另一側(cè)出射的白色CARS信號(hào)Lr向光束分離器17入射的定時(shí)一致。另外，本實(shí)施例的CARS顯微鏡中，光束分離器23A使從透鏡168朝向共軛面（虛線）的光的一部分反射，向配置在與該共軛面等價(jià)的位置的拍攝元件238入射。因此，若調(diào)節(jié)時(shí)在試樣臺(tái)上配置偽樣本（二光子熒光材料）、控制部28使拍攝元件23B生成的熒光圖像實(shí)時(shí)顯示于監(jiān)視器，則能夠使一對(duì)物鏡19、20分別形成的一對(duì)光斑S1的z方向的錯(cuò)位和/或這一對(duì)光斑S1的xy方向的錯(cuò)位可視化。因此，CARS顯微鏡的用戶能夠有效地進(jìn)行物鏡20的位置調(diào)節(jié)和/或光束分離器17的姿勢調(diào)節(jié)。另外，這里為了使物鏡20的焦平面和物鏡19的焦平面一致而使物鏡20移動(dòng)，但是也可以取代物鏡20使而物鏡19移動(dòng)。另外，這里，為了調(diào)節(jié)從物鏡20側(cè)朝向觀察對(duì)象面10A的激勵(lì)脈沖光L1、L2的光程長和從物鏡19側(cè)朝向觀察對(duì)象面10A的激勵(lì)脈沖光L1、L2的光程長的差而使全反射鏡21移動(dòng)，但是也可以取代全反射鏡21使全反射鏡18移動(dòng)。另外，這里，光束分離器23A設(shè)為非可動(dòng)，但是，該光束分離器23A是在觀察前的調(diào)節(jié)時(shí)而不是觀察時(shí)需要，因此，也可以將該光束分離器23A設(shè)為可動(dòng)，在非觀察時(shí)從光程移去。另外，若在非觀察時(shí)從光程移去，則也可以取代光束分離器23A而使用全反射鏡。另外，兩側(cè)激勵(lì)·兩側(cè)檢測模式中的CARS顯微鏡具備：使從光源（11）供給的照明光（L1、L2）的光程分支為一對(duì)光程的光束分離器（17）；使一對(duì)光程分別向被觀察物（10）中的被觀察面（10A）的相互相反側(cè)偏轉(zhuǎn)的一對(duì)偏轉(zhuǎn)鏡（18，21）；對(duì)一對(duì)光程分別配置、在被觀察面（10A）的共同位置配置了焦點(diǎn)的一對(duì)物鏡（19，20）；配置在一對(duì)光程的共同部分、將一對(duì)物鏡（19，20）的會(huì)聚點(diǎn)（S1）處的非線性光學(xué)過程中發(fā)生的相干的物體光從照明光分離的分色鏡（14）；接受由分色鏡（14）分離的物體光、生成表示該受光部處的光強(qiáng)度的信號(hào)的檢測單元（27）；以及，一邊在會(huì)聚點(diǎn)（S1）掃描被觀察面（10A），一邊反復(fù)獲取檢測單元（27）生成的信號(hào)、計(jì)測被觀察面（10A）上的信號(hào)分布的控制單元（28）。（兩側(cè)激勵(lì)·單側(cè)檢測模式）接著，說明兩側(cè)激勵(lì)·單側(cè)檢測模式。這里僅僅說明與兩側(cè)激勵(lì)·兩側(cè)檢測模式的不同點(diǎn)。該模式中，如圖3所示，對(duì)從光束分離器17經(jīng)由物鏡20朝向觀察對(duì)象面10A的激勵(lì)脈沖光L1、L2的光程，將波長選擇濾波器22t插入。波長選擇濾波器22t的特性設(shè)定成，切斷白色CARS信號(hào)Lr且使激勵(lì)脈沖光L1、L2透射的特性。因此，該模式中，能夠到達(dá)觀察對(duì)象面10A的激勵(lì)脈沖光成為從物鏡19出射的激勵(lì)脈沖光L1、L2和從物鏡20出射的激勵(lì)脈沖光L1、L2的雙方，能夠到達(dá)光束分離器17的白色CARS信號(hào)僅限于從觀察對(duì)象面10A向物鏡19側(cè)出射的白色CARS信號(hào)Lr（向物鏡20側(cè)出射的白色CARS信號(hào)Lr不能到達(dá)。）。另外，兩側(cè)激勵(lì)·單側(cè)檢測模式中的CARS顯微鏡在兩側(cè)激勵(lì)·兩側(cè)檢測模式中的CARS顯微鏡中，還具備：配置在一對(duì)光程的一方、僅僅切斷朝向被觀察面（10A）的照明光（L1、L2）和從被觀察面（10A）出射的物體光（Lr）中的后者的波長選擇濾波器（22t）。（單側(cè)激勵(lì)·兩側(cè)檢測模式）接著，說明單側(cè)激勵(lì)·兩側(cè)檢測模式。這里也僅僅說明與兩側(cè)激勵(lì)·兩側(cè)檢測模式的不同點(diǎn)。該模式中，如圖4所示，對(duì)從觀察對(duì)象面10A經(jīng)由物鏡19朝向光束分離器17的白色CARS信號(hào)Lr的光程，插入有波長選擇濾波器22r。波長選擇濾波器22r的特性設(shè)定成使白色CARS信號(hào)Lr透射且切斷激勵(lì)脈沖光L1、L2的特性。因此，該模式中，能夠到達(dá)觀察對(duì)象面10A的激勵(lì)脈沖光僅限于從物鏡20出射的激勵(lì)脈沖光L1、L2，能夠到達(dá)光束分離器17的白色CARS信號(hào)成為從觀察對(duì)象面10A向物鏡20側(cè)出射的白色CARS信號(hào)Lr和從觀察對(duì)象面10A向物鏡19側(cè)出射的白色CARS信號(hào)Lr的雙方。另外，單側(cè)激勵(lì)·兩側(cè)檢測模式中的CARS顯微鏡在兩側(cè)激勵(lì)·兩側(cè)檢測模式中的CARS顯微鏡中，還具備：配置在一對(duì)光程的一方、僅僅切斷朝向被觀察面（10A）的照明光（L1、L2）和從被觀察面（10A）出射的物體光（Lr）中的前者的波長選擇濾波器（22r）。（透射觀察模式）接著，說明透射觀察模式。這里也僅僅說明與兩側(cè)激勵(lì)·兩側(cè)檢測模式的不同點(diǎn)。該模式中，如圖5所示，對(duì)從光束分離器17經(jīng)由物鏡20朝向觀察對(duì)象面10A的激勵(lì)脈沖光L1、L2的光程，插入有波長選擇濾波器22t，且對(duì)從觀察對(duì)象面10A經(jīng)由物鏡19到達(dá)光束分離器17的白色CARS信號(hào)Lr的光程，插入有波長選擇濾波器22r。因此，該模式中，能夠到達(dá)觀察對(duì)象面10A的激勵(lì)脈沖光僅限于從物鏡20側(cè)出射的激勵(lì)脈沖光L1、L2，能夠到達(dá)光束分離器17的白色CARS信號(hào)僅限于向物鏡19側(cè)出射的白色CARS信號(hào)Lr（即向激勵(lì)脈沖光L1、L2的下游側(cè)出射的白色CARS信號(hào)Lr）。（反射觀察模式）接著，說明反射觀察模式。這里也僅僅說明與兩側(cè)激勵(lì)·兩側(cè)檢測模式的不同點(diǎn)。該模式中，如圖6所示，光束分離器17從光程離開，對(duì)從光束分離器17經(jīng)由物鏡20朝向觀察對(duì)象面10A的白色CARS信號(hào)Lr的光程，插入有波長選擇濾波器22t。因此，該模式中，能夠到達(dá)觀察對(duì)象面10A的激勵(lì)脈沖光僅限于從物鏡19側(cè)出射的激勵(lì)脈沖光L1、L2，能夠到達(dá)光束分離器17的白色CARS信號(hào)僅限于向物鏡19側(cè)出射的白色CARS信號(hào)（即向激勵(lì)脈沖光L1、L2的上游側(cè)出射的白色CARS信號(hào)Lr）。（各模式的效果）圖7（A）-圖7（E）是對(duì)每個(gè)模式表示能夠從觀察對(duì)象物向頻譜檢測器27側(cè)傳遞的構(gòu)造的空間頻率域（傳遞域）的圖。圖7（A）表示兩側(cè)激勵(lì)·兩側(cè)檢測模式的傳遞域，圖7（B）表示兩側(cè)激勵(lì)·單側(cè)檢測模式的傳遞域，圖7（C）表示單側(cè)激勵(lì)·兩側(cè)檢測模式的傳遞域，圖7（D）表示透射觀察模式的傳遞域，圖7（E）表示反射觀察模式的傳遞域。另外，這些圖7（A）-圖7（E）的各個(gè)橫軸用波數(shù)表示z方向的傳遞域，縱軸用波數(shù)表示x方向的傳遞域。另外，y方向的傳遞域的范圍與x方向的傳遞域的范圍相同，因此圖示省略。因此，能夠認(rèn)為傳遞域的z方向的幅度越廣則z方向的觀察分辨率越高，傳遞域的x方向的幅度越廣則xy方向的觀察分辨率越高。比較圖7（A）-圖7（E）可知，xy方向的觀察分辨率在模式間幾乎無差異。但是，z方向的觀察分辨率在模式間存在差異。具體地說，z方向的觀察分辨率最高的是兩側(cè)激勵(lì)·兩側(cè)檢測模式（圖7（A）），z方向的觀察分辨率第2高的是兩側(cè)激勵(lì)·單側(cè)檢測模式（圖7（B）），z方向的觀察分辨率第3高的是單側(cè)激勵(lì)·兩側(cè)檢測模式（圖7（C）），z方向的觀察分辨率第4高的是透射觀察模式或者反射觀察模式（圖7（D）、圖7（E））。即，為了提高z方向的觀察分辨率，最好將本實(shí)施例的CARS顯微鏡設(shè)定成兩側(cè)激勵(lì)·兩側(cè)檢測模式（圖7（A）），設(shè)定成兩側(cè)激勵(lì)·單側(cè)檢測模式（圖7（B））的場合，也可以獲得相近效果。另外，雖然比其稍差，但是設(shè)定成單側(cè)激勵(lì)·兩側(cè)檢測模式（圖7（C））的場合，也可以獲得一定的效果。另一方面，將本實(shí)施例的CARS顯微鏡設(shè)定成透射觀察模式（圖7（D））及反射觀察模式（圖7（E））的場合，z方向的觀察分辨率保持較低。順便說一下，在透射觀察模式（圖7（D））、反射觀察模式（圖7（E））之間，傳遞域錯(cuò)位，存在前者的原點(diǎn)被覆蓋而后者的原點(diǎn)未被覆蓋的差異。即，差異在于：透射觀察模式（圖7（D））能夠傳遞空間頻率為零附近的構(gòu)造但是無法傳遞空間頻率大的構(gòu)造，而反射觀察模式（圖7（E））無法傳遞空間頻率為零附近的構(gòu)造但是能夠傳遞空間頻率大的構(gòu)造。從而，本實(shí)施例的CARS顯微鏡的用戶通過一邊將CARS顯微鏡的模式在以上的5種模式間切換一邊反復(fù)觀察同一觀察對(duì)象面10A，能夠詳細(xì)進(jìn)行觀察對(duì)象面10A的觀察。用戶通過將CARS顯微鏡的模式設(shè)定成將觀察對(duì)象面10A的激勵(lì)方向和檢測方向的至少一方雙重化的模式（圖7（A）到（C）），能夠提高z方向的觀察分辨率，而且，通過設(shè)定成將觀察對(duì)象面10A的激勵(lì)方向和檢測方向雙方雙重化的模式（圖7（A）），能夠使z方向的觀察分辨率最高。[第1實(shí)施例的補(bǔ)充]另外，第1實(shí)施例中，說明了分光型的CARS顯微鏡，但是本發(fā)明也能夠適用于非分光型的CARS顯微鏡。該場合，在上述激勵(lì)脈沖光生成部12應(yīng)用光參量發(fā)射器，生成光頻率不同的一對(duì)脈沖激光作為激勵(lì)脈沖光即可。另外，該場合，從觀察對(duì)象面10A出射的CARS信號(hào)成為單一光頻率的CARS信號(hào)，因此，取代分光器26及頻譜檢測器27而采用PMT（光電倍增管）等受光元件即可。另外，第1實(shí)施例中，說明了激光掃描型的CARS顯微鏡，但是本發(fā)明也能夠適用于臺(tái)座掃描型的CARS顯微鏡。該場合，省略光掃描器15，未圖示的試樣臺(tái)設(shè)為不僅在z方向還能夠在xy方向上移動(dòng)培養(yǎng)容器10。另外，第1實(shí)施例中利用CARS過程作為非線性過程，但是也可以利用其他非線性過程。其他非線性過程例如是雙光子熒光、第1諧波（SHG）、第2諧波（THG）、相干斯托克斯拉曼散射（CSRS）、4波混合、和頻發(fā)生等。符號(hào)說明11…激光源，12…激勵(lì)脈沖光生成部，14…分色鏡，15…光掃描器，16A...透鏡，16B…透鏡，17...光束分離器，22r…波長選擇濾波器，18…全反射鏡，19…物鏡，20…物鏡，21…全反射鏡，22t…濾波器，10…培養(yǎng)容器，23A…光束分離器，23B…拍攝元件，25…會(huì)聚透鏡，26…分光器，27…頻譜檢測器，28…控制部。