本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種抗體二硫鍵配對(duì)分析方法。

背景技術(shù)：

二硫鍵即S-S鍵，是2個(gè)巰基被氧化而形成的-S-S-形式的硫原子間的共價(jià)鍵，是一種常見(jiàn)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，交聯(lián)多肽鏈內(nèi)或鏈間的兩個(gè)半胱氨酸，在形成穩(wěn)定的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)、保持正確的空間構(gòu)象、調(diào)節(jié)生物學(xué)活性方面起著非常重要的作用。二硫鍵正確配對(duì)利于肽鏈迅速折疊并形成緊密的、穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，形成局部疏水中心，能阻止水分子進(jìn)入肽的內(nèi)部破壞氫鍵，形成穩(wěn)定的高級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域。

二硫鍵只具有相對(duì)的穩(wěn)定性，其共價(jià)鍵容易被還原而斷裂，當(dāng)二硫鍵被斷開(kāi)還原為巰基基團(tuán)時(shí)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及構(gòu)象必然發(fā)生改變，可能完全或部分喪失原有的生物學(xué)功能，巰基含量較高的抗體具有較低的生物活性和較低的熱穩(wěn)定性(Chader jian WB，Chin ET，Harris RJ，et al.Effect of copper sulfate on performance of a serum-free CHO cell culture process and the level of free thiol in the recombinant antibody expressed.Biotechnology Progress 2005；21(2):550-553；Lacy ER,Baker M,Brigham-Burke M.Free sulfhydryl measurement as an indicator of antibody stability.Analytical Biochemistry 2008；382:66-8)。正確的二硫鍵配對(duì)方對(duì)單克隆抗體藥物生物學(xué)活性至關(guān)重要，錯(cuò)配或不能完全形成二硫鍵往往意味活性的降低(Ouellette D,Alessandri L,Chin A,Grinnell C,Tarcsa E,Radziejewski C,et al.Studies in serum support rapid formation of disulfide bond between unpaired cysteine residues in the VH domain of an immunoglobulin G1molecule.Analytical Biochemistry 2010；397:37-47)。在細(xì)胞株克隆篩選、純化工藝確認(rèn)、制劑配方篩選、產(chǎn)品穩(wěn)定性確認(rèn)等研發(fā)周期過(guò)程中，監(jiān)控二硫鍵配對(duì)可以判斷單克隆抗體工藝開(kāi)發(fā)?，F(xiàn)有的技術(shù)方法多是采用幾種特異性酶進(jìn)行聯(lián)合酶解來(lái)確認(rèn)單克隆抗體的二硫鍵配對(duì)形式。

Golimumab(戈利木單抗，參見(jiàn)WO 02/12502)是由Centocor公司開(kāi)發(fā)的一 種全人抗TNF-a的IgG1κ單克隆抗體，目前已被美國(guó)、日本等多國(guó)批準(zhǔn)用于治療中至重度活動(dòng)型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、中度至重度潰瘍性結(jié)腸炎、銀屑病關(guān)節(jié)炎及強(qiáng)直性脊柱炎等多種疾病。目前Golimumab的二硫鍵配對(duì)分析，多是采用幾種特異性酶進(jìn)行聯(lián)合酶解方法來(lái)進(jìn)行分析確認(rèn)，非常不方便。

因此，一種簡(jiǎn)單、有效的蛋白質(zhì)(如Golimumab單克隆抗體)二硫鍵配對(duì)分析方法仍是目前所需的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種蛋白質(zhì)(如Golimumab單克隆抗體)二硫鍵配對(duì)分析方法，該方法克服了現(xiàn)有技術(shù)中需要使用多種特異性酶切方式進(jìn)行分析帶來(lái)的不便，其僅需使用一兩種酶切方式即能準(zhǔn)確確認(rèn)及定位二硫鍵肽段。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是采用以下技術(shù)方案：

一種蛋白質(zhì)二硫鍵配對(duì)分析方法，包括如下步驟：1、對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行變性處理；2、在非還原條件下使用特異性酶酶解蛋白質(zhì)；3、將酶解后的蛋白質(zhì)分成兩份樣品，對(duì)其中一份樣品進(jìn)行還原，對(duì)另一份樣品不進(jìn)行還原，兩份樣品均終止酶解；4、對(duì)終止酶解后的樣品進(jìn)行質(zhì)量肽譜圖分析。

較佳的，所述蛋白質(zhì)為單克隆抗體；進(jìn)一步的，所述單克隆抗體為戈利木單抗(Golimumab)。

較佳的，步驟1中使用鹽酸胍(GuHCl)對(duì)所述蛋白質(zhì)進(jìn)行變性處理；優(yōu)選變性樣品體系中鹽酸胍濃度為5M～7.6M。

較佳的，步驟2中所述特異性酶為胰蛋白酶和/或絲氨酸蛋白酶(Lys-C)；優(yōu)選胰蛋白酶的用量為1﹕25(wt/wt，酶/蛋白)；優(yōu)選Lys-C的用量為1﹕200(wt/wt，酶/蛋白)。

在一具體實(shí)例中，所述胰蛋白酶的用量為1﹕25(wt/wt，酶/蛋白)，Lys-C的用量為1﹕200(wt/wt，酶/蛋白)。

較佳的，步驟3中使用DTT對(duì)所述其中一份樣品進(jìn)行還原；優(yōu)選樣品體系中DTT濃度為60mM。

較佳的，步驟3中加入甲酸FA終止酶解；優(yōu)選FA終體積濃度為0.1％。

在另一具體實(shí)例中，對(duì)步驟3中所述其中一份樣品加入0.1M DTT，于37℃水浴孵育30min；兩份樣品均分別加入甲酸FA至終體積濃度0.1％，終止酶解反 應(yīng)。

較佳的，步驟5中，所述蛋白質(zhì)的二硫鍵配對(duì)確認(rèn)是通過(guò)ESI-Q-TOF MS方法進(jìn)行分析，所得數(shù)據(jù)采用BiopharmaLynx軟件進(jìn)行處理分析。

在另一具體實(shí)例中，ESI-Q-TOF MS分析采用以下方法實(shí)現(xiàn)：將蛋白質(zhì)用50mM NH₄HCO₃(pH8.0)溶液稀釋至1.5-2mg/mL(以酶解前蛋白濃度計(jì))；然后Waters Acquity UPLC BEH300C181.7μm 2.1×150mm色譜柱分離；進(jìn)行Q-TOF質(zhì)譜分析。

本發(fā)明單克隆抗體戈利木單抗輕鏈含有5個(gè)半胱氨酸Cys，分別為Cys23、Cys88、Cys135、Cys 195、Cys215，重鏈含11個(gè)半胱氨酸Cys，分別為Cys22、Cys96、Cys153、Cys 209、Cys229、Cys235、Cys238、Cys270、Cys330、Cys376、Cys434，從輕鏈N-末端開(kāi)始到C-末端分別標(biāo)示為1C～5C，從重鏈N-末端開(kāi)始到C-末端分別標(biāo)示為6C～16C，理論配對(duì)鏈內(nèi)二硫鍵為1C/2C、3C/4C、6C/7C、8C/9C、13C/14C、15C/16C，鏈間二硫鍵為5C/10C，鉸鏈區(qū)二硫鍵為11C+12C/11C+12C。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單一酶胰蛋白酶酶切時(shí)不能確認(rèn)5C/10C和11C+12C/11C+12C，單一酶Lys-C酶切時(shí)不能確認(rèn)1C/2C和6C/7C，而將兩種酶聯(lián)合起來(lái)可以確認(rèn)各自不能確認(rèn)的二硫鍵肽段，避免Lys-C酶切時(shí)造成的肽段較長(zhǎng)碎片離子不豐富的缺點(diǎn)，也避免了胰蛋白酶酶切時(shí)專一性不夠易產(chǎn)生部分漏切導(dǎo)致肽段豐度較低的缺點(diǎn)。另外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單克隆抗體戈利木單抗(Golimumab)鉸鏈區(qū)二硫鍵11C+12C/11C+12C由于氨基酸序列的特異性無(wú)法確認(rèn)具體配對(duì)方式。

總之，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果：本發(fā)明通過(guò)胰蛋白酶聯(lián)合Lys-C酶切方式即可確認(rèn)戈利木單抗(Golimumab)全部二硫鍵配對(duì)，酶切方式相對(duì)較少，并且二硫鍵肽段碎片離子較為豐富。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1單克隆抗體二硫鍵肽段(1C/2C)碎片離子圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1單克隆抗體二硫鍵肽段(3C/4C)碎片離子圖；

圖3為本發(fā)明實(shí)施例1單克隆抗體二硫鍵肽段(5C/10C)碎片離子圖；

圖4為本發(fā)明實(shí)施例1單克隆抗體二硫鍵肽段(6C/7C)碎片離子圖；

圖5為本發(fā)明實(shí)施例1單克隆抗體二硫鍵肽段(8C/9C)碎片離子圖；

圖6為本發(fā)明實(shí)施例1單克隆抗體二硫鍵肽段(11C+12C/11C+12C)碎片離 子圖；

圖7為本發(fā)明實(shí)施例1單克隆抗體二硫鍵肽段(13C/14C)碎片離子圖；

圖8為本發(fā)明實(shí)施例1單克隆抗體二硫鍵肽段(15C/16C)碎片離子圖；

圖9為本發(fā)明實(shí)施例1自由巰基肽段(1C)碎片離子圖；

圖10為本發(fā)明實(shí)施例1自由巰基肽段(2C)碎片離子圖；

圖11為本發(fā)明實(shí)施例1自由巰基肽段(3C)碎片離子圖；

圖12為本發(fā)明實(shí)施例1自由巰基肽段(4C)碎片離子圖；

圖13為本發(fā)明實(shí)施例1自由巰基肽段(5C)碎片離子圖；

圖14為本發(fā)明實(shí)施例1自由巰基肽段(6C)碎片離子圖；

圖15為本發(fā)明實(shí)施例1自由巰基肽段(7C)碎片離子圖；

圖16為本發(fā)明實(shí)施例1自由巰基肽段(8C)碎片離子圖；

圖17為本發(fā)明實(shí)施例1自由巰基肽段(9C)碎片離子圖；

圖18為本發(fā)明實(shí)施例1自由巰基肽段(11C+12C)碎片離子圖；

圖19為本發(fā)明實(shí)施例1自由巰基肽段(13C)碎片離子圖；

圖20為本發(fā)明實(shí)施例1自由巰基肽段(15C)碎片離子圖；

圖21為本發(fā)明實(shí)施例1自由巰基肽段(16C)碎片離子圖。

上述附圖中肽段中氨基酸之間的每一條虛線表示檢測(cè)到的該肽段的一個(gè)碎片離子(b離子或y離子)，y離子是從肽段羧基端開(kāi)始，b離子是從肽段氨基端開(kāi)始。一般碎片離子越多越豐富，即表明該肽段是理論肽段，碎片離子較少，則不一定是理論肽段，可能是具有相同分子量的其他肽段，碎片離子的多少與肽段的長(zhǎng)度及碎裂模式有關(guān)，太短或太長(zhǎng)的肽段在誘導(dǎo)碰撞電離碎裂模式下一般碎片離子都較少。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步闡述，不應(yīng)理解為是對(duì)本發(fā)明的限制。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，均是按照常規(guī)條件或制造廠商所建議的條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

以下實(shí)施例中使用的單克隆抗體是戈利木單抗(上?？贵w藥物國(guó)家工程研究中心有限公司提供)。

實(shí)施例1：抗體二硫鍵配對(duì)分析(胰蛋白酶聯(lián)合Lys-C酶切)

單克隆抗體二硫鍵配對(duì)分析步驟：

(1)蛋白變性處理

取蛋白樣品0.5mg加入到380μl變性緩沖液中(8M鹽酸胍+5mM EDTA+0.5M Tris，pH8.3)混勻，37℃孵育60分鐘。超濾離心或經(jīng)脫鹽柱脫鹽至50mM的NH₄HCO₃(pH8.0)緩沖液中。

(2)酶解

取(1)中蛋白100μg，以1:25(wt/wt)加入胰蛋白酶，以1﹕200加入Lys-C，聯(lián)合酶解單克隆抗體，37℃孵育4小時(shí)。

(3)還原和終止酶解

待(2)中樣品酶解完成后，取出一半體積樣品加入甲酸FA至終體積濃度0.1％；另一半體積樣品加入1μL0.1M DTT，于37℃水浴30min后，加入甲酸FA至終濃度0.1％，終止酶解反應(yīng)，同時(shí)酸化肽段。

(4)ESI-Q-TOF質(zhì)量肽譜圖分析

混勻后離心10min(轉(zhuǎn)速≥12000rpm)，ACQUITY UPLC BEH300C18色譜柱(1.7μm，2.1×150mm，Waters公司)分離后，ESI-Q-TOF質(zhì)譜分析，BiopharmaLynx軟件分析。

所述ESI-Q-TOF MS分析典型參數(shù)包括質(zhì)譜參數(shù)和液相條件優(yōu)選如下：

表1：ESI-Q-TOF MS分析質(zhì)譜參數(shù)和液相條件

流動(dòng)相A：0.1％FA-H2O，流動(dòng)相B：0.1％FA-ACN，質(zhì)譜清洗液：50％CAN，質(zhì)譜IntelliStart閥清洗液：50％MeOH，柱溫：45℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：214nm，進(jìn)樣體積：5μL或10μL，樣品室溫度：10℃，液相梯度洗脫條件：流動(dòng)相B在80分鐘內(nèi)從1％到36％。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)下表2-3，其中：表2是非還原條件單克隆抗體二硫鍵肽段分子量與理論分子量對(duì)比表，表3是單克隆抗體自由巰基肽段分子量與理論分子量對(duì)比表：

表2：非還原條件單克隆抗體二硫鍵肽段分子量與理論分子量對(duì)比表

表3：?jiǎn)慰寺】贵w自由巰基肽段分子量與理論分子量對(duì)比表

經(jīng)ESI-Q-TOF質(zhì)量肽譜圖分析，二硫鍵肽段(1C/2C)碎片離子圖見(jiàn)附圖1，二硫鍵肽段(3C/4C)碎片離子圖見(jiàn)附圖2，二硫鍵肽段(5C/8C)碎片離子圖見(jiàn)附圖3，二硫鍵肽段(6C/7C)碎片離子圖見(jiàn)附圖4，二硫鍵肽段(9C/10C)碎片離子圖見(jiàn)附圖5，二硫鍵肽段(11C+12C/11C+12C)碎片離子圖見(jiàn)附圖6，二硫鍵肽段(13C/14C)碎片離子圖見(jiàn)附圖7，二硫鍵肽段(15C/16C)碎片離子圖見(jiàn)附圖8，自由巰基肽段(1C)碎片離子圖見(jiàn)附圖9，自由巰基肽段(2C)碎片離子圖見(jiàn)附圖10，自由巰基肽段(3C)碎片離子圖見(jiàn)附圖11，自由巰基肽段(4C)碎片離子圖見(jiàn)附圖12，自由巰基肽段(5C)碎片離子圖見(jiàn)附圖13，自由巰基肽段(6C)碎片離子圖見(jiàn)附圖14，自由巰基肽段(7C)碎片離子圖見(jiàn)附圖15，自由巰基肽段(8C)碎片離子圖見(jiàn)附圖16，自由巰基肽段(9C)碎片離子圖見(jiàn)附圖17，自由巰基肽段(11C+12C)碎片離子圖見(jiàn)附圖18，自由巰基肽段(13C)碎片離子圖見(jiàn)附圖19，自由巰基肽段(15C)碎片離子圖見(jiàn)附圖20，自由巰基肽段(16C)碎片離子圖見(jiàn)附圖21。

實(shí)施例2：?jiǎn)慰寺】贵w二硫鍵配對(duì)分析(胰蛋白酶酶切)

單克隆抗體二硫鍵配對(duì)分析步驟：

(1)蛋白變性處理

取蛋白樣品0.5mg加入到380μl變性緩沖液中(8M鹽酸胍+5mM EDTA+0.5M Tris，pH8.3)混勻，37℃孵育60分鐘。超濾離心或經(jīng)脫鹽柱脫鹽至50mM的NH₄HCO₃(pH8.0)緩沖液中。

(2)酶解

取(2)中蛋白100μg，以1:25(wt/wt)加入胰蛋白酶酶解單克隆抗體，37℃ 孵育4小時(shí)。

(3)還原和終止酶解

待(2)中樣品酶解完成后，取出一半體積樣品加入甲酸FA至終體積濃度0.1％；另一半體積樣品加入1μL0.1M DTT，于37℃水浴30min后，加入甲酸FA至終體積濃度0.1％，終止酶解反應(yīng)，同時(shí)酸化肽段。

(4)ESI-Q-TOF質(zhì)量肽譜圖分析

混勻后離心10min(轉(zhuǎn)速≥12000rpm)，ACQUITY UPLC BEH300C18色譜柱(1.7μm，2.1×150mm，Waters公司)分離后，ESI-Q-TOF質(zhì)譜分析，BiopharmaLynx軟件分析。

所述ESI-Q-TOF MS分析典型參數(shù)包括質(zhì)譜參數(shù)和液相條件優(yōu)選與實(shí)施例1中相同。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：能確認(rèn)除5C/10C和11C+12C/11C+12C以外的二硫鍵配對(duì)。

實(shí)施例3：?jiǎn)慰寺】贵w二硫鍵配對(duì)分析(Lys-C酶切)

單克隆抗體二硫鍵配對(duì)分析步驟：

(1)蛋白變性處理

取蛋白樣品0.5mg加入到380μl變性緩沖液中(8M鹽酸胍+5mM EDTA+0.5M Tris，pH8.3)混勻，37℃孵育60分鐘。超濾離心或經(jīng)脫鹽柱脫鹽至50mM的NH₄HCO₃(pH8.0)緩沖液中。

(2)酶解

取(1)中蛋白100μg，以1:200(wt/wt)加入Lys-C酶解單克隆抗體，37℃孵育4小時(shí)。

(3)還原和終止酶解

待(2)中樣品酶解完成后，取出一半體積樣品加入甲酸FA至終體積濃度0.1％；另一半體積樣品加入1μL0.1M DTT，于37℃水浴30min后，加入甲酸FA至終體積濃度0.1％，終止酶解反應(yīng)，同時(shí)酸化肽段。

(4)ESI-Q-TOF質(zhì)量肽譜圖分析

混勻后離心10min(轉(zhuǎn)速≥12000rpm)，ACQUITY UPLC BEH300C18色譜柱(1.7μm，2.1×150mm，Waters公司)分離后，ESI-Q-TOF質(zhì)譜分析，BiopharmaLynx軟件分析。

所述ESI-Q-TOF MS分析典型參數(shù)包括質(zhì)譜參數(shù)和液相條件優(yōu)選與實(shí)施例1中相同。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：能確認(rèn)除1C/2C和6C/7C以外的二硫鍵肽段。

綜上，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明通過(guò)胰蛋白酶聯(lián)合Lys-C酶切方式在非還原條件下，能直接確認(rèn)戈利木單抗(Golimumab)所有二硫鍵配對(duì)方式，可以排除單克隆抗體特殊氨基酸序列對(duì)酶解蛋白時(shí)的空間位阻作用，全部二硫鍵配對(duì)只通過(guò)較少的酶切方式即能確認(rèn)，方法簡(jiǎn)單方便、有效可靠。