三維生物標志物檢測裝置、制備方法及檢測生物標志物的方法與流程
本發(fā)明涉及生物檢測領域，具體地，涉及一種三維生物標志物檢測裝置、該三維生物標志物檢測裝置的制備方法及利用該三維生物標志物檢測裝置檢測生物標志物的方法。
背景技術：
傳統(tǒng)的生物標記物檢測法——96孔板的酶聯(lián)免疫吸附實驗，因其繁瑣的實驗步驟和大體積的樣品量(50-100微升/孔)而難以實現方便、低成本、高通量、高信息量的檢測。目前提高信息量的酶聯(lián)免疫吸附實驗是將多個捕獲抗體分別定點固定在同一個96孔里，同一個樣品加入一個孔里便能同時檢測多種生物標志物，而結合上的酶標二抗催化底物原位產生發(fā)光產物，再通過捕捉圖片分析其亮度而同時定量一個樣品里多個標志物的含量。此方法并沒有脫離原96孔板的酶聯(lián)免疫吸附實驗的操作手法和樣品體積用量，因此也難以實現方便的高通量檢測。而384孔及更高通量的酶聯(lián)免疫吸附實驗要求反應總體積小、加樣體積準確，因而需要依靠昂貴的自動化設備，使大多數普通實驗室望而卻步，只能依賴人工操作進行96孔板的酶聯(lián)免疫吸附實驗。
如上所述，生物標記物檢測的微小化是高通量檢測的一個要求。最簡單的微小化便是將96孔板的二維平面酶聯(lián)免疫吸附實驗的操作方法直接挪用至384孔板或更多孔的孔板。許多文獻中也利用微流道達到納升甚至皮升量級的反應體系，但是需要借助微流泵等復雜儀器，且無法實現高通量檢測。另一種微小化便是將二維平面的微小酶聯(lián)免疫吸附實驗提升至三維反應空間。三維酶聯(lián)免疫吸附實驗相對二維的優(yōu)點在于其能提供更多的位點固定捕獲抗體以提高捕獲效率，進而增強信號及靈敏度。常用的三維基底是聚乙二醇水凝膠，其含水量高，使捕獲抗體能更好的保持活性。然而，由于物質擴散在水凝膠中比較慢，顧慮到檢測時間，這些微小水凝膠的直徑一般僅為幾百微米，而高度僅不到10微米，使人工加樣十分困難，需依賴自動化設備。而且，水凝膠需保持半濕的狀態(tài)以防干癟而影響抗體的活性。另外，由于水凝膠含水量高，樣品滴加在水凝膠上會被稀釋，不僅降低檢測的靈敏度，亦可能造成檢測結果的不可靠性。
因此，一種可供人工簡便操作、便于儲存、低成本、高通量或高信息含量的三維生物標志物檢測裝置有待開發(fā)。
技術實現要素：
本發(fā)明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種人工簡便操作、便于儲存、低成本或高通量的三維生物標志物檢測裝置。
根據本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提出了一種三維生物標志物檢測裝置，根據本發(fā)明的實施例，該三維生物標志物檢測裝置包括：三維多孔支架芯片，和載樣板；其中，所述三維多孔支架芯片包括：基板，以及多個三維多孔支架，所述多個三維多孔支架形成在所述基板的上表面；所述載樣板包括：基底，多個親水區(qū)域，所述多個親水區(qū)域形成在所述基底的上表面，以及多個疏水區(qū)域，所述多個疏水區(qū)域形成在所述基底的上表面；所述多個親水區(qū)域與所述多個疏水區(qū)域間隔設置，并且所述多個親水區(qū)域與所述多個三維多孔支架相對應。
根據本發(fā)明的實施例，利用該三維生物標志物檢測裝置能夠有效地檢測生物標志物。根據本發(fā)明的實施例，本發(fā)明提供的三維生物標志物檢測裝置不僅方便儲存，還可以實現微小化的生物標志物檢測。此外，具有的親疏水區(qū)域的載樣板可以實現人工的高通量加樣，由此，操作人員可將5微升以上的液體直接滴加至與多個三維多孔支架對應的親水區(qū)域，不僅減少了操作人員滴加樣品的次數，更無需滴加1微升以下的樣品，可以有效減少操作壓力和操作導致的誤差。
根據本發(fā)明的實施例，所述三維多孔支架是經過干燥處理的；任選地，所述三維多孔支架是經過冷凍干燥處理的；任選地，所述三維多孔支架攜帶有親和分子，所述親和分子特異性結合所述生物標志物。發(fā)明人發(fā)現，將三維多孔支架陣列芯片進行冷凍干燥后，形成干的三維多孔支架，孔徑變大，不僅利于吸收液體便于檢測，還方便儲存。并且結合在支架上的親和分子如捕獲抗體/抗原亦可以通過冷凍干燥保持其活性，便于長期儲存。
根據本發(fā)明的實施例，所述三維多孔支架被設置為陣列式排布。根據本發(fā)明的實施例，所述三維多孔支架呈圓柱狀。根據本發(fā)明的實施例，所述三維多孔支架的底部直徑為1-2mm，高300-350微米。由此，三維多孔支架吸水性更強，便于人工加樣，實現高通量、微小化的生物標志物檢測
根據本發(fā)明的實施例，所述基底的至少上表面是由親水材料形成的。根據本發(fā)明的實施例所述多個親水區(qū)域的至少一部分設置為陣列排布；或者，所述多個親水區(qū)域的至少一部分被設置為條狀。由此利于一種生物標志物的檢測，并且人工加樣方便快捷。
在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種制備上述三維生物標志物檢測裝置的方法，包括以下步驟：提供基板，并在所述基板的上表面形成多個三維多孔支架，以便獲得三維多孔支架芯片；以及提供基底，并在所述基底的上表面形成多個親水區(qū)域和多個疏水區(qū)域，以便獲得載樣板；其中，所述多個親水區(qū)域與所述多個疏水區(qū)域間隔設置，并且所述多個親水區(qū)域與所述多個三維多孔支架相對應。
通過本發(fā)明的方法制備的三維生物標志物檢測裝置不僅方便儲存，還可以實現微小化的生物標志物檢測；此外，具有的親疏水區(qū)域的載樣板可以實現人工的高通量加樣，操作簡便的同時可以有效減少誤差。
根據本發(fā)明的實施例，所述三維多孔支架是在-12攝氏度至-20攝氏度下形成，或者在常溫下形成所述三維多孔支架后，將所述三維多孔支架進行冷凍干燥。
根據本發(fā)明的實施例，在形成所述三維多孔支架時加入甘油。由此可以提高支架在冷凍干燥后的透光性，從而降低三維多孔支架的光學干擾，提高信號傳輸的質量。
根據本發(fā)明的實施例，在形成所述三維多孔支架后，在所述三維多孔支架上添加親和分子，并對所述三維多孔支架進行封閉處理。由此利于捕獲待檢測的生物標志物樣品，并對并對三維多孔支架進行封閉處理以對親和分子進行保護。
根據本發(fā)明的實施例，所述基底的至少上表面是由親水材料形成的，并且所述多個疏水區(qū)域的至少一部分是通過在所述基底的上表面施加疏水材料而形成，或者所述多個疏水區(qū)域的至少一部分是通過在所述基底的上表面形成納米級的粗糙表面而形成。由此，利于含水樣品在親水區(qū)聚集，加樣簡便快捷。
根據本發(fā)明的實施例，所述疏水材料包括選自su-8(環(huán)氧基紫外負型光刻膠)、如chf3、十八烷基三氯硅烷(ots)、聚二甲硅氧烷(pdms)、正硫基十八醇、氟代烷基硅氧烷聚合物、聚四氟乙烯、三氧化鋁/二氧化硅混合涂層和氧化鈦的至少一種。
在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種利用上述三維生物標志物檢測裝置檢測生物標志物的方法，包括：將含有生物標志物的含水樣品加載至所述載樣板；使所述載樣板的親水區(qū)域與所述三維多孔支架芯片的所述三維多孔支架接觸；以及對所述三維多孔支架芯片進行檢測；其中，所述三維多孔支架預先攜帶特異性識別所述生物標志物的親和分子。
根據本發(fā)明的實施例，每個所述三維多孔支架吸收1～2微升的所述含水樣品。由此，加樣量增加，減少了操作人員滴加樣品的次數，更無需操作人員滴加1微升以下的樣品，從而減少操作的壓力和操作導致的誤差。
根據本發(fā)明的實施例，通過涂布或者點樣的方式，將含有生物標志物的含水樣品加載至所述載樣板。通過這樣的加樣方式，無需自動加樣儀也可以進行加樣，尤其在采用人工加樣時，還可以減少操作人員滴加樣品的次數，方便快捷。
利用本申請的三維生物標志物檢測裝置可以實現微小化的生物標志物檢測，而且經過冷凍干燥后的三維多孔支架孔徑變大，能夠吸收更多液體，由此，根據載樣板對應的三維多孔支架的數量以及每個三維多孔支架的能夠吸收液體的量，操作人員每次可將5微升以上的液體直接滴加至載樣板上與多個三維多孔支架對應的親水區(qū)域，不僅減少了操作人員滴加樣品的次數，更無需滴加1微升以下的樣品，有效提高了檢測的準確度。
本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變得明顯，或通過本發(fā)明的實踐了解到。
附圖說明
本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點從結合下面附圖對實施例的描述中將變得明顯和容易理解，其中：
圖1顯示了根據本發(fā)明一個實施例的三維生物標志物檢測裝置的三維多孔支架芯片的結構示意圖；
圖2顯示了根據本發(fā)明一個實施例的三維生物標志物檢測裝置的載樣板的結構示意圖；
圖3顯示了根據本發(fā)明一個實施例的利用本發(fā)明的三維生物標志物檢測裝置檢測生物標志物時，三維多孔支架芯片與載樣板結合狀態(tài)的結構示意圖；
圖4顯示了根據本發(fā)明一個實施例的利用本發(fā)明的三維生物標志物檢測裝置檢測生物標志物時，三維多孔支架芯片與載樣板結合狀態(tài)的部分結構示意圖；
圖5顯示了根據本發(fā)明一個實施例的三維生物標志物檢測裝置檢測人白蛋白濃度的曲線圖，其中圖5a為人白蛋白標準曲線圖，圖5b為未知濃度的人白蛋白樣品的檢測準確性的直線圖；
圖6根據本發(fā)明一個實施例的三維生物標志物檢測裝置檢測乙酰氨基酚對heparg人肝癌細胞分泌人白蛋白量的影響的檢測曲線圖。
具體實施方式
下面詳細描述本發(fā)明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對本發(fā)明的限制。
在本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了一種三維生物標志物檢測裝置，下面參考附圖對該三維生物標志物檢測裝置進行詳細描述。參考圖1，根據本發(fā)明的實施例，三維生物標志物檢測裝置包括三維多孔支架芯片100和載樣板200；其中，三維多孔支架芯片100包括基板110以及多個三維多孔支架120；載樣板200包括基底210、多個親水區(qū)域220以及多個疏水區(qū)域230；多個親水區(qū)域220與多個疏水區(qū)域230間隔設置，并且多個親水區(qū)域220與多個三維多孔支架120相對應，以方便三維多孔支架芯片100和載樣板200的對接。
根據本發(fā)明的實施例，發(fā)明人發(fā)現本發(fā)明的三維生物標志物檢測裝置不僅方便儲存，還可以實現微小化的生物標志物檢測。此外，具有親疏水區(qū)域的載樣板可以實現人工的高通量加樣，由此，操作人員可將5微升以上的液體直接滴加至與多個三維多孔支架對應的親水區(qū)域，不僅減少了操作人員滴加樣品的次數，更無需滴加1微升以下的樣品，可以有效減少操作壓力和操作導致的誤差。
根據本發(fā)明的實施例，三維多孔支架120是經過干燥處理的，任選地，是可以經過冷凍干燥處理的。發(fā)明人發(fā)現，三維多孔支架120通過冷凍干燥后程海綿狀，孔徑變大，其吸水性能好，可以解決物質在水凝膠中擴散的問題，從而使三維多孔支架可以做到幾百微米高度的尺寸，方便人工加樣。而且三維多孔支架120經冷凍干燥處理后，樣品滴加到支架上不會被稀釋，從而提高了檢測結果的可信度。此外，三維多孔支架120經冷凍干燥處理后，其機械性能提高，彈性變高，不易碎。
根據本發(fā)明的實施例，三維多孔支架120可以攜帶有親和分子，親和分子特異性結合生物標志物。根據本發(fā)明的實施例，親和分子的種類并不受特別限制，可以是抗體/抗原(比如igg、igm等)，也可以是蛋白(比如酶)、糖蛋白(比如親和素，生物素)、核酸序列(比如dna序列、rna序列、適配體)、短肽者多肽等。
根據本發(fā)明的實施例，三維多孔支架120的排布不受特別限制，可以根據儀器需求、檢測需求等制作成各種排布形式。根據本發(fā)明的一些實施例，三維多孔支架120的排布被設置為陣列式排布，例如可以是如6×16陣列(即橫排16排，縱排6列)。
根據本發(fā)明的實施例，三維多孔支架120的形狀不受特別限制。根據本發(fā)明的一些實施例，三維多孔支架120可以呈圓柱狀。根據本發(fā)明的另一些實施例，三維多孔支架120的底部直徑可以為1-2mm，高度可以為300-350微米。由此，三維多孔支架吸水性更強，便于人工加樣，實現高通量、微小化的生物標志物檢測。
根據本發(fā)明的實施例，三維多孔支架中含有甘油。發(fā)明人發(fā)現，在制作三維多孔支架時，加入甘油可以提高支架在冷凍干燥后的透光性，從而降低三維多孔支架的光學干擾，提高信號傳輸的質量。
根據本發(fā)明的一些實施例，基底210的至少上表面是由親水材料形成的，這里的親水材料的種類不受特別限制，帶有極性基團的分子、對水有大的親和能力的材料即可，例如聚環(huán)氧乙烷(peo)、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚甲基丙烯酸羥乙酯(phema)等。根據本發(fā)明的另一些實施例，基底210也可以是全部采用親水材料形成的，例如可以采用玻璃(如硅化玻璃)、紙、石英、纖維膜、塑料、聚合物等形成基底210。
根據本發(fā)明的實施例，多個親水區(qū)域220的排布不受特別限制，可以根據儀器需求、檢測需求等設置。根據本發(fā)明的一些實施例，多個親水區(qū)域220的排布的至少一部分可以設置為陣列排布，或者多個親水區(qū)域220的至少一部分可以被設置為條狀。發(fā)明人發(fā)現，當多個親水區(qū)域220的排布的至少一部分可以設置為陣列排布時，利于一種生物標志物的檢測，并且人工加樣方便快捷；當多個親水區(qū)域220的至少一部分可以被設置為條狀時，利于多種生物標志物的檢測，同樣也可以實現人工加樣的方便快捷。
在本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提出了一種制備上述三維生物標志物檢測裝置的方法，包括以下步驟：
s100：制備三維多孔支架芯片
根據本發(fā)明的實施例，三維多孔支架可以通過在基板上形成多個三維多孔支架而完成。
根據本發(fā)明的實施例，形成基板的原料并不受特別限制，可以是玻璃、紙、石英、纖維膜、塑料、聚合物等。根據本發(fā)明的實施例，可以形成三維多孔支架的原料并不受特別限制，可以是聚乙二醇、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚(n-異丙基丙烯酰胺)、膠原蛋白、基質膠、明膠等聚合物材料。
根據本發(fā)明的實施例，三維多孔支架可以是制備好三維多孔支架后再結合到基板，或者在制備三維多孔支架的同時結合到基板。三維多孔支架與基板可通過化學或物理結合。根據本發(fā)明的實施例，如使用自帶或修飾后帶有雙鍵、氨基等功能基團的硅化玻璃作為基板，便可以通過化學反應(例如紫外光交聯(lián))與聚乙二醇二丙烯酸酯、聚(n-異丙基丙烯酰胺)等原料形成的三維多孔支架進行結合。但如果使用不帶或者未修飾功能基團的基板，也可以通過環(huán)氧樹脂與三維多孔支架進行物理固化結合。
本發(fā)明中，術語“修飾”應作廣義理解，可以指任何使得基板具有與多孔支架相結合的功能基團和/或化學鍵的方式或手段，例如可以是通過化學修飾的方式使得基板具有與多孔支架相結合的功能基團和/或化學鍵。
根據本發(fā)明的實施例，三維多孔支架是在-12攝氏度至-20攝氏度下形成，再進行干燥處理；或者在常溫下形成三維多孔支架后，將三維多孔支架進行冷凍干燥。根據本發(fā)明的一些實施例，三維多孔支架可以通過對形成三維多孔支架的原料進行化學或光學催化，形成水凝膠后進行冷凍干燥；也可以在低溫情況下，例如在-12攝氏度至-20攝氏度條件下，優(yōu)選在-20攝氏度下通過化學或光學催化形成冰膠后再干燥。根據本發(fā)明的另一些實施例，三維多孔支架的多孔性質可以通過添加鹽粒、甘油、冰晶等與膠體原液不相容的化學試劑或固體顆粒制作而成。
根據本發(fā)明的實施例，在形成三維多孔支架后，在三維多孔支架上添加親和分子，并對三維多孔支架進行封閉處理。由此利于捕獲待檢測的生物標志物樣品，并對三維多孔支架進行封閉處理以對親和分子進行保護。
本發(fā)明中，術語“添加”應作廣義理解，可以指任何使得三維多孔支架包含親和分子的手段，例如，可以是通過將親和分子通過化學鍵固定或結合于三維多孔支架上。
根據本發(fā)明的一些實施例，親和分子可在制備水凝膠前加入，從而在形成水凝膠時便以固定親和分子。根據本發(fā)明的另一些實施例，親和分子也可以在水凝膠形成后加入。根據本發(fā)明的另一些實施例，親和分子也可以在三維多孔支架進行冷凍干燥后再固定。根據本發(fā)明的實施例，每個三維多孔支架可以固定一個或多個親和分子，每個三維多孔支架芯片也可以包含一種或多種固定了親和分子的三維多孔支架。
根據本發(fā)明的實施例，親和分子的種類并不受特別限制，可以是抗體/抗原(比如igg、igm等)，也可以是蛋白(比如酶)、糖蛋白(比如親和素，生物素)、核酸序列(比如dna序列、rna序列、適配體)、短肽者多肽等。
根據本發(fā)明的實施例，抗非特異性吸附的物質的種類并不受特別限制，可以是牛血清白蛋白、乙醇胺、脫脂牛奶、巰基乙醇(mch)、三乙二醇單-11-巰基十一烷基醚、聚乙烯基吡咯烷酮(pvp)、11-巰基十一烷基-四(乙二醇)(oeg4)、1-巰基十一烷基-六(乙二醇)(oeg6)等寡聚乙二醇、以及聚乙二醇(peg)及其衍生物等。
根據本發(fā)明的實施例，三維多孔支架在制備時可修飾各種基團(比如雙鍵、羥基、醛基、翔基等)，以提供親和分子固定所需的基團。
根據本發(fā)明的實施例，將修飾了親和分子并封閉后的三維多孔支架陣列芯片低溫冷凍并干燥。低溫冷凍后干燥的條件可根據親和分子的特性而加入必要的保護劑(比如蔗糖、海藻糖)和適合的緩沖液(比如ph7的tris緩沖液)。
根據本發(fā)明的實施例，冷凍干燥后的三維多孔支架芯片可置于低溫或常溫干燥的環(huán)境中保存。
s200：制備載樣板
根據本發(fā)明的實施例，載樣板可以通過在基底上形成多個親水區(qū)域和多個疏水區(qū)域而完成。
根據本發(fā)明的實施例，多個親水區(qū)域與多個疏水區(qū)域間隔設置，并且多個親水區(qū)域與多個三維多孔支架相對應，由此便于三維多孔支架芯片和載樣的對接。
根據本發(fā)明的一些實施例，基底的至少上表面是由親水材料形成的，這里的親水材料的種類不受特別限制，帶有極性基團的分子、對水有大的親和能力的材料即可，例如聚環(huán)氧乙烷(peo)、聚甲基丙烯酸羥乙酯、聚甲基丙烯酸羥乙酯(phema)等。根據本發(fā)明的另一些實施例，基底210也可以是全部采用親水材料形成的，例如可以采用玻璃(如硅化玻璃)、紙、石英、纖維膜、塑料、聚合物等形成基底210。
根據本發(fā)明的一些實施例，提供基底后，可以預先對基底進行親水處理，例如使用氧等離子體清潔儀對基底進行清洗。
根據本發(fā)明的一些實施例，多個疏水區(qū)域的至少一部分是通過在基底的上表面施加疏水材料而形成。根據本發(fā)明的另一些實施例，多個疏水區(qū)域的至少一部分是通過在基底的上表面形成納米級的粗糙表面而形成。由此，利于含水樣品在親水區(qū)聚集，加樣簡便快捷。
根據本發(fā)明的實施例，疏水材料包括選自su-8(環(huán)氧基紫外負型光刻膠)、如chf3、十八烷基三氯硅烷(ots)、聚二甲硅氧烷(pdms)、正硫基十八醇、氟代烷基硅氧烷聚合物、聚四氟乙烯、三氧化鋁/二氧化硅混合涂層和氧化鈦的至少一種。根據本發(fā)明的一些實施例，形成多個親水區(qū)域和多個疏水區(qū)域的方法可以采用影印石版術(photolithography)、微接觸打印技術(microcontactprinting)、微流體圖案技術(microfluidicpatterning)、層流圖案技術(laminarflowpatterning)、模版圖案技術(stencilpatterning)、壓印光刻技術(imprintlithography)、流體光刻技術(flowlithography)、等離子體處理(plasma)、(contactelectrochemicalreplication)等。
通過本發(fā)明的方法制備的三維生物標志物檢測裝置不僅方便儲存，還可以實現微小化的生物標志物檢測；此外，具有的親疏水區(qū)域的載樣板可以實現人工的高通量加樣，操作簡便的同時可以有效減少誤差。
在本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提出了一種利用上述三維生物標志物檢測裝置檢測生物標志物的方法。參考圖3，根據本發(fā)明的實施例，該檢測方法包括：
s100：將含有生物標志物的含水樣品加載至載樣板。
本發(fā)明中，術語“生物標志物”應作廣義理解，可以指夠反映致病因素或毒物從暴露到效應過程中，各個環(huán)節(jié)性質的任何的特異性生物分子,如dna、蛋白質、酶、脂質、糖類等；也指在各種效應過程中反映某種外來物質引發(fā)的生物化學反應以及各種數據指標。
根據本發(fā)明的實施例，生物標志物可指處于緩沖液、細胞培養(yǎng)液中或血液、唾液、尿液等體液中。
根據本發(fā)明的實施例，通過涂布或者點樣的方式，將含有生物標志物的含水樣品加載至載樣板。根據本發(fā)明的一些實施例，生物標志物可手動或通過自動加樣儀，以一排或一列的方式涂布加載至載樣板上。根據本發(fā)明的另一些實施例，生物標志物可手動或通過自動加樣儀，以點樣或涂布的方式加載至載樣板上。通過這樣的加樣方式，無需自動加樣儀也可以進行加樣，尤其在采用人工加樣時，還可以減少操作人員滴加樣品的次數，方便快捷。
根據本發(fā)明的實施例，可以將相同或不同種類、相同或不同濃度的生物標志物樣品加載至載樣板上，如人白蛋白溶液、其他蛋白、空白對照等。
s200：使載樣板的親水區(qū)域與三維多孔支架芯片的三維多孔支架接觸。
根據本發(fā)明的實施例，將生物標志物加載至載樣板后，將三維多孔支架芯片與載樣板相扣，進行孵育、反應。如圖3和圖4(圖4是圖3圓圈區(qū)域的放大示意圖)所示，將三維多孔支架芯片與載樣板相扣后，三維多孔支架與親水區(qū)域接觸，三維多孔支架吸收樣品液體。
根據本發(fā)明的實施例，每個三維多孔支架可以吸收1～2微升的含水樣品。由此，操作人員在加樣時，根據載樣板對應的三維多孔支架的數量以及每個三維多孔支架的能夠吸收液體的量，每次可將5微升以上的液體滴加至載樣板上的親水區(qū)域，一個區(qū)域可同時供三維多孔支架芯片上一排或者一列的三維多孔支架使用，加樣量增加，不僅減少了操作人員滴加樣品的次數，更無需操作人員滴加1微升以下的樣品，從而減少操作的壓力和操作導致的誤差。
s300：對三維多孔支架芯片進行檢測；其中，三維多孔支架預先攜帶特異性識別生物標志物的親和分子。
根據本發(fā)明的實施例，載樣板的親水區(qū)域與三維多孔支架芯片的三維多孔支架接觸，使生物標志物與親和因子反應后，將三維多孔支架芯片以緩沖液清洗數遍，于吸水紙上吸走多余水分，再與檢測物質孵育、反應。檢測物質的加樣方式與生物標志物的加樣方式相同。
根據本發(fā)明的實施例，檢測物質為修飾了熒光基團、催化物(比如酶)或者貴金屬納米顆粒的抗體/抗原、細胞、微生物、病毒、抗體/抗原、蛋白、小分子、核酸序列(比如dna序列、rna序列)、短肽或多肽等。
根據本發(fā)明的實施例，檢測可以是直接放入酶標儀等具有陣列吸收譜/散射譜/消光譜/反射譜測試功能的儀器里檢測熒光、化學發(fā)光或者吸收光的強弱，也可以通過掃描或拍攝將三維多孔支架芯片上的每個三維多孔支架的灰度、亮度、顏色深淺、熒光強弱、化學發(fā)光的強弱等以圖片形式輸出信號。
根據本發(fā)明的實施例，本發(fā)明提供的三維生物標志物檢測裝置可以用于多種信號方式的檢測，例如可以檢測熒光標記二抗的熒光強度，由此根據熒光強度制作曲線；或者檢測辣根酶標記二抗催化四甲基聯(lián)苯胺等底物的光吸收強度，由此根據吸收強度制作曲線；或者檢測辣根酶催化的二氨基聯(lián)苯胺等底物的顯色灰度，由此根據顯色灰度制作灰度定量曲線。
現有技術中，三維多孔支架芯片的保存和使用均需在含水環(huán)境中，由此在檢測生物標志物時會造成物質的稀釋和擴散，并且吸水性能差，檢測量低。同時，由于形成三維多孔支架為聚合物材料，其冷凍干燥后會變得不透明，干擾檢測信號，所以很難想到將三維多孔支架芯片進行冷凍干燥處理。而本發(fā)明人經過反復研究發(fā)現，根據本發(fā)明的方法制備的三維生物標志物檢測裝置不僅可以解決物質的擴散和稀釋問題，以提高檢測結果的可信度；同時由于三維多孔支架可以做到幾百微米高度的尺寸，方便人工加樣。此外，雖然經過冷凍干燥處理，卻不會造成三維多孔支架的光學干擾，提高了信號傳輸的質量。
下面通過具體的實施例對本發(fā)明進行解釋和說明，本領域技術人員能夠理解的是，下面的實施例僅僅是說明性的，并不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。并且在下面的實施例中，除非特別說明，所采用的試劑、材料均為市售可得的。
實施例1
1、三維多孔支架芯片的制備過程如下：
(1)三維多孔支架芯片的制備
1g聚乙二醇二丙烯酸酯4000、0.1g光引發(fā)劑ig2959、0.006gn-丙烯酰氧基琥珀酰亞胺溶于6ml甘油和4ml水中，配成預混液。以兩片蓋玻片(總350微米厚)夾在一片修飾了十八烷基三氯硅烷(ots)的75mm×25mm×1mm的載玻片和修飾了弘甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(tmspma)同等大小的載玻片中，用移液器將兩片載玻片之間的縫隙灌滿預混液。將6列×16排陣列，孔徑為1.4mm的光掩膜(即除了6列，16排共96個1.4mm直徑的透明區(qū)域外，其他皆為黑色不透光的75mm×25mm塑料膜)蓋于載玻片上，通過紫外光將預混液交聯(lián)形成直徑1.4mm、高350微米的圓柱體水凝膠。將ots修飾的載玻片和蓋玻片撤走后，用水漂洗結合在tmspma載玻片上的水凝膠并將其置于-20℃冷凍。待水凝膠凍實便可置于冷凍干燥機(fd－1a-50，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司)里干燥成多孔支架。
(2)三維多孔支架芯片的捕獲抗體修飾及封閉
將捕獲抗體(如人白蛋白的捕獲抗體)滴加至三維多孔支架芯片上，4℃反應過夜后，加入牛血清白蛋白(bsa)封閉液在室溫下封閉4個小時。用5mtris(ph7)緩沖液沖洗十分鐘三次后，將三維多孔支架芯片浸沒于25％(質量體積比)的蔗糖溶液中置于-20℃冷凍，凍實后干燥。儲存于-20℃真空的環(huán)境儲存。
2、載樣板的制備過程如下：
(1)親疏水間隔模具
本實施例制備的親疏水間隔pdms模具可用于75mm×25mm的載玻片，使其形成16道2毫米寬、25毫米長的親水通道，其余面積為疏水表面。將16條高2毫米、寬2.5毫米、長30毫米的pmma塑料條以2毫米的間隔粘于一塊75毫米×30毫米的1毫米厚的pmma板，再將其置于10厘米直徑的培養(yǎng)皿內制做成親疏水間隔模具的倒模。取出
(2)采用微接觸印刷術制作載樣板
這里采用載玻片作為基底，載玻片的大小為75mm×25mm×1mm。將載玻片進行氧等離子體(plasma)親水處理。使用氧等離子體清潔儀(harrickplasma，pdc-32g)，rf為最高檔位。預先用真空泵抽氣1分鐘后，plasma處理1分鐘。在事先制備好的pdms模具上的突起橫條上均勻涂上10μl/條的1％十八烷基三氯硅烷(ots)(溶于正己烷)，晾干10秒。把涂好ots的pdms模具扣在plasma處理好的載玻片上，輕按20秒。晾干3分鐘。16通道(6列16排)的載樣板便制作完成。
由此獲得本發(fā)明的三維生物標志物檢測裝置。
實施例2
除形成三維多孔支架的原料選用聚乙二醇、光引發(fā)劑、甘油、水，形成疏水材料選用ots以外，按照與實施例1相同的方式制備三維生物標志物檢測裝置。
實施例3
除形成三維多孔支架的原料選用聚(n-異丙基丙烯酰胺)、光引發(fā)劑、甘油、水，形成疏水材料選用pdms以外，按照與實施例1相同的方式制備三維生物標志物檢測裝置。
測試實施例1
應用實施例1制備的三維生物標志物檢測裝置檢測樣品中人白蛋白的濃度。
(1)人白蛋白標準曲線
從-20℃真空環(huán)境中取出修飾了人白蛋白的捕獲抗體的三維多孔支架芯片，待回溫至室溫后，從真空包裝中取出芯片。
分別將6微升、不同濃度(濃度梯度為0、1、10、20、50、100、200、1000、2000、10000、100000ng/ml)的人白蛋白溶液涂抹于載樣板中與三維多孔支架對應的多個親水區(qū)域通道。
將芯片的每一排支架對準載樣板上相對應的載樣通道相扣上，在防蒸發(fā)的環(huán)境中，室溫孵育一個小時。用酶聯(lián)免疫實驗的tris緩沖液(50mm,ph8.0)沖洗3次，于一張吸水紙上吸干多余水分。以同樣的方式在新的載樣板上涂抹辣根酶標記的抗人白蛋白抗體，將吸干水分的芯片與之相扣，如孵育樣品一樣孵育一個小時后再度沖洗3次。
將芯片朝下(即支架朝下)架于酶標儀檢測適配器(spectramaxm5/m5e，moleculardevices)上放入酶標儀讀取450nm的吸收值，此為背景值。將芯片吸干多余水分后，與涂抹了辣根酶底物液的新載樣板扣上反應15分鐘后，立即扣在涂抹了0.18m硫酸終止液的載樣板上，吸附在支架上的液體變成黃色。同樣將芯片朝下架于酶標儀檢測適配器上放入酶標儀讀取450nm的吸收值，此為信號值。
根據讀取數值，繪出人白蛋白的標準曲線(參見圖5a)。
(2)檢驗人白蛋白樣品濃度的準確性
為測試芯片檢測的準確性，將6微升實際濃度為25、50、250、500、750ng/ml的人白蛋白溶液分別涂抹于實施例1制備的載樣板中與三維多孔支架對應的多個親水區(qū)域通道。從-20℃真空環(huán)境中取出修飾了人白蛋白的捕獲抗體的三維多孔支架芯片，待回溫至室溫后，從真空包裝中取出芯片，與涂布了白蛋白溶液的載樣板相扣。其余按照與人白蛋白標準曲線的制備的相同步驟，讀取信號值。將信號值減去背景值即可得到絕對吸收值，套入圖5a中的人白蛋白標準曲線換算出樣品濃度。參見圖5b，以實際濃度為橫軸，換算的樣品濃度為縱軸，如換算濃度完全相等于實際濃度(完全落在虛線上)既認為檢測100％準確。
(3)未知濃度的人白蛋白樣品檢測
從-20℃真空環(huán)境中取出修飾了人白蛋白的捕獲抗體的三維多孔支架芯片，待回溫至室溫后，從真空包裝中取出芯片。將6微升未知濃度的人白蛋白溶液涂抹于實施例1制備的載樣板的其中一個通道。其余按照與人白蛋白標準曲線的制備的相同步驟，讀取信號值。將信號值減去背景值即可得到絕對吸收值，套入圖5a中的人白蛋白標準曲線即可換算樣品濃度。
測試實施例2
應用實施例1制備的三維生物標志物檢測裝置對乙酰氨基酚對heparg人肝癌細胞分泌人白蛋白量的影響進行檢測。
以3000個細胞/孔的密度將heparg種植在三維的細胞培養(yǎng)芯片上(參考x.li,x.zhang,s.zhao,j.wang,g.liuandy.du,labonachip,2014,14,471-481)，用添加了10％胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素、2mmglutamax、0.5μm氫化可的松半琥酯和4μg/ml胰島素的william’se培養(yǎng)基在37℃、5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5天后，將三維細胞培養(yǎng)芯片上培養(yǎng)的細胞劃分為6組，分別加入20、10、5、2.5、1.25mm乙酰氨基酚和0.1％二甲基亞砜處理24小時。從-20℃真空環(huán)境中取出修飾了人白蛋白的捕獲抗體的三維多孔支架芯片，待回溫至室溫后，從真空包裝中取出芯片，將芯片與三維細胞培養(yǎng)芯片相扣，使三維多孔支架芯片和三維細胞培養(yǎng)芯片上細胞分泌的白蛋白進行反應。其余按照與人白蛋白標準曲線的制備的相同步驟，讀取信號值。將信號值減去背景值即可得到絕對吸收值，套入圖5a中的人白蛋白標準曲線即可換算樣品濃度。將不同濃度的乙酰氨基酚處理的細胞所分泌的白蛋白量除以0.1％二甲基亞砜處理的細胞所分泌的白蛋白量以得到相對白蛋白表達量，參見圖6。
在本說明書的描述中，參考術語“一個實施例”、“一些實施例”、“示例”、“具體示例”、或“一些示例”等的描述意指結合該實施例或示例描述的具體特征、結構、材料或者特點包含于本發(fā)明的至少一個實施例或示例中。在本說明書中，對上述術語的示意性表述不必須針對的是相同的實施例或示例。而且，描述的具體特征、結構、材料或者特點可以在任一個或多個實施例或示例中以合適的方式結合。此外，在不相互矛盾的情況下，本領域的技術人員可以將本說明書中描述的不同實施例或示例以及不同實施例或示例的特征進行結合和組合。
盡管上面已經示出和描述了本發(fā)明的實施例，可以理解的是，上述實施例是示例性的，不能理解為對本發(fā)明的限制，本領域的普通技術人員在本發(fā)明的范圍內可以對上述實施例進行變化、修改、替換和變型。
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