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      用于表征脂蛋白的方法與流程

      文檔序號(hào):11142006閱讀:890來(lái)源:國(guó)知局
      用于表征脂蛋白的方法與制造工藝
      本發(fā)明涉及用于表征脂蛋白的方法,并且適用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域?,F(xiàn)有技術(shù)脂質(zhì)在血液中主要以脂蛋白的形式存在,脂蛋白是在肝和腸中合成的運(yùn)輸膽固醇、甘油三酯及其他脂質(zhì)通過(guò)血流進(jìn)入外周組織的顆粒。血脂的異常水平可指示心血管疾病。為了評(píng)估心血管風(fēng)險(xiǎn),一般使用標(biāo)準(zhǔn)脂質(zhì)組,其包括血漿甘油三酯、總膽固醇、LDL膽固醇和HDL膽固醇的濃度。所有這些參數(shù)均可實(shí)驗(yàn)測(cè)量,LDL膽固醇例外,其使用Friedewald公式進(jìn)行估算。該公式的一個(gè)關(guān)鍵限制是其在某些條件下不精確。而且,由于脂蛋白顆粒的尺寸和顆粒數(shù)也可與脂質(zhì)相關(guān)性疾病的正確診斷有關(guān),因此測(cè)量HDL和LDL脂蛋白級(jí)分中膽固醇的量不能滿足在每種情況下預(yù)測(cè)心血管風(fēng)險(xiǎn)。因此,脂蛋白顆粒在心血管疾病和代謝紊亂中起主要作用。脂蛋白根據(jù)其尺寸和密度分為五個(gè)主要級(jí)分:乳糜微粒(Q;半徑)、極低密度脂蛋白(verylowdensitylipoprotein,VLDL;半徑)、中密度脂蛋白(intermediatedensitylipoprotein,IDL;半徑)、低密度脂蛋白(lowdensitylipoprotein,LDL;半徑)和高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein,HDL;半徑)。這些主要級(jí)分可進(jìn)一步分為不同的亞類(subclass)以獲得更為詳細(xì)的脂蛋白譜。公認(rèn)的是,脂蛋白顆粒的結(jié)構(gòu)基本上為球形并且包括內(nèi)核心和外殼,其中非極性脂質(zhì)(三酰甘油和膽固醇酯)見(jiàn)于核心中,而極性脂質(zhì)(磷脂和游離膽固醇)分布于整個(gè)表面單層(殼)。脂蛋白的蛋白質(zhì)組分(稱為載脂蛋白或脫輔基蛋白)與極性脂質(zhì)一起位于殼上。高級(jí)脂蛋白測(cè)試(advancedlipoproteintesting,ALT)旨在提供有關(guān)脂蛋白顆粒的最詳細(xì)信息。在目前使用的高級(jí)脂蛋白測(cè)試的分析技術(shù)中,可提及以下:■密度梯度超速離心(DensityGradientUltracentrifugation),其允許測(cè)量不同脂蛋白亞類的相對(duì)膽固醇分布(K.R.Kulkarni等,QuantificationofcholesterolinalllipoproteinclassesbytheVAP-IImethod,JournalofLipidResearch35(1994)159-168)。然而,其不提供甘油三酯的濃度,或者脂蛋白顆粒的數(shù)目和尺寸?!鎏荻饶z電泳(GradientGelElectrophoresis),其可根據(jù)LDL和HDL亞類的尺寸直接從血漿對(duì)LDL和HDL亞類進(jìn)行分級(jí)(G.R.Warnick等,Polyacrylamidegradientgelelectrophoresisoflipoproteinsubclasses,ClinicsinLaboratoryMedicine26(2006)803)。該方法需要定制的凝膠并且需要嚴(yán)格注意實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制,因?yàn)槟z質(zhì)量和實(shí)驗(yàn)室條件的小變化可影響準(zhǔn)確度?!龈咝б合嗌V法(HighPerformanceLiquidChromatography)測(cè)量主要脂蛋白及其亞類的尺寸以及膽固醇和甘油三酯含量(M.Okazaki等,ComponentanalysisofHPLCprofilesofuniquelipoproteinsubclasscholesterolsfordetectionofcoronaryarterydisease,ClinicalChemistry52(2006)2049-2053)。■離子遷移率分析(IonMobilityAnalysis)依賴于氣相化脂蛋白顆粒的電泳遷移率的差異并且允許測(cè)量一些脂蛋白亞類的尺寸和濃度(M.P.Caulfield等,Directdeterminationoflipoproteinparticlesizesandconcentrationsbyionmobilityanalysis,ClinicalChemistry54(2008)1307-1316)。■1H-NMR光譜學(xué),其基于復(fù)雜的線形擬合技術(shù)來(lái)量化脂蛋白亞類(M.Ala-Korpela等,1HNMR-basedabsolutequantificationofhumanlipoproteinsandtheirlipidcontentsdirectlyfromplasma,JournalofLipidResearch(1994)2292-2304)。然而,所述技術(shù)需要使用之前表征的譜文庫(kù),并且具有在分析血漿譜中發(fā)生廣泛脂蛋白信號(hào)重疊的缺點(diǎn)?!鲋鞍准?jí)分的擴(kuò)散-排序NMR光譜學(xué)(Diffusion-OrderedNMRSpectroscopy),其使用分離的脂蛋白的甲基峰來(lái)計(jì)算脂蛋白的擴(kuò)散系數(shù)并且由該數(shù)值估算其尺寸(R.Mallol等,ParticlesizemeasurementoflipoproteinfractionsusingdiffusionorderedNMRspectroscopy,AnalyticalandBioanalyticalChemistry402(2012)2407-2415)。然而,該方法需要對(duì)樣品進(jìn)行超速離心以獲得不同脂蛋白級(jí)分的前步驟,并且不能在血清或血漿樣品中直接使用。物理分離不同脂蛋白級(jí)分和亞類的分析方法(例如超速離心)費(fèi)力且耗時(shí)。此外,樣品經(jīng)受高度操作,并且其可能在4℃下持續(xù)數(shù)天。此外,ALT方法尚未準(zhǔn)備好用于常規(guī)臨床用途,其一些限制為缺乏標(biāo)準(zhǔn)化和可變操作。因此,需要這樣的方法,其允許使用單一分析并且無(wú)需處理或破壞樣品來(lái)由血清或血漿樣品直接可靠地表征不同的脂蛋白級(jí)分和亞類。這將可用于開(kāi)發(fā)和監(jiān)測(cè)飲食和藥物治療,并且了解心血管疾病的病理生理學(xué)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:本發(fā)明通過(guò)提供根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法克服了上述問(wèn)題。從屬權(quán)利要求對(duì)本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行了限定。目前,LDL和HDL膽固醇是常規(guī)用于評(píng)估個(gè)體的心血管風(fēng)險(xiǎn)的兩個(gè)心血管風(fēng)險(xiǎn)因素。然而,高百分比遭受心血管事件的個(gè)體具有正常的LDL膽固醇水平?;加写x紊亂(例如糖尿病)的患者往往具有更小、膽固醇含量更差并且更加致動(dòng)脈粥樣化的LDL脂蛋白。這一較小尺寸與較多的顆粒數(shù)有關(guān),由此導(dǎo)致膽固醇濃度類似于以下模式的膽固醇濃度:較低濃度的較大較不致動(dòng)脈粥樣化顆粒。這是為什么關(guān)注確定LDL脂蛋白顆粒的尺寸和數(shù)目而非其脂質(zhì)載量來(lái)評(píng)估患者的心血管風(fēng)險(xiǎn)的原因。此外,有研究指出,與HDL膽固醇相比,HDL顆粒的尺寸和數(shù)目是更好的心血管風(fēng)險(xiǎn)預(yù)示。本發(fā)明允許徹底地表征脂蛋白顆粒,在樣品中以快速且可靠的方式提供主要脂蛋白級(jí)分和亞類的顆粒尺寸和數(shù)目而無(wú)需對(duì)不同的脂蛋白級(jí)分和亞類進(jìn)行物理分離。根據(jù)本發(fā)明的方法包括以下步驟:-獲得樣品的2D擴(kuò)散-排序1HNMR譜;-使用多個(gè)模型函數(shù)來(lái)進(jìn)行對(duì)應(yīng)于甲基信號(hào)的譜部分的曲面擬合(surfacefitting),每個(gè)模型函數(shù)對(duì)應(yīng)于與脂蛋白級(jí)分和亞類相關(guān)聯(lián)的給定顆粒尺寸并且包括至少一個(gè)在所述擬合期間待估算的模型參數(shù),估算的模型參數(shù)為模型參數(shù)組,為此使NMR信號(hào)和作為所述模型函數(shù)之線性組合而建立的模型信號(hào)之間的差異最小化,其中每個(gè)模型函數(shù)為具有以下形式的洛倫茲函數(shù)(lorentzianfunction)的三元組(triplet):三元組j=洛倫茲(h1j,fj-f0j,wj,Dj)+洛倫茲(h2j,fj,wj,Dj)+洛倫茲(h3j,fj+f0j,wj,Dj)其中hij(au)、fj(ppm)、wj(ppm)和Dj(cm2s-1)分別為與脂蛋白顆粒尺寸j相關(guān)聯(lián)的強(qiáng)度、化學(xué)位移、寬度和擴(kuò)散系數(shù)。側(cè)(side)洛倫茲函數(shù)相對(duì)于中心(central)洛倫茲函數(shù)在化學(xué)位移軸中等間距,即為量f0。針對(duì)脂蛋白顆粒尺寸待確定的模型參數(shù)為來(lái)自f、f0、h1、h2、h3、w和D中的一個(gè)或數(shù)個(gè)。有利地,與其他方法相比,使用洛倫茲的三元組作為與每個(gè)脂蛋白顆粒尺寸相關(guān)聯(lián)的模型函數(shù)使得更精確地?cái)M合NMR信號(hào)。所述樣品優(yōu)選地為血漿樣品或血清樣品,但是也可使用其他生物流體的樣品,例如腦脊液、腦脊髓流體或羊水。因此,將NMR甲基信號(hào)分解為多個(gè)模型函數(shù),每個(gè)模型函數(shù)與脂蛋白顆粒尺寸相對(duì)應(yīng)。因此,每個(gè)模型函數(shù)根據(jù)其脂蛋白顆粒尺寸而與給定的脂蛋白級(jí)分和亞類相關(guān)聯(lián)。并非擬合中包括的所有模型函數(shù)都一定對(duì)建立的模型信號(hào)具有貢獻(xiàn),因?yàn)椴⒎菙M合中包括的所有脂蛋白顆粒尺寸都一定存在于樣品中。根據(jù)本發(fā)明的方法,鑒定樣品中存在的脂蛋白并通過(guò)確定關(guān)聯(lián)脂蛋白信號(hào)的強(qiáng)度、化學(xué)位移、寬度和擴(kuò)散系數(shù)來(lái)對(duì)其進(jìn)行表征。對(duì)于樣品中存在的脂蛋白的進(jìn)一步表征,可基于模型函數(shù)并且基于估算的模型參數(shù)在后續(xù)步驟中確定另外的脂蛋白參數(shù)。優(yōu)選地,與每個(gè)脂蛋白顆粒尺寸j相關(guān)聯(lián)的三元組中的洛倫茲函數(shù)具有以下形式:其中k為玻耳茲曼常數(shù)并且G為施加的梯度強(qiáng)度(高斯cm-1)。洛倫茲的第一商數(shù)部分(qoutientpart)對(duì)應(yīng)于1D洛倫茲,而指數(shù)部分包括通過(guò)擴(kuò)散梯度的衰減效應(yīng)。洛倫茲函數(shù)的這一優(yōu)選形式適用于本發(fā)明的每個(gè)實(shí)施方案。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述方法包括鑒定樣品中存在的脂蛋白為與對(duì)由擬合產(chǎn)生的理論模型信號(hào)具有非零貢獻(xiàn)的模型函數(shù)相關(guān)聯(lián)的那些,并且所述方法包括確定以下中的至少一項(xiàng)且優(yōu)選全部:脂蛋白顆粒類的平均尺寸、脂蛋白顆粒亞類的平均尺寸、類和/或亞類脂蛋白顆粒濃度、至少一個(gè)脂蛋白顆粒類的脂質(zhì)濃度和/或至少一個(gè)脂蛋白顆粒亞類的脂質(zhì)濃度。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,對(duì)于與每個(gè)脂蛋白顆粒尺寸j相關(guān)聯(lián)的模型函數(shù),使側(cè)洛倫茲函數(shù)的強(qiáng)度與中心洛倫茲函數(shù)的強(qiáng)度成比例:h1j=αj·h2j,其中并且h3j=βj·h2j,其中在一個(gè)實(shí)施方案中,使比例因子αj對(duì)所有的脂蛋白顆粒尺寸而言都相同,和/或使比例因子βj對(duì)所有的脂蛋白顆粒尺寸而言都相同。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,使側(cè)洛倫茲函數(shù)的強(qiáng)度取成相等,即h1j=h3j。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,即,側(cè)洛倫茲函數(shù)的強(qiáng)度大致為中心洛倫茲函數(shù)之強(qiáng)度的一半,和/或f0=0.01ppm,即,側(cè)洛倫茲函數(shù)相對(duì)于中心洛倫茲函數(shù)在化學(xué)位移軸中間隔約0.01ppm。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所使用之模型函數(shù)的數(shù)目大于或等于9,每個(gè)模型函數(shù)均與脂蛋白顆粒尺寸相對(duì)應(yīng)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,基于例如通過(guò)NMR、HPLC、梯度凝膠電泳或原子力顯微鏡獲得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果定義在擬合中使用的脂蛋白顆粒尺寸。用于所述方法的脂蛋白顆粒尺寸可基于任何其他技術(shù)選擇。優(yōu)選地,在所述方法中使用對(duì)應(yīng)于數(shù)個(gè)脂蛋白級(jí)分和/或亞類的脂蛋白顆粒尺寸。在所述擬合期間,曲面擬合可以以所有模型參數(shù)作為待確定的自由函數(shù)來(lái)進(jìn)行。然而,在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,如下進(jìn)行曲面擬合:固定多個(gè)模型參數(shù),并且使用至少一個(gè)其他模型參數(shù)作為待確定的自由參數(shù)。更優(yōu)選地,至少使用中心洛倫茲的信號(hào)強(qiáng)度(h2)作為自由參數(shù),并固定化學(xué)位移、寬度和擴(kuò)散系數(shù)中的至少一個(gè)。當(dāng)在曲面擬合中待估算的模型參數(shù)的數(shù)目高時(shí),出現(xiàn)多個(gè)擬合解決方案,其中很多不具有生物學(xué)意義。有利地,通過(guò)在模型參數(shù)對(duì)之間建立關(guān)系來(lái)固定參數(shù)使得能夠減少該問(wèn)題的維數(shù),并且避免出現(xiàn)無(wú)生物學(xué)相關(guān)性的解決方案。側(cè)洛倫茲函數(shù)相對(duì)于中心洛倫茲函數(shù)的位移可在曲面擬合期間估算或者可取為給定值。類似地,側(cè)洛倫茲函數(shù)的強(qiáng)度可在曲面擬合期間估算或者可取成與中心函數(shù)的強(qiáng)度相關(guān),優(yōu)選地取為中心洛倫茲函數(shù)之強(qiáng)度的一半。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,基于脂蛋白顆粒尺寸并且基于回歸模型確定用于曲面擬合的固定模型參數(shù),所述回歸模型使固定模型參數(shù)對(duì)聯(lián)系起來(lái)和/或使模型參數(shù)和脂蛋白顆粒尺寸聯(lián)系起來(lái)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,用于固定參數(shù)的回歸模型由使用具有以強(qiáng)度、化學(xué)位移、寬度和擴(kuò)散系數(shù)為自由模型參數(shù)的多個(gè)模型洛倫茲函數(shù)對(duì)多個(gè)NMR譜的甲基信號(hào)進(jìn)行去卷積(deconvolution)獲得,所述自由模型參數(shù)經(jīng)估算以使NMR甲基信號(hào)和作為模型函數(shù)之線性組合而建立的模型信號(hào)之間的差異最小化,所述回歸模型分別至少使(i)化學(xué)位移和脂蛋白顆粒尺寸聯(lián)系起來(lái),和/或使(ii)寬度和脂蛋白顆粒尺寸聯(lián)系起來(lái)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,使模型參數(shù)對(duì)聯(lián)系起來(lái)的回歸模型根據(jù)以下步驟建立:-獲得多份樣品的2D擴(kuò)散-排序1HNMR譜;-對(duì)于每份樣品,使用多個(gè)模型函數(shù)進(jìn)行對(duì)應(yīng)于甲基信號(hào)的譜部分的曲面擬合,每個(gè)模型函數(shù)取決于待固定的模型參數(shù),其中所述待固定的所有模型參數(shù)在所述曲面擬合期間作為模型函數(shù)組估算,為此使NMR信號(hào)和作為所述模型函數(shù)之線性組合而建立的模型信號(hào)之間的差異最小化,以及-使用在前述步驟中估算的所述模型參數(shù)來(lái)建立使模型參數(shù)對(duì)聯(lián)系起來(lái)的回歸模型。優(yōu)選地,所述回歸模型分別至少使(i)化學(xué)位移和脂蛋白顆粒尺寸聯(lián)系起來(lái),和/或使(ii)寬度和脂蛋白顆粒尺寸聯(lián)系起來(lái)。用于建立回歸模型的多份樣品包含不同的脂質(zhì)譜,并且所考慮樣品數(shù)足夠高以具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。優(yōu)選地,樣品數(shù)等于或大于100,并且包括從健康對(duì)象取得的樣品和對(duì)應(yīng)于不同致動(dòng)脈粥樣化性血脂異常(atherogenicdyslipidaemia)譜的樣品。更優(yōu)選地,樣品數(shù)等于或大于100并且包括從健康對(duì)象取得的樣品,至少9%百分比的樣品對(duì)應(yīng)于具有糖尿病譜的個(gè)體并且這些患者中的至少25%具有動(dòng)脈粥樣化性血脂異常譜。優(yōu)選地,用于建立回歸模型的模型函數(shù)為以下形式的洛倫茲函數(shù)三元組:三元組j=洛倫茲(h1j,fj-f0j,wj,Dj)+洛倫茲(h2j,fj,wj,Dj)+洛倫茲(h3j,fj+f0j,wj,Dj),在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,h1=h3=h2/2。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,用于建立回歸模型的洛倫茲函數(shù)的三元組具有以下形式:或者,側(cè)洛倫茲函數(shù)相對(duì)于中心洛倫茲函數(shù)的位移(f0)可在為建立回歸模型而進(jìn)行的擬合期間確定。位移(f0)的單一值可用于所有的脂蛋白尺寸。類似地,側(cè)洛倫茲函數(shù)的強(qiáng)度可在為建立回歸模型而進(jìn)行的擬合期間估算。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,通過(guò)愛(ài)因斯坦-斯托克斯方程(EinsteinStokesequation)由脂蛋白顆粒尺寸估算模型函數(shù)的擴(kuò)散系數(shù):k(JK-1)為玻耳茲曼常數(shù),T(K)為溫度,η(Pas)為粘度并且RH為脂蛋白顆粒尺寸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,本發(fā)明的方法還包括利用NMR面積和對(duì)數(shù)個(gè)樣品稀釋度獲得的擴(kuò)散系數(shù)之間的關(guān)系校正估算的擴(kuò)散系數(shù)以將稀釋效應(yīng)考慮在內(nèi),其中所述樣品之總膽固醇和甘油三酯的濃度之和高于300mg/dL。有利地,使用將稀釋效應(yīng)考慮在內(nèi)的經(jīng)校正擴(kuò)散系數(shù)導(dǎo)致更精確的曲面擬合。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,校正與脂蛋白函數(shù)相關(guān)聯(lián)的NMR面積以只考慮脂蛋白顆粒核心中包含的脂質(zhì)的貢獻(xiàn)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,使用以下表達(dá)式確定所述校正NMR面積(A’):其中A(au)和分別為與每個(gè)模型函數(shù)相關(guān)聯(lián)的所述面積和脂蛋白顆粒尺寸,為脂蛋白顆粒的殼厚度并且p為所述顆粒殼中每單位體積的脫輔基蛋白質(zhì)量(mg/ml)相對(duì)于所述顆粒殼中每單位體積的總質(zhì)量(mg/ml)(蛋白質(zhì)、游離膽固醇和磷脂)的比。將在脂蛋白顆粒殼中的蛋白質(zhì)稱為載脂蛋白。比p取決于脂蛋白級(jí)分。對(duì)于HDL,p為約0.5。對(duì)于其他脂蛋白級(jí)分,p更小。一般來(lái)說(shuō),脂蛋白顆粒核心的厚度估算為本文中使用的術(shù)語(yǔ)“載脂蛋白”或“脫輔基蛋白”(即,在脂蛋白顆粒的殼中的蛋白質(zhì))指與脂質(zhì)結(jié)合以形成脂蛋白并且將脂質(zhì)運(yùn)輸通過(guò)循環(huán)系統(tǒng)的蛋白質(zhì)。載脂蛋白是可包圍脂質(zhì)產(chǎn)生脂蛋白顆粒的兩親性分子,所述脂蛋白顆粒自身是水溶性的并且因此可被運(yùn)載通過(guò)基于水的循環(huán)(即,血液)。有六類載脂蛋白(A-H)和數(shù)個(gè)亞類;特別地,ApoA-I(或ApoA1)是HDL顆粒的主要蛋白質(zhì)組分,其中還存在微濃度的ApoA-II(或ApoA2)。用于確定載脂蛋白濃度的說(shuō)明性的非限制性方法包括但不限于比色法、Western印跡或ELISA。如果在脂蛋白的分離級(jí)分中確定載脂蛋白濃度,則可使用本領(lǐng)域中用于確定蛋白質(zhì)濃度的任何公知方法,例如酶促發(fā)、比色法(Biuret、Lowry、Bradford等)或免疫化學(xué)技術(shù)(Western印跡、ELISA等)。如果在血漿或血清樣品中確定載脂蛋白濃度,則使用免疫化學(xué)技術(shù)以獲得載脂蛋白的特異性檢測(cè)。用于載脂蛋白檢測(cè)的說(shuō)明性的非限制性免疫化學(xué)技術(shù)包括免疫比濁技術(shù)、免疫濁度技術(shù)(immunonefelometrictechnique)、放射性免疫擴(kuò)散(radialimmunodiffusion)、ELISA、電免疫分析和放射免疫分析。隨著脂蛋白顆粒尺寸的減小,面積的校正愈加重要,即由于HDL顆粒的尺寸更小,對(duì)HDL顆粒的校正大于對(duì)LDL或VLDL顆粒的校正。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述方法另外包括確定選自以下的至少一個(gè)脂蛋白參數(shù):脂蛋白級(jí)分的平均顆粒尺寸、脂蛋白亞類的平均顆粒尺寸、級(jí)分脂蛋白顆粒濃度、亞類脂蛋白顆粒濃度以及至少一個(gè)脂蛋白顆粒亞類的脂質(zhì)濃度和/或至少一個(gè)脂蛋白顆粒級(jí)分的脂質(zhì)濃度。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,脂蛋白顆粒級(jí)分的平均尺寸如下確定:n為脂蛋白顆粒級(jí)分中包含的脂蛋白顆粒亞類的數(shù)目,為脂蛋白顆粒尺寸并且PNj為所述脂蛋白顆粒尺寸的顆粒數(shù)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,脂蛋白的顆粒數(shù)(PN)如下確定:其中A(au)和分別為與模型函數(shù)j相關(guān)聯(lián)的面積和脂蛋白顆粒尺寸。在本文件通篇,脂蛋白顆粒的尺寸應(yīng)理解為以埃表示的脂蛋白顆粒半徑。特定尺寸之脂蛋白顆粒的數(shù)目與以下比成比例:與對(duì)應(yīng)于所述脂蛋白之模型函數(shù)相關(guān)聯(lián)的面積和與所述脂蛋白相關(guān)聯(lián)的體積之間的比,該比例因子為所使用設(shè)備的校準(zhǔn)參數(shù)。優(yōu)選地,根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案,在確定顆粒數(shù)中,與脂蛋白函數(shù)相關(guān)聯(lián)的面積為校正面積A'以只考慮脂蛋白顆粒核心中包含之脂質(zhì)的貢獻(xiàn)。本文中使用的脂蛋白顆粒級(jí)分的平均尺寸指形成特定脂蛋白顆粒級(jí)分之一部分的脂蛋白半徑的平均尺寸。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,通過(guò)將脂質(zhì)體積除以脂蛋白顆粒體積計(jì)算脂蛋白顆粒級(jí)分的脂蛋白顆粒濃度。通過(guò)使用常用的換算因子將濃度單位換算成體積單位確定脂質(zhì)體積。通過(guò)計(jì)算對(duì)應(yīng)脂蛋白顆粒亞類的濃度之和獲得每個(gè)主要脂蛋白顆粒級(jí)分的總脂蛋白顆粒濃度。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,所述方法包括確定至少一個(gè)脂蛋白顆粒級(jí)分和/或至少一個(gè)脂蛋白顆粒亞類的脂質(zhì)濃度。更優(yōu)選地,使用回歸模型確定脂質(zhì)濃度。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,用通過(guò)在以下區(qū)域內(nèi)超速離心獲得的脂蛋白級(jí)分中測(cè)量的脂質(zhì)濃度來(lái)校準(zhǔn)回歸模型:5.4至5.15ppm、3.28至3.14ppm、2.15至1.85ppm、1.45至1ppm和1至0.7ppm。可使用其他方法來(lái)進(jìn)行校準(zhǔn),例如ELISA、色譜法、NMR或酶促法。確定脂蛋白顆粒級(jí)分或亞類的脂質(zhì)濃度包括確定選自以下的至少一種脂質(zhì):三酰甘油、膽固醇酯、游離膽固醇和磷脂。除此類相互排斥的特征和/或步驟的組合之外,本文件(包括權(quán)利要求書、說(shuō)明書和附圖)中所述的所有特征和/或所述方法的所有步驟均可以以任意組合進(jìn)行組合。附圖簡(jiǎn)述為了更好地理解本發(fā)明、其目的和優(yōu)勢(shì),本說(shuō)明書附有以下附圖,其中如下所示:圖1示出了根據(jù)本發(fā)明方法的甲基信號(hào)的去卷積,其中用于擬合的模型函數(shù)示于圖1A中,并且根據(jù)其脂蛋白級(jí)分而分組的模型函數(shù)示于圖1B中。圖2示出了兩個(gè)回歸模型,其分別使(a)尺寸和化學(xué)位移聯(lián)系起來(lái)以及使(b)寬度和化學(xué)位移聯(lián)系起來(lái)。圖3示出了甲基信號(hào)的NMR面積和擴(kuò)散系數(shù)之間的關(guān)系。圖4示出了在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中用于校準(zhǔn)脂質(zhì)確定的回歸模型的譜區(qū)。圖5示出了三種樣品的甲基信號(hào)的去卷積。發(fā)明詳述在根據(jù)本發(fā)明的用于表征脂蛋白顆粒的體外方法中,通過(guò)2D擴(kuò)散-排序1HNMR光譜學(xué)來(lái)分析樣品。一旦已經(jīng)獲得2D擴(kuò)散-排序1HNMR譜,則進(jìn)行對(duì)應(yīng)于甲基信號(hào)之譜部分的曲面擬合。使用多個(gè)模型函數(shù),每個(gè)模型函數(shù)對(duì)應(yīng)于具有特定脂蛋白顆粒尺寸的脂蛋白并且包括多個(gè)在擬合期間待估算的模型參數(shù)。與每個(gè)特定脂蛋白顆粒尺寸相關(guān)聯(lián)的模型函數(shù)為具有以下形式的洛倫茲函數(shù)的三元組:三元組=洛倫茲(h1,f-f0,w,D)+洛倫茲(h2,f,w,D)+洛倫茲(h3,f+f0,w,D),其中h(au)、f(ppm)、w(ppm)和D(cm2s-1)為待確定的模型參數(shù)并且分別是與脂蛋白信號(hào)相關(guān)聯(lián)的強(qiáng)度、化學(xué)位移、寬度和擴(kuò)散系數(shù)。模型參數(shù)在擬合期間作為模型參數(shù)組來(lái)估算,為此使實(shí)驗(yàn)NMR信號(hào)和作為模型函數(shù)之線性組合而建立的模型信號(hào)之間的差異最小化。圖1示出了對(duì)應(yīng)于2D擴(kuò)散-排序1HNMR實(shí)驗(yàn)之單一梯度的血清樣品的甲基信號(hào)的譜部分及其擬合。在此情況下,即使對(duì)多個(gè)擴(kuò)散梯度進(jìn)行了曲面擬合,但是為了提高清晰度已描繪針對(duì)單一梯度的擬合。圖1A以細(xì)跡線示出了用于擬合實(shí)驗(yàn)NMR譜的多個(gè)模型函數(shù),所述實(shí)驗(yàn)NMR譜也以粗跡線示出。由用模型函數(shù)擬合建立的理論模型信號(hào)以點(diǎn)線示出。每個(gè)模型函數(shù)根據(jù)其脂蛋白顆粒尺寸可與給定的脂蛋白顆粒級(jí)分相關(guān)聯(lián)。在圖1B中,細(xì)線對(duì)應(yīng)于與每種對(duì)應(yīng)脂蛋白級(jí)分(在該實(shí)施例中:VLDL、LDL、HDL)相關(guān)聯(lián)的模型信號(hào)之和。在該實(shí)施例中,如下進(jìn)行曲面擬合:固定除信號(hào)強(qiáng)度之外的所有參數(shù)(化學(xué)位移、寬度和擴(kuò)散系數(shù)),而非估算每個(gè)洛倫茲函數(shù)之三元組的所有參數(shù)。三元組洛倫茲函數(shù)使用以下形式:中心信號(hào)周圍的兩個(gè)信號(hào)相對(duì)于中心信號(hào)位移0.01ppm。為了固定與每個(gè)模型函數(shù)相關(guān)聯(lián)的化學(xué)位移和寬度,預(yù)先使用其所有參數(shù)自由的三個(gè)三元組洛倫茲函數(shù)對(duì)300個(gè)譜進(jìn)行去卷積。一旦已獲得最佳擬合這300個(gè)實(shí)驗(yàn)譜的參數(shù)組,則將其用于擬合待用作固定參數(shù)的預(yù)示的兩個(gè)回歸模型,第一回歸模型使化學(xué)位移和尺寸聯(lián)系起來(lái)(圖2a),而第二回歸模型使寬度和化學(xué)位移聯(lián)系起來(lái)(圖2b)。圖2a和圖2b分別示出了經(jīng)估算參數(shù)之作為尺寸的函數(shù)繪圖的化學(xué)位移和作為化學(xué)位移的函數(shù)繪圖的寬度,由其可確定使這兩個(gè)參數(shù)對(duì)聯(lián)系起來(lái)的對(duì)應(yīng)關(guān)系。因此,以固定的脂蛋白顆粒尺寸,可使用建立的回歸模型估算其NMR化學(xué)位移和寬度??山⒌谌貧w模型以使擴(kuò)散系數(shù)與另一參數(shù)聯(lián)系起來(lái)?;蛘?,可使用愛(ài)因斯坦-斯托克斯方程由脂蛋白顆粒尺寸獲得擴(kuò)散系數(shù):優(yōu)選地,基于實(shí)驗(yàn)并且對(duì)應(yīng)于多個(gè)不同的脂蛋白顆粒亞類來(lái)選擇脂蛋白顆粒尺寸,這使得能夠獲得更加完整且可靠的脂蛋白譜。優(yōu)選地,對(duì)已確定的擴(kuò)散系數(shù)進(jìn)行校正以將可能的稀釋效應(yīng)考慮在內(nèi)。為了研究所需的校正程度,在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中,對(duì)具有高甘油三酯水平(16mmol/L)的血清樣品和不同稀釋度的相同樣品(1∶2、1∶4、1∶8和1∶16)進(jìn)行分析(圖3)。然后,利用NMR面積和擴(kuò)散系數(shù)之間的關(guān)系預(yù)測(cè)每個(gè)NMR信號(hào)所需的校正:其中D0為在稀釋條件下的平均擴(kuò)散系數(shù),D和A(au)分別為甲基峰的平均擴(kuò)散系數(shù)和總面積,并且kS1、kS2為回歸系數(shù)。為了確定平均擴(kuò)散系數(shù),對(duì)每份樣品獲得多個(gè)譜,在不同的梯度強(qiáng)度下獲得每個(gè)譜。作為梯度之函數(shù)繪圖的甲基曲線下面積隨梯度的增加呈指數(shù)衰減。因此,平均擴(kuò)散系數(shù)與將信號(hào)衰減(A/A0)之對(duì)數(shù)相對(duì)于梯度之平方繪圖時(shí)獲得的線的斜率成比例:log(A/A0)=-kDG2其中A為甲基信號(hào)面積,A0為零梯度下的甲基信號(hào)面積,k為恒定參數(shù),并且G為梯度強(qiáng)度。在所選脂蛋白顆粒尺寸以及針對(duì)每個(gè)脂蛋白顆粒尺寸待確定的化學(xué)位移、寬度和擴(kuò)散系數(shù)下,確定每個(gè)模型函數(shù)的信號(hào)強(qiáng)度以使實(shí)驗(yàn)NMR信號(hào)和由所考慮的多個(gè)模型信號(hào)建立的模型信號(hào)之間的差異最小化。可使用以下方程通過(guò)使歸一化均方根誤差(normalizedrootmeansquarederror,NRMSE)最小化進(jìn)行擬合:其中Sexp和Sest分別為實(shí)驗(yàn)和估算的表面積(surface),n為所考慮數(shù)據(jù)點(diǎn)的數(shù)目,并且m為所使用梯度的數(shù)目。一旦已確定模型參數(shù),則可通過(guò)將與每個(gè)模型函數(shù)相關(guān)聯(lián)的NMR面積除以其相關(guān)聯(lián)體積來(lái)獲得顆粒加權(quán)的脂蛋白尺寸:其中Aj、和PNj為給定脂蛋白顆粒j的面積(au)、體積和顆粒數(shù)使顆粒數(shù)與面積和體積之間的比聯(lián)系起來(lái)的比例因子可容易地通過(guò)使NMR面積和脂質(zhì)濃度直接聯(lián)系起來(lái)的已知校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)獲得。然后,可通過(guò)將NMR脂蛋白顆粒尺寸乘以其相對(duì)于給定級(jí)分之總顆粒濃度的級(jí)分顆粒濃度來(lái)獲得每個(gè)脂蛋白顆粒級(jí)分的平均顆粒尺寸:其中Z對(duì)應(yīng)于給定脂蛋白顆粒級(jí)分的平均脂蛋白顆粒尺寸。校準(zhǔn)PLS回歸模型以預(yù)測(cè)主要脂蛋白顆粒級(jí)分(VLDL、LDL和HDL)的膽固醇和甘油三酯濃度。使用5.4至5.15ppm、3.28至3.14ppm、2.15至1.85ppm、1.45至1ppm和1至0.7ppm(示于圖4)的區(qū)域作為X-塊(block),并且使用膽固醇和甘油三酯的濃度作為Y-塊。這兩個(gè)塊都是均值中心化的。使用將數(shù)據(jù)拆分10次的百葉窗交互驗(yàn)證(venetianblindscross-validation)評(píng)估潛在變量(latentvariable,LV)的最佳數(shù)目和PLS模型的驗(yàn)證性能。預(yù)測(cè)濃度和參照濃度之間的決定系數(shù)在校準(zhǔn)步驟中為0.79至0.98。驗(yàn)證步驟的決定系數(shù)為0.81至0.98。確定脂蛋白顆粒級(jí)分或亞類的脂質(zhì)濃度包括確定選自以下的至少一種脂質(zhì):三酰甘油、膽固醇酯、游離膽固醇和磷脂。甘油三酯(或三酰甘油)是由甘油和3個(gè)脂肪酸衍生的脂,其可見(jiàn)于脂蛋白顆粒中。可見(jiàn)于脂蛋白甘油三酯中的說(shuō)明性的非限制性脂肪酸是棕櫚酸、硬脂酸(estearicacid)、油酸、亞油酸和花生四烯酸(araquidonicacid)。甘油三酯是有助于實(shí)現(xiàn)來(lái)自肝的血糖和脂肪的雙向轉(zhuǎn)移的血脂。用于確定甘油三酯濃度的說(shuō)明性的非限制性方法包括酶促測(cè)定。甘油三酯的酶促測(cè)定由于其具有特異性和靈敏性也是可能的。反應(yīng)原理如下:甘油三酯被脂肪酶水解成甘油和游離脂肪酸。在甘油激酶存在的情況下,甘油被磷酸化成甘油-3-磷酸,其然后經(jīng)磷酸甘油氧化酶氧化,伴隨著形成過(guò)氧化氫。在過(guò)氧化物酶存在的情況下,4-氯苯酚和4-氨基安替比林與過(guò)氧化氫產(chǎn)生紅色產(chǎn)物,醌亞胺。染色強(qiáng)度與甘油三酯的樣品濃度直接成比例。膽固醇是一種兩親性脂質(zhì)。膽固醇酯是膽固醇的脂,其中在脂肪酸的羧酸基團(tuán)和膽固醇的羥基之間形成酯鍵。存在于脂蛋白顆粒中的膽固醇酯的說(shuō)明性的非限制性實(shí)例是膽固醇棕櫚酸酯、膽固醇硬脂酸酯、膽固醇油酸酯、膽固醇亞油酸酯和膽固醇花生四烯酸酯(Skipski,V.P.In:BloodLipidsandLipoproteins.Quantitation,CompositionandMetabolism.第471-483頁(yè)(編輯G.J.Nelson,Wiley-Interscience,NewYork)(1972))。與膽固醇相比,膽固醇酯在水中具有更低的溶解度并且更疏水。多種方法可用于確定膽固醇濃度,例如重量分析法、濁度測(cè)定法、比濁法或光度測(cè)定法等??墒褂糜糜诙勘壬?熒光膽固醇和膽固醇酯測(cè)定的市售試劑盒。通常來(lái)說(shuō),確定總的和游離的膽固醇(酯化的膽固醇預(yù)先通過(guò)例如毛地黃皂苷沉淀)的濃度,而膽固醇酯(酯化的膽固醇)的濃度由這兩個(gè)濃度之間的差異計(jì)算。膽固醇濃度的酶促測(cè)定是特異性且靈敏的。反應(yīng)原理如下:膽固醇酯酶催化膽固醇酯水解為游離膽固醇和游離脂肪酸。在膽固醇氧化酶存在的情況下,膽固醇被氧化為δ-4-膽固烷三醇以形成過(guò)氧化氫。在過(guò)氧化物酶存在的情況下,苯酚和4-氨基安替比林與過(guò)氧化氫產(chǎn)生紅色產(chǎn)物,醌亞胺。染色強(qiáng)度與總膽固醇的樣品濃度直接成比例。磷脂是這樣的一類脂質(zhì),其存在于脂蛋白顆粒的殼中并且由于其可形成脂質(zhì)雙層而是所有細(xì)胞膜的主要組分。大部分的磷脂包含甘油二酯、磷酸基團(tuán)和簡(jiǎn)單的有機(jī)分子,例如膽堿。磷脂分子的結(jié)構(gòu)一般由疏水尾和親水頭組成。存在于脂蛋白顆粒中的磷脂的說(shuō)明性的非限制性實(shí)例是磷脂酰膽堿、神經(jīng)鞘氨醇磷脂(例如鞘磷脂)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酰絲氨酸。用于確定磷脂濃度的說(shuō)明性的非限制性方法包括用于定量比色/熒光磷脂測(cè)定的市售測(cè)定試劑盒。反應(yīng)原理如下:磷脂(例如卵磷脂、溶血卵磷脂和鞘磷脂)被酶促水解成膽堿,使用膽堿氧化酶和H2O2特異性染料來(lái)對(duì)其進(jìn)行確定。粉紅色產(chǎn)物在570nm下的光密度或者熒光強(qiáng)度(530/585nm)與樣品中的磷脂濃度直接成比例。實(shí)施例2D擴(kuò)散-排序1HNMR光譜學(xué)(DOSY):通過(guò)NMR光譜學(xué)在BrukerAvanceIII光譜儀上于310K下記錄1HNMR譜來(lái)分析血清樣品。將雙重刺激回聲(doublestimulatedecho,DSTE)脈沖程序與雙極梯度脈沖和縱向渦電流延遲(longitudinaleddycurrentdelay,LED)一起使用。弛豫延遲(relaxationdelay)為2秒,將自由感應(yīng)衰減采集成64K復(fù)數(shù)數(shù)據(jù)點(diǎn)(complexdatapoint),并且要求對(duì)每份樣品進(jìn)行32次掃描。在32個(gè)步驟中將梯度脈沖強(qiáng)度從最大強(qiáng)度53.5高斯cm-1的5%提高至95%,在此平方梯度脈沖強(qiáng)度呈線性分布。曲面擬合:在本實(shí)施例中,將脂蛋白NMR信號(hào)建模為以下洛倫茲函數(shù)的三元組,其中中心信號(hào)周圍的兩個(gè)信號(hào)位移0.01ppm:其中h(au)、f(ppm)、w(ppm)和D(cm2s-1)為給定脂蛋白信號(hào)的強(qiáng)度、化學(xué)位移、寬度和擴(kuò)散系數(shù),每個(gè)脂蛋白信號(hào)與脂蛋白顆粒尺寸相對(duì)應(yīng)?;谕ㄟ^(guò)HPLC獲得的脂蛋白顆粒尺寸,使用9個(gè)脂蛋白顆粒尺寸并且因此也使用9個(gè)模型函數(shù)。這9個(gè)模型函數(shù)根據(jù)其NMR大小與給定的脂蛋白顆粒級(jí)分(VLDL、LDL或HDL)相關(guān)聯(lián)。因此,函數(shù)F1至F3與VLDL相關(guān)聯(lián),函數(shù)F4至F6與LDL相關(guān)聯(lián),并且函數(shù)F7至F9與HDL相關(guān)聯(lián)(表1)。將主要脂蛋白顆粒級(jí)分限定為VLDLLDL和HDL使用具有固定除信號(hào)強(qiáng)度(h)之外的所有參數(shù)(化學(xué)位移、寬度和擴(kuò)散系數(shù))的9個(gè)模型函數(shù)來(lái)進(jìn)行甲基信號(hào)的曲面擬合。每份樣品的擬合平均耗時(shí)29.47±4.42秒。因此,將甲基信號(hào)分解成單個(gè)脂蛋白信號(hào)以獲得具有固定NMR尺寸之9種脂蛋白的貢獻(xiàn)。圖5A至C示出了三個(gè)對(duì)象的曲面擬合的結(jié)果,其也總結(jié)于表1中。必須指出的是,即使使用9個(gè)模型函數(shù)來(lái)擬合譜,但是并非其所有均用于找到最終解決方案。圖5D至F示出了模型函數(shù)根據(jù)其相關(guān)聯(lián)的脂蛋白顆粒主要級(jí)分的分組。對(duì)象1示出明顯的HDL面積(在圖5D中以深灰色示出),對(duì)象2具有增加的LDL面積(在圖5E中以淺灰色示出)并且對(duì)象3以非常高的VLDL面積為特征(在圖5F中以中等灰色示出)。通過(guò)用隨機(jī)選擇的初始信號(hào)強(qiáng)度值擬合每份樣品10次來(lái)研究解決方案的唯一性。由于信號(hào)強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)范圍可非常高,因此使用下式來(lái)評(píng)估每個(gè)模型函數(shù)和樣品在10次不同擬合之間的變異系數(shù)(CV):其中h代表給定模型函數(shù)的信號(hào)強(qiáng)度。最大(Max)、最小(Min)和標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)值由在每份樣品中的10次擬合來(lái)評(píng)估。結(jié)果,在10輪之后獲得對(duì)所有樣品的唯一解決方案。在此情況下,確定中心洛倫茲的信號(hào)強(qiáng)度的變異系數(shù)(CV),因?yàn)槠渌P秃瘮?shù)已在擬合期間固定。用于計(jì)算變異系數(shù)的上述表達(dá)式可通用于其中在擬合中使用一個(gè)以上自由模型參數(shù)的情況。擬合的歸一化均方根誤差(NRMSE)使用以下方程來(lái)計(jì)算:其中Sexp和Sest分別為實(shí)驗(yàn)和估算的表面積,n為在間隔長(zhǎng)度(0.7至1ppm)內(nèi)所考慮的數(shù)據(jù)點(diǎn)的數(shù)目,并且m為所使用梯度的數(shù)目。在該實(shí)施例中,n和m對(duì)每份樣品而言具有相同值。獲得的平均NRMSE小于1.5%。為了獲得顆粒加權(quán)的脂蛋白尺寸,我們首先將每個(gè)NMR面積除以其相關(guān)聯(lián)的體積:其中Aj、和PNj為給定脂蛋白顆粒j的面積(au)、體積和顆粒數(shù)然后,如下獲得每個(gè)脂蛋白顆粒級(jí)分的平均顆粒尺寸:將脂蛋白顆粒尺寸乘以其相對(duì)于給定顆粒級(jí)分的總顆粒濃度的級(jí)分顆粒濃度。通過(guò)將脂質(zhì)體積除以顆粒體積計(jì)算每個(gè)脂蛋白顆粒亞類的顆粒濃度。通過(guò)使用常用的換算因子將濃度單位換算成體積單位來(lái)確定脂質(zhì)體積。通過(guò)計(jì)算對(duì)應(yīng)顆粒亞類的濃度之和獲得每個(gè)主要顆粒級(jí)分的總顆粒濃度。使用在圖4中所示的區(qū)域內(nèi)校準(zhǔn)的PLS模型來(lái)確定脂質(zhì)濃度,即:5.4至5.15ppm、3.28至3.14ppm、2.15至1.85ppm、1.45至1ppm和1至0.7ppm。通過(guò)順序超速離心獲得參照脂質(zhì)并且其對(duì)應(yīng)于3種脂蛋白顆粒級(jí)分(VLDL、LDL和HDL)的膽固醇和甘油三酯。本發(fā)明的方法允許獲得高級(jí)脂蛋白譜,如表1中所示。來(lái)自全組之3個(gè)代表性對(duì)象的ALT報(bào)道出于舉例說(shuō)明的目的而總結(jié)于表1中。對(duì)象1血脂正常,對(duì)象2顯示具有高LDL膽固醇水平(血膽固醇過(guò)多),并且對(duì)象3顯示高甘油三酯和低HDL膽固醇水平(致動(dòng)脈粥樣化性血脂異常)。本發(fā)明的方法提供了主要脂蛋白級(jí)分及其亞類的總膽固醇(C)、甘油三酯(TG)和顆粒濃度(P)。另外,本發(fā)明的方法提供了主要脂蛋白級(jí)分的尺寸。對(duì)象1表現(xiàn)出正常脂質(zhì)水平(限定為VLDL-TG<150mg/dL、LDL-C<160mg/dL且HDL-C>40mg/dL),對(duì)象2表現(xiàn)出升高的LDL-C水平以及正常的VLDL-TG和HDL-C水平,并且對(duì)象3表現(xiàn)出升高的VLDL-TG水平、降低的HDL-C水平和正常LDL-C水平。還應(yīng)指出的是,對(duì)象3盡管LDL-C水平正常,但具有提高的LDL-水平P,并且其小LDL-P濃度高于對(duì)象2中的濃度。因此,甘油三酯水平升高的對(duì)象與增加的LDL-P值相關(guān),這是因?yàn)楦视腿舛仍黾訉?dǎo)致形成較大濃度的較小LDL顆粒。高級(jí)脂蛋白測(cè)試已示出,這些脂蛋白參數(shù)和心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)(Sniderman,A.和P.O.Kwiterovich.2013.Updateonthedetectionandtreatmentofatherogeniclow-densitylipoproteins.Currentopinioninendocrinology,diabetes,andobesity20:140-147)。例如,在一項(xiàng)研究中,在調(diào)整協(xié)變量之后,HDL顆粒(HDL-P)的數(shù)目而非高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)濃度獨(dú)立地與頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度相關(guān)聯(lián)(Mackey,R.H.,P.Greenland,D.C.Goff,Jr.,D.Lloyd-Jones,C.T.Sibley和S.Mora.2012.High-densitylipoproteincholesterolandparticleconcentrations,carotidatherosclerosis,andcoronaryevents:MESA(動(dòng)脈粥樣硬化的多種族研究).JAmCollCardiol60:508-516)。最后,與使用Framingham風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分之風(fēng)險(xiǎn)因素的預(yù)測(cè)模型中的常規(guī)脂質(zhì)測(cè)量相比,使用脂蛋白顆粒亞類改善了對(duì)亞臨床動(dòng)脈粥樣硬化之NMR得出的風(fēng)險(xiǎn)分級(jí)(Wurtz,P.,J.R.Raiko,C.G.Magnussen,P.Soininen,A.J.Kangas,T.Tynkkynen,R.Thomson,R.Laatikainen,M.J.Savolainen,J.Laurikka,P.Kuukasjarvi,M.Tarkka,P.J.Karhunen,A.Jula,J.S.Viikari,M.Kahonen,T.Lehtimaki,M.Juonala,M.Ala-Korpela和O.T.Raitakari.2012.High-throughputquantificationofcirculatingmetabolitesimprovespredictionofsubclinicalatherosclerosis.EuropeanHeartJournal33:2307-2316)。表1.使用本發(fā)明方法獲得的脂蛋白參數(shù)的總結(jié)對(duì)象1對(duì)象2對(duì)象3脂質(zhì)(mg/dL)VLDL-TG13.722.6150.3LDL-C105.4161.8127.0LDL-TG14.920.918.4HDL-C66.549.534.4HDL-TG7.16.611.0顆粒濃度*VLDL-P12.422.0106.3大VLDL-P0.20.35.9中等VLDL-P1.01.921.6小VLDL-P11.119.778.8LDL-P980.61399.11230.4大LDL-P80.0184.323.7中等LDL-P212.4406.8310.5小LDL-P688.2808.0896.1HDL-P32.227.125.9大HDL-P2.41.30.3中等HDL-P10.06.83.6小HDL-P19.819.022.0尺寸(nm)VLDL39.038.942.2LDL19.720.119.5HDL8.28.07.8*VLDL/LDL:nmol/L;HDL:μmol/L當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 
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