本發(fā)明涉及一種用于測定樣品基質(zhì)中分析物的方法，特別是谷物中霉菌毒素水平的測定方法，特別是涉及使用溶劑進(jìn)行分析物提取的方法。

背景技術(shù)：

霉菌毒素往往非常穩(wěn)定，當(dāng)通過任何其他方式攝取、吸入或引入體內(nèi)時都可能會產(chǎn)生嚴(yán)重的疾病。例如，霉菌毒素當(dāng)被人類或動物攝入時被認(rèn)為是有毒的或致癌的。霉菌毒素在食物和飼料生長期間由霉菌和真菌產(chǎn)生，并且在產(chǎn)生它們的霉菌或真菌已經(jīng)死亡之后，可能會保留在食物和飼料中。因此，不明顯發(fā)霉或霉菌計數(shù)測試不呈陽性的產(chǎn)品仍然可能含有潛在的危險水平的霉菌毒素。

幾個國家目前已經(jīng)制定或提出了食品和動物飼料中霉菌毒素(主要是黃曲霉毒素)的控制規(guī)定。為了協(xié)調(diào)這些規(guī)定，例如，食品和藥物管理局已經(jīng)制定了商品進(jìn)一步加工所允許的黃曲霉毒素水平的指導(dǎo)方針。允許的水平根據(jù)商品的預(yù)期最終用途而有所不同。例如，歐盟也制定了赭曲霉毒素a(ota)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(don)、玉米赤霉烯酮(zea)和其他幾種霉菌毒素的水平的規(guī)定。

執(zhí)行這些規(guī)定要求準(zhǔn)確監(jiān)測可疑商品。然而，由于霉菌毒素傾向于不均勻地分布在大量的谷物中，對于需要代表特定批次的樣品數(shù)量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室分析將變得非常昂貴。因此，需要一種快速和便宜的方法來檢測大量谷粒中霉菌毒素的存在，從而可以快速鑒定含有霉菌毒素的批次，以便在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)一步進(jìn)行更準(zhǔn)確的分析。

溶劑提取在大多數(shù)檢測方法中是重要的一步。實(shí)際上很多權(quán)威機(jī)構(gòu)都沒有規(guī)定具體的測定方法要求；而是執(zhí)行某些性能標(biāo)準(zhǔn)：例如，根據(jù)2006年2月23日的歐盟委員會條例(ec)第401/2006號標(biāo)準(zhǔn)，其中規(guī)定包括提取效率要求，規(guī)定回收率為50％至120％，具體取決于霉菌毒素。通常，選擇這些要求是為了確保任何測試方法將達(dá)到可接受的精度水平、準(zhǔn)確度和檢測水平。如果提取不能可靠且一致地進(jìn)行，則分析結(jié)果將是不精確的。因此普遍接受的是，提取應(yīng)該進(jìn)行足夠長的時間以達(dá)到提取過程的平衡；在霉菌毒素分析的參考方法的情況下，這段時間是一小時。顯然，這大大增加了整體分析時間，并偏離了提供快速測定方法。

然而，從zabe等人(“ethanolextractionmethodforarapidtestforaflatoxinincorn(用于玉米黃曲霉毒素快速檢測的乙醇提取方法)”，第297-305頁，acs研討會系列1001-食品污染物-霉菌毒素和食物過敏原)已知的是，提供包括快速溶劑提取霉菌毒素的方法。這里公開了在一分鐘內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)使用80體積％乙醇和20％水的混合物從玉米中充分提取黃曲霉毒素以滿足規(guī)章要求。不幸的是，這一水平的乙醇代表著一個小但仍然是不可接受的火災(zāi)風(fēng)險，同時也提供了一種對健康和環(huán)境有害的溶劑解決方案。

fossanalyticalab的wo2011/023230中描述了另一種提取方法。這里公開了使用體積20％乙醇和80％水的溶劑混合物可以從谷粒中充分提取霉菌毒素。這顯著降低了與更高濃度的乙醇或其他有機(jī)溶劑(如甲醇或乙腈)相關(guān)的風(fēng)險和危害方面，但不幸的是，足夠的提取需要大約1小時才能實(shí)現(xiàn)，這不適用于快速測定技術(shù)。

發(fā)明概述

本發(fā)明的目的是減輕與已知提取技術(shù)相關(guān)的至少一個問題。

根據(jù)本發(fā)明的一個方面，提供了一種用于從樣品基質(zhì)、特別是谷粒中提取的一種或多種分析物、特別是霉菌毒素的定量測定的方法，其包括以下步驟，基本上不按照所示的順序：a)在多個參考樣品基質(zhì)上進(jìn)行分析物提取，每個參考樣品基質(zhì)具有不同的分析物參考值水平，所述分析物提取包括在相同的提取周期內(nèi)將每個樣品基質(zhì)與溶劑組合，所述提取周期小于達(dá)到平衡所需的時間；并從樣品基質(zhì)中分離含有分析物的溶劑；b)測量從每個參考樣品基質(zhì)獲得的分離溶劑中存在的分析物的水平；c)產(chǎn)生計算機(jī)可執(zhí)行校準(zhǔn)，通過該計算機(jī)可執(zhí)行校準(zhǔn)建立從每個參考基質(zhì)中提取的分析物的水平與相同的每個參考基質(zhì)中的分析物的參考水平之間的數(shù)學(xué)關(guān)系；d)重復(fù)步驟a和b，將具有未知水平分析物的樣品基質(zhì)替換為參考樣品基質(zhì)，以獲得用于樣品基質(zhì)的分離的溶劑中的分析物水平的量度；以及e)在計算機(jī)中將在步驟c產(chǎn)生的校準(zhǔn)應(yīng)用于在步驟d確定的分析物的水平，從而得到樣品基質(zhì)中分析物水平的量度。通過認(rèn)識到在可重復(fù)的提取條件下的可靠且可重復(fù)的不完全的非平衡提取可能與將從平衡提取獲得的、樣品基質(zhì)中存在的分析物水平相關(guān)，發(fā)明人提供了不依賴于達(dá)到提取平衡的檢定方法。這允許在較短時間內(nèi)和/或通常被認(rèn)為不合適的溶劑進(jìn)行測定。

為了實(shí)現(xiàn)快速分離，從而提高提取過程的可靠性和可重復(fù)性，可以通過施加力以分離固體和液體材料來有效地進(jìn)行分離。這可以通過迫使溶劑/基質(zhì)混合物通過過濾器來完成，例如可以使用法式壓機(jī)簡單且可靠地實(shí)現(xiàn)，或者通過使用通常為沉淀物或過濾器類型的離心機(jī)來實(shí)現(xiàn)。

應(yīng)當(dāng)理解，一個人(合法或真實(shí))完全可能執(zhí)行直到并包括生成校準(zhǔn)模型(上述步驟a至c)的步驟并且另一個人(合法或真實(shí))可執(zhí)行對具有未知水平分析物的樣品基質(zhì)進(jìn)行提取和水平測量并將校準(zhǔn)模型應(yīng)用于這些測量。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種用于檢定樣品基質(zhì)中的一種或多種分析物的方法，包括以下步驟：在樣品基質(zhì)上進(jìn)行分析物提取，所述分析物提取包括在提取周期內(nèi)將樣品基質(zhì)與溶劑組合，提取周期小于達(dá)到平衡所需的時間，并從樣品基質(zhì)中分離含有分析物的溶劑；測量分離的溶劑中存在的分析物的水平；并在計算機(jī)中應(yīng)用校準(zhǔn)，通過該校準(zhǔn)建立了借助于上文在樣品基質(zhì)的提取中使用的方法從多個參考樣品中的每一個提取的分析物的水平與每個參考樣品的分析物水平的參考值之間的數(shù)學(xué)關(guān)系，從而得到樣品基質(zhì)中分析物水平的量度。

通過以下參考附圖的附圖對本發(fā)明的實(shí)施例的說明性和非限制性的詳細(xì)描述，將更好地理解本發(fā)明的這些以及附加的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)，其中：

附圖說明

圖1示出了說明根據(jù)本發(fā)明的方法的實(shí)施例的流程圖；

圖2示出了在實(shí)驗(yàn)研究中使用的根據(jù)本發(fā)明的方法的第二實(shí)施例的流程圖；

圖3示出了使用不同溶劑的don的時間依賴性回收率；

圖4示出了使用不同溶劑的ota的時間依賴性回收率；

圖5示出了通過hplc所發(fā)現(xiàn)的don濃度和參考濃度之間的相關(guān)性；

圖6示出了通過hplc所發(fā)現(xiàn)的ota濃度和參考濃度之間的相關(guān)性；

圖7示意性地示出了適用于在根據(jù)本發(fā)明的方法中測量分析物水平的流式細(xì)胞儀裝置；和

圖8示出了定義提取平衡的圖示說明。

發(fā)明詳述

根據(jù)本發(fā)明的用于檢定分析物的示例性方法通常由圖1的流程圖示出。在步驟110，進(jìn)行分析物提取。這包括將樣品基質(zhì)與溶劑混合，可能包括搖動或其他攪拌以確保良好的混合，然后在比達(dá)到平衡所需時間短的提取周期之后將樣品基質(zhì)與溶劑分離，但在此期間從基質(zhì)中提取的分析物可以以可測量的量移入溶劑中。

一旦分離，在步驟120測量溶劑中分析物的水平。該測定中使用的測量技術(shù)當(dāng)然取決于所研究的分析物。將對具有不同參考分析物水平的多個參考樣品基質(zhì)中的每一個重復(fù)步驟110和120，并且每個樣品基質(zhì)的結(jié)果對計算機(jī)可用。獲得每個參考基質(zhì)中包含的分析物水平的參考值(步驟130)，并且也可供計算機(jī)使用。這些參考值可以從有意引入?yún)⒖蓟|(zhì)的分析物水平的知識或從對基質(zhì)進(jìn)行的參考測量中獲得。在后一種情況下，如果將相同的測量技術(shù)用于獲得溶劑中分析物的水平所用的技術(shù)是有利的。在步驟140中，從參考水平值(參考數(shù)據(jù)集)以及與在同樣品基質(zhì)的分離溶劑(溶劑數(shù)據(jù)集)中測量的水平值構(gòu)建計算機(jī)可執(zhí)行數(shù)學(xué)模型，該計算機(jī)可執(zhí)行數(shù)學(xué)模型將溶劑中測量的分析物的量與存在于樣品基質(zhì)中的分析物相關(guān)聯(lián)。數(shù)據(jù)集的回歸分析用于以已知方式對變量之間的關(guān)系進(jìn)行建模。特別地，可以對數(shù)據(jù)集執(zhí)行簡單的線性回歸，以便確定要在計算機(jī)可執(zhí)行校準(zhǔn)模型中表達(dá)的數(shù)學(xué)關(guān)系。然后將該模型提供給相同或不同的計算機(jī)用于測定測試樣品基質(zhì)中的分析物的水平。

在步驟150，使用具有未知水平的分析物的測試樣品基質(zhì)進(jìn)行分析物提取。在該步驟150中采用的提取程序需要基本上類似于在步驟110中采用的從參考樣品基質(zhì)中提取分析物的方法。應(yīng)當(dāng)理解，“基本上”被認(rèn)為包括從步驟110采用的提取程序變化到不可測量地影響從相同參考基質(zhì)提取到溶劑中的分析物的量的程度。一旦分離，就使用測量在步驟120從樣品基質(zhì)提取的分析物的水平所采用的基本上相似的測量技術(shù)和方法來進(jìn)行在分離的溶劑中存在的分析物水平的測量(步驟160)。該測量水平被提供給已經(jīng)被提供對計算機(jī)可執(zhí)行校準(zhǔn)模型的訪問權(quán)的計算機(jī)，并且在步驟170，計算機(jī)將校準(zhǔn)應(yīng)用于所測量的水平，并且定量地測定存在于未知樣品基質(zhì)中的分析物的量，其中然后該值可以按機(jī)器或優(yōu)選地人類可理解的格式從計算機(jī)輸出。

應(yīng)當(dāng)理解，上述過程步驟不一定按照關(guān)于該特定實(shí)施例提供的順序來執(zhí)行，并且并不是落入本發(fā)明的范圍的所有的處理步驟都需要由相同的人執(zhí)行或以相同的頻率執(zhí)行。實(shí)際上，一個人(合法或真實(shí))完全可能執(zhí)行直到并包括產(chǎn)生校準(zhǔn)模型(步驟110至140)的步驟，而另一個人(合法或真實(shí))可以對具有未知水平的分析物的樣品基質(zhì)進(jìn)行提取和水平測量，并將校準(zhǔn)模型應(yīng)用于這些測量(步驟150至170)。

通常，可以大量多次執(zhí)行未知樣品的檢定中所涉及的步驟(步驟150至170)，而生成校準(zhǔn)模型所涉及的步驟(步驟110至140)可能相對較少地進(jìn)行。因此，根據(jù)用于檢定樣品基質(zhì)中的一種或多種分析物的另一示例性方法，待進(jìn)行的步驟包括在樣品基質(zhì)上進(jìn)行分析物提取150，所述分析物提取包括在提取周期內(nèi)將樣品基質(zhì)與溶劑組合，提取周期小于達(dá)到平衡所需的量，并從樣品基質(zhì)中分離含有分析物的溶劑；測量分離的溶劑中存在的分析物的水平(步驟160)；并且在步驟170，在計算機(jī)中應(yīng)用校準(zhǔn)，通過該校準(zhǔn)建立了借助于以上在樣品基質(zhì)的提取中使用的過程從多個參考樣品中的每一個提取的分析物的水平與每個參考樣品的分析物水平的參考值之間的數(shù)學(xué)關(guān)系，從而得出樣品基質(zhì)中分析物水平的量度。

步驟160(在一個實(shí)施方案中也可以在步驟120中)的分析物水平的測量可有利地使用使用微珠770的圖7所示的常規(guī)流式細(xì)胞儀裝置710進(jìn)行，微珠770在其表面具有對分離的溶劑中的目標(biāo)分析物的優(yōu)先結(jié)合親和力的分子。這樣的分子可以是抗體、適體、分子印跡聚合物或?qū)Υ龣z定水平的分析物之一具有優(yōu)先結(jié)合親和力的任何已知分子。本示例性實(shí)施例的裝置710包括流動池720；光源730；一個或多個光學(xué)檢測器(這里是兩個，740a，740b)；以及可操作地連接以接收檢測器740a，740b的輸出的信號處理器750。

將在步驟150獲得的分離的溶劑與已知量的熒光標(biāo)記的分析物分子和包被的微珠770混合。來自分離的溶劑的分析物和熒光標(biāo)記的分析物分子在微觀上競爭可用的結(jié)合位點(diǎn)，一旦已經(jīng)達(dá)到平衡，來自珠粒的熒光將反映其相對濃度。傳統(tǒng)上，通過使用試劑30-60分鐘孵化使該反應(yīng)平衡，但本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，定量信息可在孵化數(shù)分鐘后提取，盡管不確定性增加?？梢酝ㄟ^跟蹤反應(yīng)動力學(xué)，而不是在固定的時間窗中測量，來增加基于早期測量的預(yù)測的魯棒性。

將含有孵化的試劑的溶液通過樣品入口700注入流動池720中，并被無顆粒的鞘液790包圍。溶液以微珠770懸浮于其中的流體動力學(xué)聚焦的樣品流760流過流動池720?；締紊獾墓馐?80由光源730(例如激光光源或發(fā)光二極管)產(chǎn)生，并且被入射到流動池720中的聚焦樣品流760上。通過將光束聚焦到一個小斑點(diǎn)，單獨(dú)的珠子可以被光學(xué)地尋址，珠子上標(biāo)記的分析物的熒光可以與溶液中標(biāo)記的分析物的熒光區(qū)別開來。發(fā)射的光的一部分例如用透鏡收集，被過濾以選擇特定的波長范圍并指向適當(dāng)?shù)囊粋€或多個光學(xué)檢測器740。來自每個光學(xué)檢測器740的輸出被發(fā)送到信號處理器750，信號處理器750被配置為使得例如可以讀出并存儲來自各個珠的總和/或最大熒光以用于隨后的分析。

在上述流式細(xì)胞儀測量裝置710的變型中，微珠770可以包括不同組的微珠，每組由涂覆有對該組特定的且不同于其它組的分析物具有結(jié)合親和力的分子的微珠組成。也可以選擇附著于分析物分子的熒光標(biāo)記，以便為每種類型的分析物提供不同的波長(該術(shù)語包括窄帶波長)的熒光信號。以這種方式，可以通過區(qū)分由檢測器740檢測到的熒光的波長來同時容易地檢多種分析物。眾所周知，這可以通過使用多個檢測器來實(shí)現(xiàn)，其中多個檢測器中的每一個被配置(用于例如通過在每個檢測器之前添加適當(dāng)?shù)倪^濾器)以檢測不同的熒光波長?？商娲?，將相同的熒光標(biāo)記附著到不同的分析物上。然后用在不同波長帶上發(fā)射的染料對微珠770進(jìn)行染色，并且將珠粒熒光的強(qiáng)度用作標(biāo)記以指示該珠粒結(jié)合的分析物的類型。任一種方法有利地允許從樣品基質(zhì)同時檢測多種分析物。

在給定的一組條件下達(dá)到平衡所需時間的一個可操作的定義可以說明如下(也參見圖8)：rm是在非常長的提取時間(例如，幾個小時)之后獲得的最大回收率，s是回收率r的重復(fù)測量的標(biāo)準(zhǔn)偏差。此外，提取的特征時間尺度t可以定義為回收率r達(dá)到rm的一半所需的時間。然后，達(dá)到平衡所需要的時間te可以被定義為在大于特征時間尺度的預(yù)定時間段t(比如3*t)內(nèi)測量的回收率r已經(jīng)改變小于一個標(biāo)準(zhǔn)偏差s的時間，說)。提取未達(dá)到平衡的時間的定義可能比自平衡的該預(yù)定時間段(比如3*t)的時間早幾倍。

應(yīng)該明白，“基本上”“基本上相似”和類似術(shù)語被用于包括關(guān)于未知樣品基質(zhì)所采用的任何程序，從關(guān)于參考樣品基質(zhì)在步驟110和120中采用的的程序到與不可測量地影響從相同的參考基質(zhì)提取到溶劑中的分析物的量的程度。

實(shí)驗(yàn)研究

用于證明不同提取時間和溶劑類型的效果的樣品由具有參考霉菌毒素水平don：1987ppb±123ppb和ota：18ppb±3ppb的小麥樣品基質(zhì)構(gòu)成。

用于在2分鐘內(nèi)用30％乙醇提取的證明中所使用的樣品由五個小麥樣品基質(zhì)組成，每個樣品基質(zhì)具有如下表所示的不同的霉菌毒素濃度：

霉菌毒素濃度

使用的提取溶劑是乙醇(30％v/v)，乙腈(60％v/v)和甲醇(80％v/v)的水溶液。溶劑的有機(jī)組分的選擇是基于科學(xué)研究中通常使用的。

選擇提取時間為1分鐘、2分鐘、4分鐘和30分鐘。使用30分鐘提取時間作為參考，并測量每種提取溶劑的最大回收率rm。為了獲得精確的提取，在精細(xì)過濾之前通過在法式壓機(jī)(frenchpress)中過濾進(jìn)行快速分離。法式壓機(jī)在建筑和操作上與眾所周知的法式咖啡沖壓機(jī)類似，包括一個裝有柱塞的窄圓柱形燒杯，其柱塞緊緊地但可滑動地安裝在氣缸中，并且在一端具有網(wǎng)狀過濾器。隨著柱塞移動通過由樣品基質(zhì)和含有溶劑的分析物組成的混合物，溶劑被迫通過過濾器并與樣品基質(zhì)分離。這種壓力增強(qiáng)的分離極大地提高了從提取到分離提取物的速度，通常不長于30秒。在替代的實(shí)施方案中，提取可以使用標(biāo)準(zhǔn)離心機(jī)進(jìn)行，以分離溶劑和樣品基質(zhì)，例如通過過濾或沉淀。

在實(shí)驗(yàn)研究中使用的根據(jù)本發(fā)明的方法中與hplc分析相結(jié)合的don和ota的提取和樣品清理程序的概述如圖2所示。

在vicamdontestwb的參考方法的don樣品制備中，免疫親和柱(iac)用作清除步驟。參考方法遵循vicam描述的樣品制備程序(dontesthplc&dontestwb，使用說明書(hplc用途)，rev.b，vicam)。使用的hplc設(shè)置為：1ml/min流量的乙腈/水10/90。以500μl/min的抽吸和注射速度注入50μl。柱：phenomenex的反相synergi4μm，hydro-rp250×4,6mm，具有預(yù)柱。柱部分加熱至30℃。在218nm±2nm下進(jìn)行uv-vis檢測，參考值為500nm±50nm。

提取和清理程序如下：

1.樣品5g細(xì)磨小麥(步驟210a))

2.用20ml的去離子水，同時在密封容器中攪拌混合物(步驟210b))

3.法式壓機(jī)快速過濾，液相樣品5ml(使用注射器)，(步驟210c))

4.通過whatmangf/a過濾器進(jìn)行過濾。濾液必須澄清的(od600<0,02)。(步驟210d))

5.讓iac溫和至環(huán)境溫度(5分鐘)

6.傳遞存儲緩沖液通過iac。(步驟220)

7.用1ml去離子水清洗iac。

8.將1ml過濾的提取物加入到iac中，讓其約1滴/秒通過。

9.用5ml去離子水沖洗iac(1滴/秒)。施加空氣壓力，直到空氣通過色譜柱并用紙吸干。

10.用2ml甲醇洗脫至少5分鐘(<1滴/秒)。施加空氣壓力，直到空氣通過色譜柱。

11.從樣品中蒸發(fā)甲醇并用500μl的hplc流動相重組。(步驟230)

12.轉(zhuǎn)移到hplc樣品瓶并進(jìn)行hplc分析。(步驟240)

為了對用有機(jī)溶劑提取的don進(jìn)行定量，在樣品制備中包括稀釋步驟(步驟215a)。這是因?yàn)関icamiac針對水提取物進(jìn)行了優(yōu)化。如果將具有高含量有機(jī)溶劑的提取物施加到柱上，則don不會在柱中結(jié)合，并且實(shí)現(xiàn)低回收率。當(dāng)用有機(jī)溶劑提取時，稀釋步驟包括：

·過濾的提取物用水稀釋10倍：500μl提取物+4500μl的去離子水(點(diǎn)4a)。

·將所有稀釋的提取液(5ml)施用于iac，使其以1滴/秒通過。(替換上面的第8點(diǎn))。

從樣品中蒸發(fā)甲醇并用300μl的hplc流動相重新構(gòu)成(代替上述11點(diǎn))。

使用的解決方案

對于ota的提取和清理，遵循的步驟是：

1.樣品5g，均質(zhì)研磨的小麥。(步驟210a))

2.在密封容器中攪拌混合物的同時在1分鐘內(nèi)提取20ml溶液a。(步驟210b))

3.通過法式壓機(jī)快速過濾，并取樣5ml的液相(使用注射器)。(步驟210c))

4.通過whatmangf/a過濾器進(jìn)行過濾。濾液必須是澄清的。(步驟210d))

5.提取樣品500μl，用溶液b稀釋至2.5ml。(步驟215b)

6.讓iac溫和至環(huán)境溫度(5分鐘)。

7.傳遞存儲緩沖液通過iac。(步驟220)

8.用1000μl溶液b洗滌iac。

9.將1ml稀釋的提取物加入到iac中，使其以1滴/秒通過。

10.用700μl溶液b洗滌iac(1滴/秒)。施加空氣壓力，直到空氣通過色譜柱并用紙吸干。

11.用500μl溶液c洗脫(<1滴/秒)。施加空氣壓力，直到空氣通過色譜柱。

12.轉(zhuǎn)移到hplc樣品瓶并進(jìn)行hplc分析。(步驟240)

使用的解決方案

使用一種天然污染的小麥樣品(1987ppbdon和18ppbota)的不同提取溶劑和時間的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

在圖3說明了在不同提取時間下，用60％乙腈(三角形數(shù)據(jù)集)，80％甲醇(圓形數(shù)據(jù)集)和30％乙醇(方形數(shù)據(jù)集)提取don的回收率曲線?；厥章适钱惓８叩模@源于樣品清理問題。從圖3可以推導(dǎo)出的是，對于所有三種溶劑來說，每分鐘最高的don的獲得在前4分鐘內(nèi)發(fā)生，并且溶劑的水含量似乎對回收率具有積極的影響。

當(dāng)繪制作為不同溶劑的提取時間的函數(shù)的ota的回收率時，這一點(diǎn)也是顯而易見的；在最初四分鐘內(nèi)提取最多量的霉菌毒素(圖4)。提取的參考溶劑為60％乙腈(三角形數(shù)據(jù)集)，并在短提取時間提供約50％的回收率，30％乙醇(方形數(shù)據(jù)集)提供約30％的回收率，或比60％乙腈低40％。80％甲醇(圓形數(shù)據(jù)集)提供在60％乙腈和30％甲醇之間的回收率。ota參考值的不確定度的下限用虛線表示，可以看出，30分鐘后乙腈提取接近該值。

通常在1-4分鐘內(nèi)用60％乙腈提取的ota得到45-55％的回收率。在同一時間間隔內(nèi)，30％乙醇的回收率為28-29％。80％的甲醇使回收率在33-39％之間。從don的時間和溶劑實(shí)驗(yàn)可以推導(dǎo)出，在最初4分鐘內(nèi)提取最大量的don，溶劑的含水量對回收率有積極的影響。

如上所述，應(yīng)當(dāng)理解，水中的30％乙醇可以是用于快速提取don和ota的可行溶劑，并且被選擇用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。實(shí)際上，使用在水中的20％至40％的乙醇濃度可以實(shí)現(xiàn)don和ota的快速、但不完全的提取。在圖5繪制了通過hplc發(fā)現(xiàn)的don濃度與5個樣品的參考濃度之間的相關(guān)性。由于提取錯誤(三角形)，一次重復(fù)被刪除；在提取后發(fā)現(xiàn)一團(tuán)面粉，導(dǎo)致該樣品的回收率較低。另外一個樣品是一個不明原因的異常值(圓圈)，被排除?？闯鲇忻黠@的線性相關(guān)性，平均回收率70％，cv回收率為5％。圖6中可以看到具有不同濃度的ota的五種不同參考樣品的相應(yīng)圖。在hplc發(fā)現(xiàn)的濃度和參考值之間也存在線性相關(guān)性。平均回收率為44％，cv回收率為27％。高cv值可能是由于三個不同的人完成提取

在don數(shù)據(jù)集和ota數(shù)據(jù)集上進(jìn)行線性回歸分析，這里例如以最小二乘法擬合的形式，并且所得到的直線擬合分別示出在圖5和圖6中。

從上述實(shí)驗(yàn)研究的考慮可以理解，已經(jīng)建立了用于脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(don)和赭曲霉毒素a(ota)的霉菌毒素的快速提取方法。在2分鐘內(nèi)用30％乙醇提取霉菌毒素是可能的，don的平均回收率為70％，ota的平均回收率為44％。對于通過hplc發(fā)現(xiàn)的濃度和參考濃度，可以獲得不同霉菌毒素的線性回歸，從中可以建立表達(dá)每個回歸的計算機(jī)可執(zhí)行校準(zhǔn)，用于根據(jù)使用與上述那些基本相似的技術(shù)提取的溶劑中存在的水平來確定未知樣品基質(zhì)(例如小麥)中的分析物的量。對于0-300ppb范圍內(nèi)的don，發(fā)現(xiàn)r平方值為0.99，ota在0-101.8ppb范圍內(nèi)，r平方為0.96。

應(yīng)當(dāng)理解，根據(jù)本發(fā)明的方法適用于從相同或其它類型的谷粒中提取其它霉菌毒素如伏馬毒素、zea、t2-毒素和黃曲霉毒素，并且可以更一般地應(yīng)用于傳統(tǒng)上依賴于完全恢復(fù)的其它基于提取的檢定。本發(fā)明的保護(hù)范圍僅由權(quán)利要求書的措辭限定，而不是由上面提供的示例性實(shí)施方案和實(shí)驗(yàn)研究來限定。

權(quán)利要求書(按照條約第19條的修改)

1.用于定量檢定樣品基質(zhì)中一種或多種分析物的方法，包括以下步驟：

a)在多個參考樣品基質(zhì)上進(jìn)行分析物提取，每個參考樣品基質(zhì)具有不同的分析物參考值水平，所述分析物提取包括在相同的提取周期內(nèi)將每個樣品基質(zhì)與溶劑混合，所述提取周期小于達(dá)到平衡所需的時間；并從樣品基質(zhì)中分離含有分析物的溶劑；

b)測量從每個參考樣品基質(zhì)獲得的分離的溶劑中存在的分析物的水平；

c)生成計算機(jī)可執(zhí)行校準(zhǔn)，由該計算機(jī)可執(zhí)行校準(zhǔn)建立從每個參考基質(zhì)提取的分析物的測量水平與每個參考基質(zhì)的分析物的參考水平之間的數(shù)學(xué)關(guān)系；

d)基本上重復(fù)步驟a和b，將具有未知水平分析物的相同類型的樣品基質(zhì)替換為參考樣品基質(zhì)，以獲得用于樣品基質(zhì)的分離溶劑中分析物水平的量度；以及

e)在計算機(jī)中將在步驟c生成的校準(zhǔn)應(yīng)用于在步驟d確定的分析物水平，從而得出樣品基質(zhì)中分析物水平的量度。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中分離含有分析物的溶劑包括在施加的力下分離。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述一種或多種分析物是霉菌毒素，并且樣品基質(zhì)是谷粒。

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其中所述霉菌毒素是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(don)和赭曲霉毒素a(ota)中的一種或兩種。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述溶劑是含有體積為20體積％至40％乙醇的乙醇水混合物。

6.如權(quán)利要求5所述的方法，其中所述溶劑含有體積為30％的乙醇。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中生成計算機(jī)可執(zhí)行校準(zhǔn)包括在計算機(jī)中執(zhí)行線性回歸分析以建立所述數(shù)學(xué)關(guān)系。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中測量分析物的水平包括將分離的溶劑與已知量的熒光標(biāo)記的分析物分子混合，以及與在其表面具有對分析物具有優(yōu)先結(jié)合親和力的分子的微珠混合；并在混合后使用流式細(xì)胞儀測量熒光作為分析物水平的量度。

9.如權(quán)利要求8所述的方法，其中在測量所述熒光之前，在小于建立反應(yīng)平衡所需時間的時間內(nèi)進(jìn)行混合。

10.一種用于檢定樣品基質(zhì)中一種或多種分析物的方法，包括以下步驟：在所述樣品基質(zhì)上進(jìn)行分析物提取，所述分析物提取包括在提取周期內(nèi)將所述樣品基質(zhì)與溶劑混合，所述提取周期小于達(dá)到平衡所需時間，并從樣品基質(zhì)中分離出含有分析物的溶劑；測量分離的溶劑中存在的分析物的水平；并在計算機(jī)中應(yīng)用校準(zhǔn)，通過該校準(zhǔn)建立借助于上文在樣品基質(zhì)的提取中使用的方法從多個參考樣品中的每一個提取的分析物的水平與每個參考樣品的分析物水平的參考值之間的數(shù)學(xué)關(guān)系，從而得出樣品基質(zhì)中分析物水平的量度。

11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中測量分析物的水平包括將分離的溶劑與已知量的熒光標(biāo)記的分析物分子混合，并且與在其表面被提供有對分析物具有優(yōu)先結(jié)合親和力的分子的微珠混合；并在混合后使用流式細(xì)胞儀測量熒光作為分析物水平的量度。

12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中混合分離的溶劑包括在測量熒光之前在比建立反應(yīng)平衡所需時間少的時間內(nèi)與微珠一起孵化。

13.一種用于生成用于根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法的校準(zhǔn)的方法，所述方法包括以下步驟：

a)在多個參考樣品基質(zhì)上進(jìn)行分析物提取，每個參考樣品基質(zhì)具有不同的參考值水平分析物，所述分析物提取包括在相同的提取周期內(nèi)將每個樣品基質(zhì)與溶劑組合，所述提取周期小于達(dá)到平衡所需的時間；并從樣品基質(zhì)中分離含有分析物的溶劑；

b)測量從每個參考樣品基質(zhì)獲得的分離的溶劑中存在的分析物的水平；

c)生成計算機(jī)可執(zhí)行校準(zhǔn)，通過該校準(zhǔn)建立從每個參考基質(zhì)提取的分析物的測量水平與每個參考基質(zhì)中相同的一個分析物的參考水平之間的數(shù)學(xué)關(guān)系。