本發(fā)明屬于生物
技術領域：
，涉及一種檢測CD79α的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其制備方法。
背景技術：
：CD79α屬免疫球蛋白超家族(IgSF)成員。在B細胞淋巴瘤、大部分的急性B淋巴細胞白血病和骨髓瘤中陽性表達，作為CD20的一個輔助檢測因子，廣泛用于B細胞及其來源腫瘤的識別。CD79α表達的陽性部位在胞膜和胞漿。CD79α是B細胞的廣譜標記物，從前B開始到成熟的漿細胞都可以標記。CD79α向B細胞末端分化調節(jié)過程中會與CD79β有部分免疫反應交叉。CD79α可用于B細胞淋巴瘤CD79α(+)、前B細胞急性淋巴細胞白血病(ALL)CD79α(+)和急性T細胞淋巴細胞白血病CD79α(-)的鑒別。臨床上用于檢測CD79α的方法主要是采用免疫組織化學，但這種方法實驗過程操作較復雜，所需時間長，靈敏度低，不能進行定量分析，所用試劑對實驗人員危害較大；所需儀器設備昂貴，技術水平要求較高，不利于臨床快速檢測。而且，采用免疫組織化學法需進行活檢，收集樣本費時費力?；顧z組織腫瘤切片要求熟練和細致的技術，做出非常好的切片很難，它要求厚薄均勻、切片完整；腫瘤細胞形態(tài)復雜，分化程度各異，對病理醫(yī)生的經驗和操作水平要求高。此外，CD79α蛋白在腫瘤細胞會分泌或破裂后滲透到循環(huán)系統(tǒng)中。因此，有必要開發(fā)新的定量檢測CD79α的試劑盒。技術實現(xiàn)要素：針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的是提供一種簡便、快捷、實用、靈敏、高效的檢測CD79α的酶聯(lián)免疫試劑盒。本發(fā)明所述的一種定量檢測CD79α的酶聯(lián)免疫試劑盒，所述試劑盒包括：包被聯(lián)合捕獲抗體的酶標板、封閉液、洗滌液、CD79α標準品溶液、底物顯色液、終止液、抗CD79α單抗檢測抗體、辣椒過氧化物酶標記的鏈親和素；其中，所述聯(lián)合捕獲抗體包括由CD79α蛋白免疫實驗動物所得的抗CD79α多克隆抗體與抗CD79α單克隆抗體。根據(jù)本發(fā)明所述的酶聯(lián)免疫試劑盒的進一步特征，所述聯(lián)合捕獲抗體的包被濃度為每種抗體10-100ng/100ul，檢測抗體的濃度為200ng/ml。根據(jù)本發(fā)明所述的酶聯(lián)免疫試劑盒的進一步特征，所述抗CD79α單抗是用序列為SEQIDNO:1的多肽制備。根據(jù)本發(fā)明所述的酶聯(lián)免疫試劑盒的進一步特征，所述抗CD79α單抗是根據(jù)以下方法制備的：將純化的序列為SEQIDNO:1的多肽與KLH偶聯(lián)后免疫SPF級Balb/c鼠，所得小鼠脾臟與骨髓瘤細胞SP2/0融合后篩選得到3株雜交瘤細胞株，雜交瘤細胞分泌所得抗體用ProteinG/A親和柱進一步純化，得到抗CD79α單抗。根據(jù)本發(fā)明所述的酶聯(lián)免疫試劑盒的進一步特征，所述的封閉液為pH7.2磷酸鹽緩沖液中加入0.01％吐溫20，5％的脫脂奶粉和多糖，其中多糖的濃度范圍在0.5至10mg/ml之間，多糖選自：蔗糖、甘露糖、乳糖、海藻糖的一種或兩種以上的組合。所述的CD79α蛋白用0.1mM的Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)誘導CD79α所述的聯(lián)合捕獲抗體的濃度為每種抗體10-100ng/100ul，檢測抗體的濃度為200ng/ml。所述的包被液為保證能夠長期保存，于0.05MpH9.6的碳酸鹽緩沖液中添加了0.01％的硫柳汞作為防腐劑。所述抗CD79α單抗是用序列為SEQIDNO:1的多肽制備。所述抗CD79α單抗是根據(jù)以下方法制備的：將純化的序列為SEQIDNO:1的多肽與KLH偶聯(lián)后免疫SPF級Balb/c鼠，所得小鼠脾臟與骨髓瘤細胞SP2/0融合后篩選得到3株雜交瘤細胞株，雜交瘤細胞分泌所得抗體用ProteinG/A親和柱進一步純化，得到抗CD79α單抗。所述的封閉液為pH7.2磷酸鹽緩沖液中加入0.01％吐溫20、5％的脫脂奶粉和起支持保護作用的多糖，其中多糖的濃度范圍在0.5至10mg/ml之間，多糖類型可為蔗糖，甘露糖、乳糖，海藻糖其中的一種或幾種組合。所述試劑盒抗原標準品的含量在1.5至100mg/ml之間。本發(fā)明所述的定量檢測CD79α的酶聯(lián)免疫試劑盒，其有益效果在于：(1)本發(fā)明克服膜蛋白不適于作為ELISA試劑的缺陷，采用特殊的純化方式獲得可溶性膜蛋白，再采用膜蛋白免疫動物獲得多克隆抗體作為本發(fā)明試劑盒的捕獲抗體，使試劑在反應體系中更加穩(wěn)定。(2)采用了聯(lián)合捕獲抗體，由融合蛋白免疫實驗動物所得的抗CD79α多克隆抗體與抗CD79α單克隆抗體組成，由此增加抗原抗體的結合位點，增加試劑盒的靈敏度，背景值低。因為CD79α的膜蛋白特性及不易包被在固相載體中，所以必須增加檢測的靈敏度，而加入.01％吐溫20是為了減少非特異吸附，剛好與彌補了聯(lián)合抗體可能產生的假陽性。(3)本發(fā)明所述的試劑盒克服了傳統(tǒng)的免疫組化方法的種種缺陷，其本試劑盒可測定到低至15mg/L的CD79α水平，能夠用于白血病等血液腫瘤疾病的檢測和危險性預測。(4)普通抗原抗體反應ELISA體系采用5％脫脂奶粉與1％牛血清白蛋白等傳統(tǒng)封閉液，對膜蛋白抗原抗體反應體系的封閉效果往往很難令人滿意，而本發(fā)明所述的試劑盒是通過使用加了多糖和吐溫-20的封閉液，對于包被蛋白具有一定的保護作用，減少了非特異性吸附，特別是對于CD79α這類膜蛋白的構象有一定的支持作用。附圖說明圖1是單獨抗CD79α抗體包被的ELISA試劑盒與聯(lián)合抗體包被的ELISA試劑盒的靈敏度對比。圖2是在相同條件下采用不同封閉液的對比實驗結果。具體實施方式為使本發(fā)明更加容易理解，下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例1：多克隆抗體的制備1.基因和蛋白序列的來源人CD79α基因序列可參見XM_002829281，來自NCBI。根據(jù)CD79α的基因序列，合成分別位于閱讀框上游和下游的引物。上游引物：caccatggctgggggtccaggagtcctcca下游引物：ttctcgagtcacggcttctccagctggac人CD79α基因全長為681bp，編碼226個氨基酸，其中N-端1至32位氨基酸為信號肽。蛋白序列來源：BAD97091，來自NCBI。用于制備單抗的多肽序列為CSRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEK(SEQIDNO.1)。2.表達質粒的構建和高表達工程菌株的獲得表達載體構建方法：通過PCR擴增得到目的人CD79α基因，用NdeI+XhoI雙切酶PCR產物及pET28a質粒將兩個片段用T4DNA連接酶進行連接，連接產物轉化進入大腸桿菌DH5α，在含有氨芐青霉素的LB平板上挑選克隆，小量制備質粒，通過雙酶切/PCR鑒定篩選出陽性克隆。大量擴增確證的pET28a/CD79α質粒，用NdeI+XhoI雙切酶鑒定；pET28a/CD79α質粒經測序驗證后，轉化進入大腸桿菌DE3，在含有氨芐青霉素的LB平板上挑選陽性克隆并進行質粒酶切鑒定，小量制備質粒，通過雙酶切/PCR鑒定篩選出陽性克隆，獲得含有CD79α的重組質粒工程菌。3.CD79α蛋白的表達純化用0.1mM的Isopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)誘導上述CD79α重組質粒工程菌DE3-pET28a，18℃過夜，低溫誘導避免大量外源蛋白的表達對宿主菌產生的毒害。收集細菌，采用超聲波破碎，經離心(12,000g，4℃)收集上清獲得粗蛋白。粗蛋白采用0-0.02M的還原劑，4-8M的變性劑重懸。所述的還原劑可為巰基乙醇、TCEP或DTT，變性劑可為尿素或鹽酸胍。粗提的融合蛋白跑SDS-PAGE電泳后，PAGE膠用4攝氏度預冷的0.1至0.5mol/L的KCL染色3min，切下目的條帶搗碎放入透析袋內，將透析袋放在水平電泳槽上，加入PBS緩沖液跑1小時，將正負極反轉再跑1小時后回收透析袋中的溶液，再放入凍干機中凍干。此法操作簡單，不用反復換透析液，比常規(guī)的透析復性法更節(jié)省時間和更有效率。4.CD79α多抗的制備以上述純化的CD79α蛋白免疫SPF級新西蘭兔：初次免疫時將弗氏完全佐劑與抗原150μl(50μg)等體積混合，充分乳化后，皮下多點注射。2周后，對新西蘭兔進行再次免疫，并改用弗氏不完全佐劑，注射體積和方法不變，此后每隔2周對新西蘭兔繼續(xù)免疫，共免疫3次。待新西蘭兔血清效價達到要求后準備進行心臟采血，采血前三天對新西蘭兔腹腔注射50μg抗原進行沖擊免疫。5.CD79α抗體的制備純化將上述抗CD79α抗血清采用GEHealthcare公司的HiTrapProteinG/A并將純化后的抗體進行分裝凍干。實施例2.CD79α單抗的制備采用常規(guī)方法制備單抗：用于制備單抗的多肽序列CSRGLQGTYQDVGSLNIGDVQLEK(SEQIDNO.1)與KLH偶聯(lián)后免疫SPF級Balb/c鼠，所得小鼠脾臟與骨髓瘤細胞SP2/0融合后篩選得到3株雜交瘤細胞株，雜交瘤細胞分泌所得抗體用ProteinG/A親和柱進一步純化，得到抗CD79α單抗。采用間接ELISA從3株雜交瘤細胞株中挑選出1株與多抗組合為聯(lián)合捕獲抗體。實施例3：檢測CD79α的酶聯(lián)免疫試劑盒組建檢測CD79α的酶聯(lián)免疫試劑盒，使其所含下述組分：1.包被抗CD79α多抗和抗CD79α單抗和作為捕獲抗體的酶標板；2.pH值為7.2，含5％脫脂奶粉，0.01％吐溫20,海藻糖，0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液為封閉液；3.pH值為7.2，含0.5％吐溫20，0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液的洗滌液；4.CD79α標準品溶液；5.底物顯色液由顯色液A和顯色液B組成，顯色液A液為過氧化氫，顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺；6.終止液為2M硫酸溶液；7.生物素化抗CD79α單抗(貨號130-10122)作為檢測抗體8.辣椒過氧化物酶標記的鏈親和素。實施例4：檢測CD79α的酶聯(lián)免疫試劑盒的應用方法采用實施例3所構建的酶聯(lián)免疫試劑盒采用雙抗體夾心法來檢測CD79α，具體檢測步驟是：(1)包被：將捕獲抗體固定在固相聚苯乙烯支撐物上，用包被液稀釋(pH9.6碳酸鹽溶液)，4攝氏度包被12小時。其中聯(lián)合捕獲抗體的濃度范圍為10-100ng每100ul；(2)封閉：采用pH值為7.2，含5％脫脂奶粉、0.01％吐溫20、多糖、0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液，其中多糖的濃度范圍在0.5至10mg/ml之間。(3)加入標準品與待測血清：將已知濃度的標準品按比例稀釋加入微孔板中，設立空白對照。再將待測血清樣本加入其它微孔板。(4)加入檢測抗體：加入生物標記的檢測抗體與鏈親和素各孵育半個小時，檢測抗體的濃度范圍為200ng/ml。該檢測抗體購自美國瑞博奧生物科技有限公司，貨號為130-10122。(5)加入底物與終止液。實施例5：檢測CD79α的酶聯(lián)免疫試劑盒的質量分析1.本發(fā)明試劑盒的靈敏度按照實施例3的步驟加入各組分，將采用單獨抗CD79α多克隆抗體，單獨抗CD79α單克隆抗體包被的試劑與采用聯(lián)合抗體包被的試劑盒進行對比實驗。將CD79α抗原標準品配制成1.5625，3.125，6.25，12.5，25，50，100ng/100ul7個濃度梯度，按照優(yōu)化后的ELISA條件測定，繪制標準曲線。如圖1所示，ELISA檢測方法的標準品線性范圍為1.5625～100mg/L，采用聯(lián)合抗體的結果比采用單獨抗體的OD值高(最低檢測值的1/2>對照值)，提示增加了靈敏度。結果如下表1：標準品濃度(mg/L)OD450值(聯(lián)合抗體)OD450值(單獨多抗)OD450值(單獨單抗)1002.032.6640.944501.6612.3570.794251.1061.7060.45512.50.5751.1750.1966.250.3340.8430.0793.1250.2110.7190.0671.56250.1950.5610.051NC0.0610.3710.0492.本發(fā)明試劑盒的特異性正確檢定不存在的被檢物質的能力(無假陽性)，取決于聯(lián)合捕獲抗體和檢測抗體的純度及特異性。(1)包被：將捕獲抗體固定在固相聚苯乙烯支撐物上，用包被液稀釋(pH9.6碳酸鹽溶液)，4攝氏度包被12小時。其中捕聯(lián)合獲抗體的濃度范圍為10-100ng每100ul；(2)封閉：采用pH值為7.2，含5％脫脂奶粉，0.01％吐溫20,多糖，0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液,其中多糖的濃度范圍在0.5至10mg/ml之間。(3)加入各個抗原蛋白：將已知濃度的抗原蛋白(CD79α,CD38,IGF1,CD23,CEBPB,角蛋白)稀釋加入微孔板中。(4)加入檢測抗體：加入生物標記的檢測抗體與鏈親和素孵育各半個小時，其中檢測抗體濃度范圍為200ng/ml。(5)加入底物與終止液。交叉反應結果如下表2：交叉反應物CD79αCD38IGF1CD23CEBPB角蛋白8OD檢測值1.8230.1650.1490.1570.2120.161實施例6：封閉液的確定按照實施例3的步驟加入各組分，在相同條件下采用不同封閉液的對比實驗。封閉液A，組分為：pH值為7.2，含5％脫脂奶粉，0.01％吐溫20,多糖，0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液,其中多糖的濃度范圍在0.5至10mg/ml之間。封閉液B，組分為：pH值為7.2，含5％脫脂奶粉，多糖，0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液,其中多糖的濃度范圍在0.5至10mg/ml之間。封閉液C，組分為：pH值為7.2，含5％脫脂奶粉，0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液,。封閉液D，組分為：pH值為7.2，含1％酪蛋白鈉鹽，0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液。將CD79α抗原標準品配制成1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100ng/100ul7個濃度梯度，按照優(yōu)化后的ELISA條件測定，繪制標準曲線。比對結果如下表3：標準品濃度(mg/L)A組分B組分C組分D組分1002.031.8230.2270.396501.6611.30.2550.374251.1061.0930.2430.26612.50.5750.8420.1770.2126.250.3340.8270.1050.1973.1250.2110.710.1140.1741.56250.1950.6870.1280.161NC0.0610.3050.1280.14如圖2所示，加入相同的標準品，檢測采用不同封閉液的ELISA結果顯示，A組封閉液背影值低，檢測靈敏度最高，而未采用多糖的C、D組份檢測靈敏度低。當前第1頁1 2 3