本發(fā)明專利是涉及醫(yī)學(xué)臨床診斷技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種基于酶聯(lián)免疫法的Septin9檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)：

Septin是一個(gè)廣泛存在于除植物以外所有真核生物中的基因家族。最初認(rèn)為septin家族是與酵母細(xì)胞胞質(zhì)分裂相關(guān)的基因家族，然而隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)這類基因編碼的蛋白在許多生物體內(nèi)出現(xiàn)了較大的功能分化，尤其是在哺乳動(dòng)物中，他們不僅成員眾多，而且參與了細(xì)胞分裂、細(xì)胞極化、囊泡運(yùn)輸及胞膜重構(gòu)等多個(gè)過程。更引起研究人員重視的是：最近有大量的數(shù)據(jù)表明，這一家族的一些成員與腫瘤發(fā)生、神經(jīng)功能障礙和病原微生物感染的過程直接相關(guān)。

SEPT9定位于染色體17q25.3，該染色體區(qū)段是散發(fā)性卵巢癌和乳腺癌的常見雜合性丟失部位。在卵巢癌，約70％的17q等位基因丟失為17q25。Kalikin等以17個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記確定了卵巢癌17q的最小缺失區(qū)，并克隆到了一個(gè)候選腫瘤抑制基因，命名為，arian/breast(Ov/Br)septin蛋白(即SEPT9)。但是，新近研究又支持SEPT9為潛在原癌基因。在PyV-mT過渡表達(dá)所致的乳腺癌，SKY和CGH檢測(cè)發(fā)現(xiàn)17q25.3區(qū)有擴(kuò)增，RT-PCR證實(shí)有SEPT9基因表達(dá)上調(diào)，9個(gè)乳腺癌細(xì)胞系中表達(dá)也上調(diào)。SEPT9表達(dá)上調(diào)的乳腺癌細(xì)胞系Thsp-1和Bax下調(diào)，細(xì)胞凋亡受抑制。siRNA抑制septin 9表達(dá)后，細(xì)胞凋亡抑制效應(yīng)解除。7287例人新鮮組織和292個(gè)人細(xì)胞系的Affymetrix HG_U133基因芯片檢測(cè)結(jié)果的分析表明，SEPT9在乳腺、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、子宮內(nèi)膜、腎臟、肝、肺、淋巴、食管、卵巢、胰腺、軟組織、皮膚、甲狀腺等來源的腫瘤中高表達(dá)，RT-PCR與免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果大致與芯片結(jié)果一致。最近前列腺癌細(xì)胞系體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，MSF-(SEPT9-vla)可以通過抑制缺氧誘導(dǎo)因子1a(hypo-xia-inducible factor-，HIF1a)的泛素化降解途徑，從而促進(jìn)HIF1a的表達(dá)，并促進(jìn)腫瘤血管形成。該研究為septin家族在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用提供了直接證據(jù)。

Septin9蛋白是一個(gè)潛在的重要的腫瘤標(biāo)志物，但是目前檢測(cè)septin9蛋白的方法復(fù)雜且昂貴，因此，需要一種準(zhǔn)確快速定量的檢測(cè)方法滿足科學(xué)研究已經(jīng)臨床的需要。本發(fā)明提供的人septin9酶聯(lián)免疫試劑盒，可以快速準(zhǔn)確的檢測(cè)人血液、組織液等體液中的septin9的含量。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種基于酶聯(lián)免疫法的Septin9檢測(cè)試劑盒。該試劑盒具有檢測(cè)靈敏度高，特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定性好，無污染，重復(fù)性好的特點(diǎn)。

一種人septin9酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，主要包括：

(1)包被有septin9特異性抗體的酶標(biāo)板；

(2)酶標(biāo)記物(為酶標(biāo)記的septin9特異性抗體)；

(3)Septin9標(biāo)準(zhǔn)品溶液；

(4)底物顯色液；

(5)終止液；

(6)濃縮洗滌液。

本發(fā)明提供的septin9酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒，包括包被有septin9特異性抗體I的酶標(biāo)板，酶標(biāo)記物(為酶標(biāo)記的septin9特異性抗體II)。所述septin9特異性I和特異性抗體II可以為多克隆抗體或單克隆抗體。

所述酶標(biāo)記物的標(biāo)記酶為辣根過氧化物酶(HRP)或堿性磷酸酯酶(ALP)，其中優(yōu)選HRP；酶標(biāo)記的septin9特異性抗體II采用戊二醛法或過碘酸鈉法將標(biāo)記酶與抗體偶聯(lián)得到。

所述試劑盒還包括septin9標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底物顯色液、終止液和濃縮洗滌液。

所述底物顯色液，當(dāng)標(biāo)記酶為HRP時(shí)，底物顯色液由顯色液A和顯色液B組成，顯色液A為過氧化氫或過氧化脲，顯色液B為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，所述終止液為1-2mol/L硫酸。當(dāng)標(biāo)記酶為ALP時(shí)，底物顯色液為對(duì)硝基苯磷酸酯緩沖液，所述終止液為1-2mol/L氫氧化鈉。

本發(fā)明所述試劑盒中septin9標(biāo)準(zhǔn)品溶液6瓶，0ng/ml，0.3ng/ml，0.9ng/ml，2.7ng/ml，8.1ng/ml，24.3ng/ml，1ml/瓶。

本發(fā)明中酶標(biāo)板的制備過程為：用包被緩沖液將septin9特異性抗體I稀釋成0.05-0.1ug/ml，每孔加入100ul，用封板膜封閉，4℃過夜孵育，倒掉包被液，用洗滌液洗2次，拍干，然后每孔中加入150-200ul封閉液，37℃孵育1-2h，倒掉封閉液拍干，37℃烘箱干燥2h，鋁箔真空密封保存。

其中酶標(biāo)板制備過程中所用的包被緩沖液為pH9.6，0.05M碳酸鹽緩沖液；所用封閉液為含有BSA 1％，小牛血清20％，疊氮鈉0.05％的pH 7.4 0.1M磷酸鹽緩沖液。

本發(fā)明的septin9酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒采用雙抗體夾心法定量檢測(cè)人血清、血漿或尿液中的septin9。將標(biāo)準(zhǔn)品和樣品加入到酶標(biāo)板的微孔中，再加入酶標(biāo)抗體室溫下孵育30min，樣本中的septin9與微孔中抗體及酶標(biāo)抗體特異性結(jié)合，形成雙抗體夾心的結(jié)構(gòu)，之后沖洗。再加入顯色底物液，底物在酶標(biāo)抗體上HRP或ALP作用下，顯色15分鐘，加入終止液中止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀下450nm處讀取 吸光度，septin9濃度與吸光度高低呈正比。

本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果分析過程為：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度和吸光度值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為X軸，吸光度值為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相應(yīng)的，根據(jù)每個(gè)樣品吸光度值即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本中septin9的含量。

本發(fā)明標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制也可以采用雙對(duì)數(shù)法，以樣品濃度值的對(duì)數(shù)為X軸，以吸光度值的對(duì)數(shù)Y為軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，相應(yīng)的，根據(jù)每個(gè)樣品吸光度值的對(duì)數(shù)即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本中septin9濃度值的對(duì)數(shù)，進(jìn)而獲得其實(shí)際濃度。

上述septin9酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒與目前通常使用的同類檢測(cè)試劑盒相比，具有明顯的優(yōu)勢(shì)。首先，免疫反應(yīng)由兩步變?yōu)橐徊剑s短了免疫結(jié)合的時(shí)間由1h降低為0.5h。其次，HRP或ALP直接標(biāo)記septin9抗體，由間接法變?yōu)橹苯臃?，省掉了二抗，降低了生產(chǎn)成本和操作難度。最后，采用單克隆抗體包被微孔板，提高了靈敏度，線性范圍大于同類試劑盒，精密度和準(zhǔn)確度均在試劑盒要求范圍內(nèi)。血清樣本不需稀釋，尿液樣本不需處理即可直接加樣，操作方法比同類試劑盒簡(jiǎn)單，一般技術(shù)人員即可操作。

附圖說明

圖1：septin9的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1試劑盒制備

1 septin9酶標(biāo)單抗制備

采用改良過碘酸鈉法。以標(biāo)記20mg單抗為例：準(zhǔn)確稱取HRP 40mg，加入0.2M pH5.6醋酸緩沖液2ml，溶解后加入0.06MNaIO₄溶液2ml，室溫反應(yīng)20min。加入0.16M乙二醇-10％NaCl溶液2ml，室溫反應(yīng)20min，將酶液裝入透析袋中，對(duì)0.001M pH4.0醋酸鹽緩沖液透析過夜；加入2M pH 9.6碳酸鹽緩沖液0.8ml，加入septin9特異性單抗II20mg，4℃攪拌反應(yīng)2h；加入新配制的5mg/ml NaBH4溶液0.4ml，4℃攪拌反應(yīng)2h；滴加飽和硫酸銨溶液9.2ml，4℃攪拌反應(yīng)30min，4℃3500rpm離心20min，棄上清，將沉淀溶于2ml 0.02M pH7.4的磷酸鹽緩沖液，用0.02M pH7.4的磷酸鹽緩沖液透析24h，加2ml甘油，混勻后-20℃保存。

2酶標(biāo)板制備

將septin9特異性抗體I用pH 9.6 0.02M碳酸鹽緩沖液稀釋，終濃度為5ug/ml。在96孔酶標(biāo)板中每孔加入100ul的包被液，2-8℃過夜。用PBST洗滌液洗滌4次，然后每孔加入200ul的封閉液(含BSA 1％，小牛血清20％，疊氮鈉0.05％的pH 7.4 0.1M磷酸鹽緩沖液)，放入37℃烘箱中2h，甩去封閉液，干燥后裝入鋁箔袋2-8℃保存。

3酶標(biāo)試劑配制

配制含有20％小牛血清、1％BSA的pH 7.4的0.02M磷酸鹽緩沖液，即為酶標(biāo)稀釋液，用酶標(biāo)稀釋液將實(shí)施例1中制備的septin9抗體酶復(fù)合物按照1∶1500稀釋，分裝后2-8℃保存。

4標(biāo)準(zhǔn)品配制

稱取一定量septin9標(biāo)準(zhǔn)品用空白血清稀釋成如下濃度0ng/ml，0.3ng/ml，0.9ng/ml，2.7ng/ml，8.1ng/ml，24.3ng/ml，分裝后2-8℃保存。

5顯色劑A、B，終止液，20X濃縮洗滌液

顯色液A為0.05％的過氧化脲溶液。

顯色液B為0.03％的TMB溶液。

20X濃縮洗滌液為0.2M PBST溶液。

終止液為2M硫酸溶液。

實(shí)施例2試劑盒檢測(cè)方法

1準(zhǔn)備：將試劑盒放置于室溫下平衡20min。

2配液：將50ml濃縮洗滌液(20X)用蒸餾水稀釋至1000ml備用。

3加樣：分別在相應(yīng)孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品50ul，震蕩混勻，然后加入50ul酶標(biāo)二抗，震蕩混勻。

4溫育：用封板膜封板，37℃溫育30min。

5洗滌：溫育后將封板膜揭掉，吸干孔內(nèi)液體，用稀釋好的洗滌液洗滌4次。

6顯色：每孔加入顯色劑A、B液個(gè)50ul，輕輕震蕩混勻，用封板膜封板后37℃溫育避光顯色15min。

7終止：每孔加入終止液50ul，輕輕震蕩混勻。

8測(cè)定：設(shè)定酶標(biāo)儀波長與450/630nm檢測(cè)，測(cè)定各孔0D值。

9繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為X軸，吸光度值為Y軸做標(biāo)準(zhǔn)曲線?；蛘咭詷?biāo)準(zhǔn)品濃度對(duì)數(shù)值為X軸，吸光度對(duì)數(shù)值為Y軸做標(biāo)準(zhǔn)曲線。以標(biāo)準(zhǔn)曲線R²≥0.98，且濃度最高標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值大于1.0為合格的標(biāo)準(zhǔn)曲線，否則重復(fù)步驟1-8。

實(shí)施例3試劑盒最低檢出限

本實(shí)施例檢測(cè)本發(fā)明試劑盒的檢出限。具體操作為：抽取一盒試劑盒，按照實(shí)施例2的方法檢測(cè)樣品稀釋液，重復(fù)檢測(cè)20次，計(jì)算檢測(cè)0D值的平均值(M)和標(biāo)準(zhǔn)差(SD)，計(jì)算M-2SD的值，將M-2SD對(duì)應(yīng)的吸光度值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算所得到的濃度值即為試劑盒檢出限，經(jīng)過驗(yàn)證本試劑盒的檢出限為0.01ng/ml。

實(shí)施例4試劑盒特異性

本實(shí)施例檢測(cè)本發(fā)明試劑盒的特異性。具體操作為：抽取一盒試劑盒，按照實(shí)施例2的方法檢測(cè)100ng/ml NAGL、100ng/mlC反應(yīng)蛋白、100ng/ml胱抑素 C，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)小于0.1ng/ml。

實(shí)施例5試劑盒重復(fù)性

本實(shí)施例檢測(cè)本發(fā)明試劑盒的重復(fù)性。具體操作為：抽取一盒試劑盒，按照實(shí)施例2的方法檢測(cè)濃度為1.0ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，重復(fù)檢測(cè)10次。計(jì)算測(cè)定結(jié)果的平均濃度和標(biāo)準(zhǔn)差(S)，按照公式(1)計(jì)算變異系數(shù)(CV)，CV應(yīng)不高于10％。

實(shí)施例6試劑盒的劑量-反應(yīng)曲線的線性

本實(shí)施例檢測(cè)本發(fā)明試劑盒的劑量-反應(yīng)曲線的線性。具體操作為：抽取一盒試劑盒，按照實(shí)施例2的方法檢測(cè)濃度為檢測(cè)濃度為0ng/ml，0.3ng/ml，0.9ng/ml，2.7ng/ml，8.1ng/ml，24.3ng/ml的septin9測(cè)定樣品液，每個(gè)濃度檢測(cè)2支，記錄各濃度水平的測(cè)量結(jié)果，并計(jì)算各濃度水平兩次測(cè)量值的平均值(y_i)，以濃度值(x_i)為自變量，以測(cè)定結(jié)果均值(y_i)為因變量求出線性回歸方程。按公式(2)計(jì)算線性回歸的相關(guān)系數(shù)(r)，r應(yīng)≥0.975。其中為5個(gè)濃度值的平均值；為測(cè)量值的平均值。

實(shí)施例7試劑盒穩(wěn)定性

本實(shí)施例檢測(cè)本發(fā)明試劑盒的穩(wěn)定性。具體操作為：將試劑盒2-8℃下放置1年，分別在第1、2、3、6、8、12、15個(gè)月檢測(cè)，其檢出限、特異性、重復(fù)性、劑量-反應(yīng)曲線的線性應(yīng)符合要求。