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      不同基質(zhì)乳制品中三聚氰胺含量的拉曼光譜測(cè)量方法與流程

      文檔序號(hào):11991435閱讀:442來(lái)源:國(guó)知局
      不同基質(zhì)乳制品中三聚氰胺含量的拉曼光譜測(cè)量方法與流程
      本發(fā)明涉及乳制品中的三聚氰胺含量檢測(cè)領(lǐng)域,尤其涉及不同基質(zhì)乳制品中的三聚氰胺含量的檢測(cè)方法。

      背景技術(shù):
      國(guó)家發(fā)布了《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》(GB/T22388-2008),規(guī)定了原料乳、乳制品以及含乳制品中三聚氰胺的三種測(cè)定方法,即高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法(LC-MS/MS)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[包括氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS),氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法(GC-MS/MS)]。雖然這些方法可以進(jìn)行準(zhǔn)確的定性及定量分析,但由于操作復(fù)雜、操作條件苛刻、耗材成本高、測(cè)試速度慢等限制,使得這些方法只能在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院公開(kāi)了專利申請(qǐng)公開(kāi)號(hào)為CN101477051,題目為《用于液態(tài)奶中三聚氰胺現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的拉曼光譜法及試劑盒》,該專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種采用拉曼光譜法定量檢測(cè)液態(tài)奶中三聚氰胺含量的方法,該方法主要通過(guò)研究生鮮奶的拉曼光譜特征峰強(qiáng)隨三聚氰胺濃度變化的特征曲線,并利用特征曲線和待測(cè)生鮮奶的拉曼光譜。它能夠比較快速實(shí)現(xiàn)對(duì)三聚氰胺的檢測(cè),對(duì)生鮮奶中三聚氰胺的含量有比較好的檢測(cè)效果。但對(duì)其它液態(tài)奶進(jìn)行檢測(cè)時(shí),由于各種不同液態(tài)奶中成分不同,它們的特征曲線會(huì)和生鮮奶有一定差異,而如果仍然按照生鮮奶的特征曲線進(jìn)行定量計(jì)算,會(huì)導(dǎo)致計(jì)算結(jié)果和實(shí)際值會(huì)有比較大的差異。實(shí)際測(cè)量結(jié)果表明該方法對(duì)市售的各種液態(tài)奶檢測(cè)時(shí)有比較大的測(cè)量偏差。產(chǎn)生測(cè)量偏差主要是由于各種不同液態(tài)奶中成分不同,而這些不同的基質(zhì)會(huì)對(duì)拉曼光譜檢測(cè)帶來(lái)很大的影響。因此,解決乳制品中不同基質(zhì)對(duì)測(cè)量的干擾是應(yīng)用拉曼光譜對(duì)乳制品中三聚氰胺定量檢測(cè)面臨的主要困難。有鑒于此,確有需要提供一種能快速地和/或準(zhǔn)確地對(duì)不同基質(zhì)乳制品中的三聚氰胺含量進(jìn)行定量分析的方法。

      技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
      本發(fā)明的目的旨在解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題和缺陷的至少一個(gè)方面。鑒于上述分析可知,本發(fā)明的目的之一是建立一套利用拉曼光譜解決乳制品中不同基質(zhì)干擾的測(cè)試和數(shù)據(jù)分析方法,利用拉曼光譜法實(shí)現(xiàn)對(duì)不同基質(zhì)乳制品中三聚氰胺的定量檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面,提供了一種用于不同基質(zhì)乳制品中三聚氰胺含量檢測(cè)的拉曼光譜測(cè)量方法,其包括以下步驟:(a)建立不同基質(zhì)乳制品的特征曲線的數(shù)據(jù)庫(kù);(b)量取多份某一未知基質(zhì)的待測(cè)乳制品,向其中添加不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液,得到一系列已知三聚氰胺相對(duì)濃度的該基質(zhì)的乳制品樣本;(c)對(duì)于所述乳制品樣本進(jìn)行拉曼光譜測(cè)試分析并獲得相對(duì)應(yīng)的特征峰強(qiáng),從而獲得所述乳制品樣本的特征峰強(qiáng)隨三聚氰胺相對(duì)濃度變化的特征曲線的斜率;(d)利用所述乳制品樣本的特征曲線的斜率在步驟(a)中建立的數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索以找到與之相匹配的特征曲線;(e)利用該特征曲線和待測(cè)乳制品的特征峰強(qiáng)計(jì)算該待測(cè)乳制品中的三聚氰胺的濃度。進(jìn)一步地,在步驟(b)中,在添加三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液到待測(cè)乳制品中之后,還將水、有機(jī)溶劑或鹽加入到所述待測(cè)乳制品中,待混合均勻、經(jīng)離心處理后,取其清液待測(cè)。另外,向所述清液中添加納米材料增強(qiáng)劑,混合均勻后,形成所述待測(cè)乳制品的樣本。在另一實(shí)施例中,在步驟(c)中,所述獲取特征峰強(qiáng)的方法是:將獲得的乳制品樣本的拉曼光譜進(jìn)行扣背底處理,以獲得平坦的拉曼光譜;將拉曼光譜中的第一特征峰拉曼頻移處的峰面積除以第二特征峰拉曼頻移處的特征峰面積,從而獲得特征峰強(qiáng)。具體地,所述第一特征峰的拉曼頻移在707cm-1附近;所述第二特征峰的拉曼頻移在935cm-1附近。在另一實(shí)施例中,在步驟(a)中,通過(guò)高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法、或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法來(lái)檢測(cè)一系列具有相同基質(zhì)的乳制品樣本中三聚氰胺的濃度;利用拉曼光譜法獲取這些相同基質(zhì)的乳制品樣本的特征峰強(qiáng),從而建立該基質(zhì)乳制品的特征峰強(qiáng)隨三聚氰胺濃度變化的特征曲線;之后,通過(guò)檢測(cè)多種不同基質(zhì)乳制品的特征曲線,建立不同基質(zhì)乳制品特征曲線數(shù)據(jù)庫(kù)。優(yōu)選地,水包括去離子水或蒸餾水;有機(jī)溶劑包括酒精或丙酮;鹽包括氯化鉀或氯化鈉。優(yōu)選地,所述納米材料增強(qiáng)劑包括為尺度在1-1000nm范圍內(nèi)的金屬納米材料、金屬納米線、金屬納米團(tuán)簇、碳納米管和碳納米顆粒中任一種或他們的組合。更優(yōu)選地,所述金屬納米顆粒材料包括金、銀、銅、鎂、鋁、鐵、鈷、鎳、鈀、鉑的納米顆粒材料。在另一實(shí)施例中,在步驟(c)中,所述獲取特征曲線斜率的方法是:根據(jù)特征峰強(qiáng)隨三聚氰胺濃度的變化通過(guò)差量法或直線擬合的方法確定特征曲線的斜率。附圖說(shuō)明本發(fā)明的這些和/或其他方面和優(yōu)點(diǎn)從下面結(jié)合附圖對(duì)優(yōu)選實(shí)施例的描述中將變得明顯和容易理解,其中:圖1是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的已經(jīng)建立的不同基質(zhì)乳制品的特征曲線的數(shù)據(jù)庫(kù)的一部分的示意圖。圖2a-2c是采用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的方法測(cè)量某一基質(zhì)的液態(tài)奶的三個(gè)添加不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液之后的待測(cè)液態(tài)奶樣本的拉曼光譜圖。圖3是在本發(fā)明中通過(guò)計(jì)算所獲得的圖2a-2c中的待測(cè)液態(tài)奶樣本的特征曲線的示意圖。具體實(shí)施方式下面通過(guò)實(shí)施例,并結(jié)合附圖,對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步具體的說(shuō)明。在說(shuō)明書(shū)中,相同或相似的附圖標(biāo)號(hào)表示相同或相似的部件。下述參照附圖對(duì)本發(fā)明實(shí)施方式的說(shuō)明旨在對(duì)本發(fā)明的總體發(fā)明構(gòu)思進(jìn)行解釋,而不應(yīng)當(dāng)理解為對(duì)本發(fā)明的一種限制。本發(fā)明的主要構(gòu)思是:對(duì)同一基質(zhì)的已知三聚氰胺濃度的乳制品進(jìn)行拉曼光譜測(cè)試分析;建立同一基質(zhì)乳制品的三聚氰胺濃度和對(duì)應(yīng)拉曼光譜特征峰強(qiáng)的特征曲線;研究分析多種不同基質(zhì)乳制品的三聚氰胺濃度和對(duì)應(yīng)拉曼光譜特征峰強(qiáng)的特征曲線以建立所述特征曲線的數(shù)據(jù)庫(kù);對(duì)待測(cè)乳制品采用相對(duì)法進(jìn)行拉曼光譜多點(diǎn)測(cè)量以確定特征曲線的斜率,結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)建立待測(cè)乳制品的特征曲線,利用特征曲線計(jì)算待測(cè)乳制品中三聚氰胺的含量。根據(jù)本發(fā)明的用于不同基質(zhì)乳制品中三聚氰胺含量檢測(cè)的拉曼光譜法包括以下步驟:1)制備已知三聚氰胺濃度的樣本:乳制品中三聚氰胺的濃度可以通過(guò)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定方法(高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法(LC-MS/MS)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[包括氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS),氣相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法(GC-MS/MS)])進(jìn)行測(cè)定,通過(guò)向其中添加不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液,獲得一系列已知三聚氰胺濃度的樣本;2)拉曼光譜測(cè)量:取定量樣本,向其中添加定量的水、有機(jī)溶劑或者鹽等化學(xué)藥品,混勻后離心,取清液待測(cè)。將定量清液和納米材料增強(qiáng)劑混合,利用拉曼光譜儀測(cè)量其拉曼光譜;3)特征峰強(qiáng)分析:獲取拉曼光譜中三聚氰胺某一特征峰拉曼頻移處的信號(hào)(或峰面積)相對(duì)于另一特征峰拉曼頻移處的信號(hào)(或峰面積)的相對(duì)強(qiáng)度,即某一特征峰的特征峰強(qiáng);4)建立特征曲線:對(duì)相同基質(zhì)的乳制品,建立特征峰強(qiáng)隨三聚氰胺濃度變化的特征曲線;5)建立數(shù)據(jù)庫(kù):對(duì)不同基質(zhì)的乳制品分別建立特征曲線以構(gòu)成相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)(如圖1所示,圖1中所示出的三聚氰胺濃度的零點(diǎn)或0ppm,表示牛奶樣品中實(shí)際上不含有三聚氰胺);6)相對(duì)測(cè)量:取多份待測(cè)乳制品或奶制品,向其中分別添加不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液,得到一系列已知三聚氰胺相對(duì)濃度的不同基質(zhì)的乳制品待測(cè)樣本,按照步驟2)方法測(cè)量各待測(cè)樣品的拉曼光譜(如圖2a-2c所示),獲取特征峰強(qiáng);7)定量分析:利用步驟5)建立的數(shù)據(jù)庫(kù)和步驟6)相對(duì)測(cè)量得到的拉曼光譜的特征峰強(qiáng),建立待測(cè)乳制品的特征曲線(參見(jiàn)圖3)。結(jié)合特征曲線和待測(cè)樣本拉曼光譜的特征峰強(qiáng),定量計(jì)算出三聚氰胺濃度。采用上述的相對(duì)測(cè)試和數(shù)據(jù)分析方法,可以對(duì)乳制品中三聚氰胺含量實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè),當(dāng)三聚氰胺含量在2.5mg/kg以上時(shí),檢測(cè)回收率在80%--110%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。在本發(fā)明中,建立不同基質(zhì)乳制品的特征曲線的數(shù)據(jù)庫(kù)具體步驟為:通過(guò)國(guó)家規(guī)定的高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法、或氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法來(lái)檢測(cè)一系列具有相同基質(zhì)的乳制品樣本中三聚氰胺的濃度;利用拉曼光譜法獲取這些相同基質(zhì)的乳制品樣本的特征峰強(qiáng),從而建立該基質(zhì)乳制品的特征峰強(qiáng)隨三聚氰胺濃度變化的特征曲線;之后,通過(guò)檢測(cè)多種不同基質(zhì)乳制品的特征曲線,建立不同基質(zhì)乳制品特征曲線數(shù)據(jù)庫(kù)。在本發(fā)明中,步驟2)中應(yīng)用的納米材料增強(qiáng)劑包括為尺度在1-1000nm范圍內(nèi)的金屬納米顆粒、納米線以及納米團(tuán)簇、碳納米管、碳納米顆粒中的任一種或他們的組合。所述金屬納米顆粒、納米線或納米團(tuán)簇包括金、銀、銅、鎂、鋁、鐵、鈷、鎳、鈀、鉑中任一種或他們的組合的的納米顆?;虿牧?、納米線或納米簇。另外,在步驟2)中,水包括去離子水或蒸餾水;有機(jī)溶劑包括酒精或丙酮等;鹽包括氯化鉀或氯化鈉等。在步驟3)中,所述獲取特征峰強(qiáng)的方法是:將獲得的乳制品樣本的拉曼光譜進(jìn)行扣背底處理,以獲得平坦的拉曼光譜;將拉曼光譜中的第一特征峰的拉曼頻移處的對(duì)應(yīng)的峰面積除以第二特征峰的拉曼頻移處的對(duì)應(yīng)的特征峰面積,從而獲得特征峰強(qiáng)。優(yōu)選地,所述第一特征峰的拉曼頻移在707cm-1附近;所述第二特征峰的拉曼頻移在935cm-1附近。在本發(fā)明中,所述獲取特征曲線斜率的方法是:根據(jù)特征峰強(qiáng)隨三聚氰胺濃度的變化通過(guò)差量法或直線擬合的方法確定特征曲線的斜率。同目前國(guó)標(biāo)《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》(GB/T22388-2008)中提到的方法相比,采用拉曼光譜法具有樣品前處理簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)耗材成本低、可進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)。相比于已經(jīng)報(bào)道的其它的拉曼光譜法,本發(fā)明最大的優(yōu)勢(shì)是解決了基質(zhì)對(duì)檢測(cè)的干擾。本發(fā)明的方法不僅僅局限于對(duì)某一種乳制品的檢測(cè),對(duì)市售的二十多種液態(tài)乳制品,它都能實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè),測(cè)定限為2.5mg/kg,重現(xiàn)性良好(定量分析,RSD≤10%)。實(shí)施例步驟1:向多個(gè)離心管中分別倒入500μl已知三聚氰胺濃度的液態(tài)奶,向其中分別添加50μl不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液,并向其中添加800μl無(wú)水乙醇,渦旋10秒鐘后置于離心機(jī)中,于14000rpm轉(zhuǎn)速離心12分鐘,取上層清液待測(cè)。步驟2:向測(cè)試瓶中添加430μl銀納米增強(qiáng)劑的溶液(濃度為100毫克/升,銀納米材料或顆粒的尺度在30-150nm的范圍之間)和200μl上述的牛奶清液,渦旋混勻。步驟3:用現(xiàn)有技術(shù)中的激光光源發(fā)射波長(zhǎng)為785nm的拉曼光譜儀檢測(cè)混合液的拉曼光譜,激光功率為450mw,積分時(shí)間為1s,連續(xù)掃描光譜15次,取平均光譜。步驟4:將特征峰拉曼頻移707cm-1的對(duì)應(yīng)峰的峰面積除以特征峰的拉曼頻移為935cm-1的對(duì)應(yīng)峰的峰面積,獲得707cm-1拉曼頻移處特征峰的拉曼信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度,即特征峰強(qiáng)。步驟5:對(duì)于不同含量三聚氰胺的液態(tài)奶樣品,建立707cm-1附近特征峰的相對(duì)強(qiáng)度隨三聚氰胺濃度變化的線性關(guān)系的特征曲線。步驟6:對(duì)不同基質(zhì)的液態(tài)奶分別建立對(duì)應(yīng)的特征曲線,從而建立多個(gè)不同基質(zhì)的液態(tài)奶的特征曲線數(shù)據(jù)庫(kù)。如圖1所示,其示出了6種不同基質(zhì)的液態(tài)奶(例如牛奶1-6)的拉曼特征峰強(qiáng)隨三聚氰胺濃度變化的特征曲線。步驟7:取多份待測(cè)的某一未知基質(zhì)的液態(tài)奶,向其中添加不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液,得到一系列已知三聚氰胺相對(duì)濃度的所述未知基質(zhì)液態(tài)奶待測(cè)樣本。具體地,在本實(shí)施例中,量取三份500μl的待測(cè)液態(tài)奶,并分別向其中添加50μl的水、15ppm三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液和35ppm三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液,以與上述步驟1和2所述的步驟相同的方法制備液態(tài)奶待測(cè)樣本(即將步驟1和2中的已知三聚氰胺濃度的液態(tài)奶替換成同樣體積的待測(cè)液態(tài)奶,保持其它參數(shù)、條件或處理順序完全相同)。假設(shè)待測(cè)液態(tài)奶中三聚氰胺濃度為X,三個(gè)樣本中三聚氰胺濃度可以看作為X,X+1.5ppm,X+3.5ppm。步驟8:利用所述待測(cè)液態(tài)奶的特征曲線的斜率在之前建立的數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找對(duì)應(yīng)的與之匹配的特征曲線。具體地,按照前面所述的步驟的方法測(cè)量各待測(cè)樣本的拉曼光譜,獲取特征峰強(qiáng),從而獲得待測(cè)液態(tài)奶的特征曲線。其中參考圖2a-2c,示出了待測(cè)液態(tài)奶的拉曼峰強(qiáng)與拉曼頻移的拉曼光譜圖。通過(guò)使用步驟3中的相應(yīng)的方法,測(cè)得三個(gè)待測(cè)液態(tài)奶樣本的拉曼光譜,如圖2a、2b、2c所示。計(jì)算得到特征峰強(qiáng)(707cm-1特征峰拉曼頻移處拉曼信號(hào)的相對(duì)強(qiáng)度)分別為:0.691,1.030,1.426,從而得到三聚氰胺濃度和特征峰強(qiáng)的對(duì)應(yīng)關(guān)系,如表1:表1示出待測(cè)液態(tài)奶樣本的三聚氰胺相對(duì)濃度與特征峰強(qiáng)的關(guān)系利用三聚氰胺相對(duì)濃度和特征峰強(qiáng)計(jì)算相應(yīng)的特征曲線的斜率。將X設(shè)置為任意某一值,對(duì)上述三組數(shù)據(jù)進(jìn)行直線擬合(圖3是假設(shè)X=0,得到的擬合曲線),擬合得到斜率為0.21。通過(guò)斜率在數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢匹配的特征曲線為Y=0.21X+0.37。步驟9:利用特征曲線和待測(cè)液態(tài)奶的拉曼光譜的特征峰強(qiáng)定量計(jì)算待測(cè)液態(tài)奶中三聚氰胺的濃度。待測(cè)液態(tài)奶樣品特征峰強(qiáng)Y=0.691,利用特征曲線計(jì)算得到待測(cè)液態(tài)奶樣品三聚氰胺濃度為1.53ppm,非常接近它的實(shí)際濃度1.50ppm(該實(shí)際濃度是通過(guò)國(guó)家規(guī)定的檢測(cè)方法獲得的)。對(duì)多個(gè)樣品按照上述方法進(jìn)行測(cè)量,發(fā)現(xiàn)三聚氰胺含量小于或等于2.5-5ppm的范圍內(nèi),回收率在80%--110%之間,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%。對(duì)步驟7,同樣可以取多份未知基質(zhì)的已知三聚氰胺相對(duì)濃度的樣品進(jìn)行測(cè)量,以確定多個(gè)未知基質(zhì)的液態(tài)奶乳制品中的三聚氰胺的濃度。雖然本發(fā)明總體構(gòu)思的一些實(shí)施例已被顯示和說(shuō)明,本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解,在不背離本總體發(fā)明構(gòu)思的原則和精神的情況下,可對(duì)這些實(shí)施例做出改變,本發(fā)明的范圍以權(quán)利要求和它們的等同物限定。
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