本發(fā)明涉及一種光電化學(xué)分析和環(huán)境檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種水體中微囊藻毒素MC-LR的選擇性光電化學(xué)分析方法。

背景技術(shù)：

在過(guò)去幾十年中，隨著地表水的富營(yíng)養(yǎng)化和全球氣候的改變，每年都會(huì)導(dǎo)致藍(lán)藻水華的大量爆發(fā)。微囊藻毒素(Microcystins，MCs)就是由水體中藍(lán)綠藻如微囊藻屬、魚腥藻屬、顫藻屬等產(chǎn)生的具有生物活性的單環(huán)七肽化合物。微囊藻毒素化學(xué)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，且容易在生物體內(nèi)積累富集。在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)結(jié)構(gòu)的90多種微囊藻毒素中，微囊藻毒素-LR(MC-LR)最為普遍，毒性最強(qiáng)。MC-LR的分子式為C₄₉H₇₄N₁₀O₁₂，分子量為995.2。MC-LR表現(xiàn)出很強(qiáng)的肝毒性，通過(guò)肝臟中有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)入肝臟，抑制蛋白磷酸酶1和2A的活性從而對(duì)肝臟造成損傷，最后可能導(dǎo)致人和動(dòng)物的死亡。MC-LR還是一種腫瘤促進(jìn)劑，人和動(dòng)物通過(guò)飲水、透析和食物鏈等方式長(zhǎng)期攝入，增加了罹患腫瘤的幾率。世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定飲用水中MC-LR最大含量為1μg/L。因此，實(shí)現(xiàn)MC-LR的快速、高選擇性和高靈敏檢測(cè)具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和環(huán)境意義。

MC-LR的常用檢測(cè)方法有高效液相色譜法(HPLC)、液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)、毛細(xì)管電泳、蛋白磷酸酶抑制法(PPIA)等，上述方法雖然具有較高的靈敏度，但所用儀器昂貴、樣品前處理復(fù)雜、分析耗時(shí)、對(duì)分析人員要求較高等缺點(diǎn)。光電化學(xué)分析方法是光化學(xué)和電化學(xué)技術(shù)的結(jié)合，具有電化學(xué)儀器價(jià)格低廉、信號(hào)響應(yīng)迅速、靈敏度高、易于在線檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)可采用不同的激發(fā)光和不同的檢測(cè)方法，排除更多背景干擾，具有更高的靈敏度。但是，光電化學(xué)分析過(guò)程中產(chǎn)生的強(qiáng)氧化能力的·OH，能對(duì)不同分子進(jìn)行無(wú)差異性氧化，從而導(dǎo)致選擇性檢測(cè)效果并不理想。

中國(guó)專利201310120054.7公開(kāi)了一種檢測(cè)生物體內(nèi)微囊藻毒素MC-LR的方法，包括微囊藻毒素MC-LR的提取、微囊藻毒素MC-LR的富集、分離與純化、 UPLC-MS定性分析和外標(biāo)法定量分析步驟。該專利的對(duì)MC-LR的檢測(cè)方法雖然靈敏度較高，但是樣品前處理較為復(fù)雜，同時(shí)因?yàn)樯V分析時(shí)的·OH的無(wú)差別氧化而導(dǎo)致檢測(cè)的精準(zhǔn)度不理想。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷而提供一種水體中微囊藻毒素MC-LR的選擇性光電化學(xué)分析方法。

本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：

一種水體中微囊藻毒素MC-LR的選擇性光電化學(xué)分析方法，包括以下步驟：

(1)配制含炔基修飾石墨烯、CuSO₄·5H₂O和抗壞血酸的THF溶液A，超聲分散后將疊氮功能化TiO₂NTs置于THF溶液A中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)，所得產(chǎn)物洗滌干燥后，即得石墨烯修飾TiO₂NTs電極；

(2)配制MC-LR核酸適配體水溶液，直接滴凃在步驟(1)制得的石墨烯修飾TiO₂NTs電極上，室溫下靜置，即制得MC-LR光電化學(xué)適配體傳感器；

(3)配制不同濃度的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液，添加到以MC-LR光電化學(xué)適配體傳感器為工作電極的三電極體系中，室溫作用，施加偏壓，在可見(jiàn)光激發(fā)下采用I-t曲線法進(jìn)行光電流測(cè)定，通過(guò)光電流密度的變化量與各MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對(duì)數(shù)關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，然后將含MC-LR的待檢測(cè)樣品添加到三電極體系中，測(cè)定光電流密度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線即可得待檢測(cè)樣品的MC-LR濃度。

步驟(1)中所述的炔基修飾石墨烯通過(guò)以下步驟制備而成：

配制氧化石墨烯水溶液，超聲分散后，加入N₂H₄·H₂O對(duì)氧化石墨烯進(jìn)行還原，再加入NH₃·H₂O調(diào)節(jié)pH至11，得到混合液A，攪拌反應(yīng)，再加入4-乙炔基苯胺和亞硝酸異戊酯，得到混合液B，繼續(xù)攪拌反應(yīng)，冷卻至室溫，分離洗滌干燥后，得到炔基修飾石墨烯；

炔基修飾石墨烯的制備過(guò)程中：

所述的氧化石墨烯通過(guò)Hummers法制備得到，氧化石墨烯水溶液的濃度為1～4g/L，N₂H₄·H₂O的濃度為0.5～3v/v％，混合液B中4-乙炔基苯胺與亞硝酸異戊酯的濃度分別為0.1～2wt％和0.2～4v/v％；超聲分散的時(shí)間為0.5～3h。

混合液A的攪拌反應(yīng)時(shí)間為0.5～2h，反應(yīng)溫度為70～95℃；混合液B攪拌反應(yīng)的時(shí)間為10～20h，反應(yīng)溫度為60～90℃；洗滌為將分離產(chǎn)物用去離子水和稀HCl 洗滌直至濾液清澈，干燥溫度為40～60℃，干燥時(shí)間為10～20h。

步驟(1)中所述的疊氮功能化TiO₂NTs通過(guò)以下步驟制備而成：

以鈦板為陽(yáng)極、鉑片為陰極于NH₄F和H₂O的乙二醇混合液中恒電位陽(yáng)極氧化，然后置于管式爐中煅燒，得到直立有序的TiO₂NTs，然后將直立有序的TiO₂NTs置于APTES乙醇溶液中浸泡，水洗晾干后，得到表面氨基修飾TiO₂NTs，再將表面氨基修飾TiO₂NTs置于含4-疊氮基苯甲酸和EDC·HCl的THF溶液B中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物洗滌晾干后，即得到疊氮基功能化TiO₂NTs。

疊氮功能化TiO₂NTs的制備過(guò)程中：

鈦板陽(yáng)極氧化的溫度為15～30℃，氧化時(shí)間為2～4h，電位為20～50V，乙二醇混合液中NH₄F的濃度為0.1～0.4wt％，H₂O的濃度為1～3wt％，管式爐中的煅燒溫度為400～500℃，煅燒時(shí)間為2～4h；

APTES乙醇溶液的濃度為0.5～2v/v％，TiO₂NTs的浸泡時(shí)間為6～15h；THF溶液B中4-疊氮基苯甲酸的濃度為6～10g/L，EDC·HCl的濃度為15～30g/L，表面氨基修飾TiO₂NTs的反應(yīng)溫度為室溫，反應(yīng)時(shí)間為20～30h。

步驟(1)中THF溶液A中炔基修飾石墨烯的濃度為0.5～2g/L，CuSO₄·5H₂O為3～8g/L，抗壞血酸的濃度為10～15g/L；超聲分散的時(shí)間為10～30min，反應(yīng)溫度為室溫，反應(yīng)時(shí)間為20～30h。

步驟(2)中MC-LR核酸適配體的堿基序列如SEQ ID NO.1所示。

步驟(2)中MC-LR核酸適配體的水溶液的濃度為5～15μmol/L，石墨烯修飾TiO₂NTs電極的面積為5～10mm×5～10mm，滴凃在石墨烯修飾TiO₂NTs電極上的MC-LR核酸適配體水溶液為10～50μL，靜置時(shí)間為10～30min。

步驟(3)中所述的三電極體系以MC-LR光電化學(xué)適配體傳感器為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，0.1～0.2M pH為7.4的PBS緩沖溶液為支持電解質(zhì)；步驟(3)中室溫作用的時(shí)間為30～60min，偏壓為0.3～0.6V。

采用上述分析方法，分別檢測(cè)MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液和干擾物質(zhì)體系，發(fā)現(xiàn)干擾物質(zhì)對(duì)MC-LR的檢測(cè)干擾小于10％，工作電極的選擇性極好，其中，干擾物質(zhì)體系為將MC-LR與干擾物質(zhì)混合；干擾物質(zhì)體系中：MC-LR的濃度與MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液相同，干擾物質(zhì)的摩爾濃度為MC-LR的100倍；干擾物質(zhì)為殺蟲單、阿特拉津、草甘膦、氧樂(lè)果、百草枯、敵百蟲或啶蟲瞇。

本發(fā)明采用點(diǎn)擊化學(xué)將石墨烯化學(xué)鍵合修飾到TiO₂NTs上，大幅度提高了基 底電極的光電化學(xué)性能，同時(shí)為MC-LR核酸適配體提供了作用位點(diǎn)，有力地提高了檢測(cè)效果。直立有序的TiO₂NTs具有高化學(xué)穩(wěn)定性、低成本、高活性、無(wú)腐蝕性、無(wú)毒、較高的光電轉(zhuǎn)換效率等優(yōu)點(diǎn)，但其僅能被波長(zhǎng)較短的紫外光激發(fā)，且光激發(fā)產(chǎn)生的光生電子和空穴易復(fù)合使光電轉(zhuǎn)換效率降低，石墨烯具有大的比表面積、良好的吸附性能、透光性能好及高的電子遷移率，將石墨烯與半導(dǎo)體材料結(jié)合，制成石墨烯修飾TiO₂NTs電極，能有效促進(jìn)光生電子和空穴的分離，從而提高其光電化學(xué)性能。本發(fā)明中所用的MC-LR核酸適配體為采用【Environmental Science and Technology,2012,46,10697-10703】中所述方法篩選得到，其具有超靈敏光電分析技術(shù)和具有特異性識(shí)別功能，通過(guò)將其與石墨烯修飾TiO₂NTs電極構(gòu)筑成MC-LR光電化學(xué)適配體傳感器，具有良好的選擇性和靈敏度。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)的方法將石墨烯共價(jià)鍵合到TiO₂NTs上，共價(jià)連接使所得電極結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，并且大大改善了電極的光電化學(xué)性能，實(shí)現(xiàn)了檢測(cè)信號(hào)的放大，并且點(diǎn)擊化學(xué)為實(shí)現(xiàn)電極表面石墨烯單層修飾提供了可能，同時(shí)使電極材料的光響應(yīng)拓寬到可見(jiàn)光區(qū)，有利于核酸適配體維持較高的生物活性；

(2)工藝簡(jiǎn)單：本發(fā)明采用石墨烯修飾，石墨烯的sp²雜化六元環(huán)結(jié)構(gòu)和DNA鏈上的核酸堿基通過(guò)簡(jiǎn)單的π-π堆積作用力，可方便的將核酸適配體物理吸附到石墨烯修飾TiO₂NTs電極表面，簡(jiǎn)化了適配體固定到電極表面的步驟；

(3)采用光電化學(xué)分析方法實(shí)現(xiàn)對(duì)MC-LR的分析檢測(cè)，信號(hào)變化靈敏，響應(yīng)迅速，操作簡(jiǎn)單，分析時(shí)間端，選擇性高，傳感器對(duì)MC-LR的檢測(cè)限低達(dá)0.5pg/L，線性檢測(cè)范圍為1.0～497.6pg/L。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。本實(shí)施例以本發(fā)明技術(shù)方案為前提進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。

實(shí)施例1

一種水體中微囊藻毒素MC-LR的選擇性光電化學(xué)分析新方法，其工作電極具體制備過(guò)程如下：

(1)炔基修飾石墨烯的合成(G-alkyne)：用Hummers法制備得氧化石墨烯 (GO)，配制成2g/L水溶液，超聲分散3h，然后加入濃度為1v/v％的N₂H₄·H₂O對(duì)GO進(jìn)行還原，并用NH₃·H₂O調(diào)混合液pH＝11.00，混合物在90℃下攪拌反應(yīng)1h。再加入4-乙炔基苯胺和亞硝酸異戊酯使其濃度分別為0.5wt％和0.6v/v％，80℃下劇烈攪拌反應(yīng)過(guò)夜。然后冷卻至室溫，離心過(guò)濾。并用去離子水和稀HCl洗滌直至濾液清澈，50℃真空干燥過(guò)夜。

(2)石墨烯在TiO₂NTs表面的組裝：將鈦板依次用砂紙打磨拋光清洗后，25℃下以鈦板為陽(yáng)極，鉑片為陰極于0.3wt％NH₄F和2wt％H₂O的乙二醇溶液中恒電位30V陽(yáng)極氧化3h，然后置于管式爐中500℃煅燒3h，得直立有序的TiO₂NTs。將TiO₂NTs置于1v/v％APTES乙醇溶液中室溫浸泡12h，水洗晾干，得表面氨基修飾TiO₂NTs。將氨基修飾TiO₂NTs置于含8.16g/L 4-疊氮基苯甲酸和19.17g/L EDC·HCl的10mL THF溶液中，N₂保護(hù)下室溫反應(yīng)24h，用THF、蒸餾水洗滌晾干，得疊氮基功能化TiO₂NTs。配制1g/L G-alkyne、5g/L CuSO₄·5H₂O、13.2g/L AA的THF混合溶液，超聲分散15min將疊氮基功能化的TiO₂NTs置于混合溶液，N₂保護(hù)下室溫反應(yīng)24h，然后用THF、蒸餾水洗滌晾干，得石墨烯修飾TiO₂NTs，表示為G/TiO₂NTs。用絕緣膠對(duì)制備電極進(jìn)行封和，控制電極面積10mm×10mm。

(3)Aptamer/G/TiO₂NTs電極的組裝：取50μL 10μmol/L MC-LR核酸適配體直接滴涂于G/TiO₂NTs電極上，室溫下靜置20min，用蒸餾水洗去非吸附在電極上的適配體，由此制備得到MC-LR光電化學(xué)適配體傳感器(Aptamer/G/TiO₂NTs)。其中，使用的MC-LR的適配體的堿基序列為：

5’-GGC GCC AAA CAG GAC CAC CAT GAC AAT TAC CCA TAC CAC CTC ATT ATG CCC CAT CTC CGC-3’。

實(shí)施例2

采用傳統(tǒng)三電極體系，以實(shí)施例1制備的Aptamer/G/TiO₂NTs為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，以0.1M pH為7.4的PBS緩沖溶液為支持電解質(zhì)，向體系中加入不同濃度MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液，控制MC-LR與適配體室溫下作用時(shí)間為45min?？梢?jiàn)光激發(fā)下施加0.3V偏壓，采用I-t曲線法測(cè)定含不同濃度MC-LR體系的光電流，根據(jù)電極的工作面積換算成光電流密度(j)。一定MC-LR濃度范圍內(nèi)，隨MC-LR濃度的增加，光電流密度也相應(yīng)增加，這是由于當(dāng)MC-LR與電極表面適配體特異性結(jié)合后，引起適配體構(gòu)型的轉(zhuǎn)變，引起部分適配體從電極表面解離，使得電子在溶液和電極界面上的傳輸阻力減小，導(dǎo)致光電 流密度的增大。利用光電流密度的增加值Δj與MC-LR的濃度的對(duì)數(shù)之間的關(guān)系繪制工作曲線，得到對(duì)MC-LR的定量檢測(cè)。Aptamer/G/TiO₂NTs電極對(duì)MC-LR的檢測(cè)限低達(dá)0.5pg/L，線性檢測(cè)范圍為1.0～497.6pg/L。

實(shí)施例3

以制備的Aptamer/G/TiO₂NTs為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，以0.1M pH為7.4的PBS緩沖溶液為支持電解質(zhì)?？梢?jiàn)光激發(fā)下施加0.3V偏壓，采用I-t曲線法分別測(cè)定含99.5pg/L MC-LR溶液和干擾物質(zhì)體系的光電流，干擾物質(zhì)體系為MC-LR與干擾物質(zhì)的混合溶液，其中，干擾物質(zhì)體系中MC-LR的濃度為99.5pg/L，干擾物質(zhì)的濃度為MC-LR摩爾濃度的100倍，計(jì)算相對(duì)光電流比率(R)，得到傳感器的選擇性能。干擾物質(zhì)包括殺蟲單、阿特拉津、草甘膦、氧樂(lè)果、百草枯、敵百蟲、啶蟲瞇。結(jié)果表明，干擾物質(zhì)為殺蟲單、阿特拉津、草甘膦、氧樂(lè)果、啶蟲瞇時(shí)，對(duì)MC-LR測(cè)定的干擾小于5％；干擾物質(zhì)為百草枯、敵百蟲時(shí)，對(duì)MC-LR測(cè)定的干擾小于10％，體現(xiàn)了Aptamer/G/TiO₂NTs良好的選擇性。

實(shí)施例4

一種水體中微囊藻毒素MC-LR的選擇性光電化學(xué)分析方法，包括以下步驟：

(1)炔基修飾石墨烯的合成：用Hummers法制備得氧化石墨烯(GO)，配制成1g/L水溶液，超聲分散0.5h后，加入的濃度為0.5v/v％的N₂H₄·H₂O對(duì)GO進(jìn)行還原，加入NH₃·H₂O調(diào)節(jié)pH至11，在70℃下攪拌反應(yīng)0.5h，再加入4-乙炔基苯胺和亞硝酸異戊酯，得到混合液B，保持混合液B中4-乙炔基苯胺的濃度為0.1wt％，亞硝酸異戊酯的濃度為0.2v/v％，在60℃下劇烈攪拌反應(yīng)10h，冷卻至室溫，離心過(guò)濾，并用去離子水和稀HCl洗滌直至濾液清澈，40℃下真空干燥10h，得到炔基修飾石墨烯；

(2)疊氮功能化TiO₂NTs的制備：將鈦板用金相砂紙打磨拋光清洗后，15℃下以鈦板為陽(yáng)極、鉑片為陰極，于含0.1wt％NH₄F和1wt％H₂O的乙二醇混合液中恒電位20V陽(yáng)極氧化2h，然后置于管式爐中400℃下煅燒2h，得到直立有序的TiO₂NTs，然后將TiO₂NTs置于濃度為0.5v/v％的APTES乙醇溶液中浸泡6h，水洗晾干后，得到表面氨基修飾TiO₂NTs，再將表面氨基修飾TiO₂NTs置于含6g/L的4-疊氮基苯甲酸和15g/L的EDC·HCl的THF溶液B中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)20h，反應(yīng)產(chǎn)物用THF、蒸餾水洗滌晾干，即得到疊氮基功能化TiO₂NTs；

(3)石墨烯在TiO₂NTs表面的組裝：配制含0.5g/L的炔基修飾石墨烯、3g/L的CuSO₄·5H₂O、10g/L的抗壞血酸的THF溶液A，超聲分散10min后，將步驟(2)制得的疊氮基功能化TiO₂NTs置于THF溶液A中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)20～30h，所得反應(yīng)產(chǎn)物用THF、蒸餾水洗滌晾干，即得石墨烯修飾TiO₂NTs電極，控制電極面積5mm×5mm；

(4)MC-LR光電化學(xué)適配體傳感器的構(gòu)筑：將MC-LR核酸適配體離心后配制成5μmol/L的水溶液，取10μL直接滴凃于步驟(3)所制得的石墨烯修飾TiO₂NTs電極上，室溫下靜置10min，即制得MC-LR光電化學(xué)適配體傳感器(Aptamer/G/TiO₂NTs)，其中，使用的MC-LR的適配體的堿基序列為：

5’-GGC GCC AAA CAG GAC CAC CAT GAC AAT TAC CCA TAC CAC CTC ATT ATG CCC CAT CTC CGC-3’；

(5)MC-LR的光電分析：采用傳統(tǒng)的三電極體系，以MC-LR光電化學(xué)適配體傳感器為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，0.1M pH為7.4的PBS緩沖溶液為支持電解質(zhì)，配制不同濃度的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液，以標(biāo)準(zhǔn)加入法添加到以MC-LR光電化學(xué)適配體傳感器為工作電極的三電極體系中，室溫作用30min，施加0.3V偏壓，在可見(jiàn)光激發(fā)下采用I-t曲線法進(jìn)行光電流測(cè)定，通過(guò)光電流密度的變化量與各MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對(duì)數(shù)關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，然后將含MC-LR的待檢測(cè)樣品添加到三電極體系中，測(cè)定光電流密度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線即可得待檢測(cè)樣品的MC-LR濃度。

實(shí)施例5

一種水體中微囊藻毒素MC-LR的選擇性光電化學(xué)分析方法，包括以下步驟：

(1)炔基修飾石墨烯的合成：用Hummers法制備得氧化石墨烯(GO)，配制成4g/L水溶液，超聲分散3h后，加入的濃度為3v/v％的N₂H₄·H₂O對(duì)GO進(jìn)行還原，加入NH₃·H₂O調(diào)節(jié)pH至11，在95℃下攪拌反應(yīng)2h，再加入4-乙炔基苯胺和亞硝酸異戊酯，得到混合液B，保持混合液B中4-乙炔基苯胺的濃度為2wt％，亞硝酸異戊酯的濃度為4v/v％，在90℃下劇烈攪拌反應(yīng)20h，冷卻至室溫，離心過(guò)濾，并用去離子水和稀HCl洗滌直至濾液清澈，60℃下真空干燥20h，得到炔基修飾石墨烯；

(2)疊氮功能化TiO₂NTs的制備：將鈦板用金相砂紙打磨拋光清洗后，30℃下以鈦板為陽(yáng)極、鉑片為陰極，于含0.4wt％NH₄F和3wt％H₂O的乙二醇混合液中 恒電位50V陽(yáng)極氧化4h，然后置于管式爐中500℃下煅燒4h，得到直立有序的TiO₂NTs，然后將TiO₂NTs置于濃度為2v/v％的APTES乙醇溶液中浸泡12h，水洗晾干后，得到表面氨基修飾TiO₂NTs，再將表面氨基修飾TiO₂NTs置于含10g/L的4-疊氮基苯甲酸和30g/L的EDC·HCl的THF溶液B中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)30h，反應(yīng)產(chǎn)物用THF、蒸餾水洗滌晾干，即得到疊氮基功能化TiO₂NTs；

(3)石墨烯在TiO₂NTs表面的組裝：配制含2g/L的炔基修飾石墨烯、8g/L的CuSO₄·5H₂O、15g/L的抗壞血酸的THF溶液A，超聲分散30min后，將步驟(2)制得的疊氮基功能化TiO₂NTs置于THF溶液A中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)30h，所得反應(yīng)產(chǎn)物用THF、蒸餾水洗滌晾干，即得石墨烯修飾TiO₂NTs電極，控制電極面積10mm×10mm；

(4)MC-LR光電化學(xué)適配體傳感器的構(gòu)筑：將MC-LR核酸適配體離心后配制成15μmol/L的水溶液，取50μL直接滴凃于步驟(3)所制得的石墨烯修飾TiO₂NTs電極上，室溫下靜置30min，即制得MC-LR光電化學(xué)適配體傳感器(Aptamer/G/TiO₂NTs)，其中，使用的MC-LR的適配體的堿基序列為：

5’-GGC GCC AAA CAG GAC CAC CAT GAC AAT TAC CCA TAC CAC CTC ATT ATG CCC CAT CTC CGC-3’；

(5)MC-LR的光電分析：采用傳統(tǒng)的三電極體系，以MC-LR光電化學(xué)適配體傳感器為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，0.2M pH為7.4的PBS緩沖溶液為支持電解質(zhì)，配制不同濃度的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液，以標(biāo)準(zhǔn)加入法添加到以MC-LR光電化學(xué)適配體傳感器為工作電極的三電極體系中，室溫作用60min，施加0.6V偏壓，在可見(jiàn)光激發(fā)下采用I-t曲線法進(jìn)行光電流測(cè)定，通過(guò)光電流密度的變化量與各MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對(duì)數(shù)關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，然后將含MC-LR的待檢測(cè)樣品添加到三電極體系中，測(cè)定光電流密度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線即可得待檢測(cè)樣品的MC-LR濃度。

實(shí)施例6

一種水體中微囊藻毒素MC-LR的選擇性光電化學(xué)分析方法，包括以下步驟：

(1)炔基修飾石墨烯的合成：用Hummers法制備得氧化石墨烯(GO)，配制成2g/L水溶液，超聲分散2h后，加入的濃度為0.15v/v％的N₂H₄·H₂O對(duì)GO進(jìn)行還原，加入NH₃·H₂O調(diào)節(jié)pH至11，在85℃下攪拌反應(yīng)1.5h，再加入4-乙炔基苯胺和亞硝酸異戊酯，得到混合液B，保持混合液B中4-乙炔基苯胺的濃度為1wt％， 亞硝酸異戊酯的濃度為2v/v％，在80℃下劇烈攪拌反應(yīng)15h，冷卻至室溫，離心過(guò)濾，并用去離子水和稀HCl洗滌直至濾液清澈，50℃下真空干燥15h，得到炔基修飾石墨烯；

(2)疊氮功能化TiO₂NTs的制備：將鈦板用金相砂紙打磨拋光清洗后，20℃下以鈦板為陽(yáng)極、鉑片為陰極，于含0.2wt％NH₄F和2wt％H₂O的乙二醇混合液中恒電位35V陽(yáng)極氧化3h，然后置于管式爐中450℃下煅燒3h，得到直立有序的TiO₂NTs，然后將TiO₂NTs置于濃度為1v/v％的APTES乙醇溶液中浸泡15h，水洗晾干后，得到表面氨基修飾TiO₂NTs，再將表面氨基修飾TiO₂NTs置于含8g/L的4-疊氮基苯甲酸和25g/L的EDC·HCl的THF溶液B中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)25h，反應(yīng)產(chǎn)物用THF、蒸餾水洗滌晾干，即得到疊氮基功能化TiO₂NTs；

(3)石墨烯在TiO₂NTs表面的組裝：配制含1g/L的炔基修飾石墨烯、6g/L的CuSO₄·5H₂O、12g/L的抗壞血酸的THF溶液A，超聲分散20min后，將步驟(2)制得的疊氮基功能化TiO₂NTs置于THF溶液A中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)25h，所得反應(yīng)產(chǎn)物用THF、蒸餾水洗滌晾干，即得石墨烯修飾TiO₂NTs電極，控制電極面積8mm×7mm；

(4)MC-LR光電化學(xué)適配體傳感器的構(gòu)筑：將MC-LR核酸適配體離心后配制成10μmol/L的水溶液，取30μL直接滴凃于步驟(3)所制得的石墨烯修飾TiO₂NTs電極上，室溫下靜置20min，即制得MC-LR光電化學(xué)適配體傳感器(Aptamer/G/TiO₂NTs)，其中，使用的MC-LR的適配體的堿基序列為：

5’-GGC GCC AAA CAG GAC CAC CAT GAC AAT TAC CCA TAC CAC CTC ATT ATG CCC CAT CTC CGC-3’；

(5)MC-LR的光電分析：采用傳統(tǒng)的三電極體系，以MC-LR光電化學(xué)適配體傳感器為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉑絲電極為對(duì)電極，0.15M pH為7.4的PBS緩沖溶液為支持電解質(zhì)，配制不同濃度的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液，以標(biāo)準(zhǔn)加入法添加到以MC-LR光電化學(xué)適配體傳感器為工作電極的三電極體系中，室溫作用45min，施加0.45V偏壓，在可見(jiàn)光激發(fā)下采用I-t曲線法進(jìn)行光電流測(cè)定，通過(guò)光電流密度的變化量與各MC-LR標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的對(duì)數(shù)關(guān)系繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，然后將含MC-LR的待檢測(cè)樣品添加到三電極體系中，測(cè)定光電流密度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)工作曲線即可得待檢測(cè)樣品的MC-LR濃度。

上述的對(duì)實(shí)施例的描述是為便于該技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能理解和使用發(fā) 明。熟悉本領(lǐng)域技術(shù)的人員顯然可以容易地對(duì)這些實(shí)施例做出各種修改，并把在此說(shuō)明的一般原理應(yīng)用到其他實(shí)施例中而不必經(jīng)過(guò)創(chuàng)造性的勞動(dòng)。因此，本發(fā)明不限于上述實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的揭示，不脫離本發(fā)明范疇所做出的改進(jìn)和修改都應(yīng)該在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。